本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體來(lái)說(shuō)，是指一種用競(jìng)爭(zhēng)性等位特異性PCR(cPASA)技術(shù)檢測(cè)棉蚜種群煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)等位基因突變頻率的方法。

背景技術(shù)：

棉蚜是一種世界性棉花害蟲，繁殖快，危害重，其中化學(xué)防治是最有效的治理措施。新煙堿類殺蟲劑是防治棉蚜的一類高效藥劑，但是隨著新煙堿類殺蟲劑的大量使用，棉蚜對(duì)其產(chǎn)生了較高水平的抗藥性。因此，棉蚜對(duì)新煙堿類殺蟲劑抗性的研究迫在眉睫。

棉蚜對(duì)新煙堿類殺蟲劑抗性研究主要集中在代謝抗性和靶標(biāo)抗性，新煙堿類殺蟲劑的作用靶標(biāo)是煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)。研究表明，棉蚜對(duì)新煙堿類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的主要原因是nAChR的beta1亞基第81位氨基酸的突變(R81T)?；谶@一點(diǎn)，建立一種抗性分子檢測(cè)技術(shù)，快速檢測(cè)棉蚜種群該位點(diǎn)的突變頻率。在分子水平上，監(jiān)測(cè)棉蚜田間種群的抗性，為抗性治理提供理論指導(dǎo)。

本發(fā)明針對(duì)nAChR的beta1亞基的基因序列以及已知的突變位點(diǎn)，將下游引物的3’端與突變位點(diǎn)堿基配對(duì)，根據(jù)突變和未突變?cè)O(shè)計(jì)兩條特異性下游引物(3R/3S)，與共同的5’上游引物(cPASA-F)擴(kuò)增184bp大小的目的片段。鑒于該基因位點(diǎn)突變是G-C的突變，僅通過(guò)引物3’端一個(gè)堿基的錯(cuò)配區(qū)分不出突變和未突變，于是再設(shè)計(jì)一條可以與5’上游引物(cPASA-F)擴(kuò)增出586bp目的片段的下游引物(cPASA-X)，起到競(jìng)爭(zhēng)作用。因?yàn)楦?jìng)爭(zhēng)性下游引物cPASA-X與模板完全匹配，擴(kuò)增效率高于等位特異性引物(3R/3S)，同時(shí)提高了等位特異性引物(3R/3S)擴(kuò)增的特異性，從而能區(qū)分出突變和未突變個(gè)體。本發(fā)明提供的特異性引物對(duì)棉蚜nAChR beta1亞基氨基酸81位點(diǎn)(R81T)是否發(fā)生突變的檢測(cè)具有普遍應(yīng)用價(jià)值，可以廣泛的應(yīng)用與棉蚜種群nAChR beta1基因突變頻率的檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)4條特異性引物檢測(cè)棉蚜nAChR beta1基因242位點(diǎn)等位基因是否發(fā)生突變，以及是純合子還是雜合子。申請(qǐng)人將這四條引物分別命名為cPASA-F、cPASA-3R、cPASA-3S和cPASA-X。

具體的，本發(fā)明設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)的4條特異性引物的核苷酸序列如下：

通用上游引物cPASA-F序列為：5’ACGAGAAGCGTCTGGTTAG 3’。

特異性未突變下游引物cPASA-3S序列為5’TGATAGTCCCTCCATACAAGTC 3’。

特異性突變下游引物cPASA-3R序列為5’TGATAGTCCCTCCATACAAGTG 3’。

競(jìng)爭(zhēng)性下游引物cPASA-X序列為5’GTCCGTCTGGGTAGGTGA 3’。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：根據(jù)已公布的棉蚜nAChR beta1基因mRNA編碼區(qū)序列，應(yīng)用Primer Primer5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增包含beta1基因242位點(diǎn)的一段長(zhǎng)度為586bp目的序列的引物，再根據(jù)突變位點(diǎn)(G-C)，將特異性引物的3’端固定于突變位點(diǎn)處，且能與通用上游引物擴(kuò)增出單一目的條帶。這四條引物特異性高，擴(kuò)增效果好，能檢測(cè)出棉蚜beta1亞基氨基酸81位點(diǎn)是否發(fā)生突變，以及等位基因是純合子還是雜合子，進(jìn)而檢測(cè)棉蚜種群等位基因突變頻率。

附圖說(shuō)明

圖1實(shí)施例1中設(shè)計(jì)的4條cPASA擴(kuò)增引物；

圖2實(shí)施例1中以3R和3S引物方案進(jìn)行cPASA擴(kuò)增區(qū)分突變位點(diǎn)R81T基因分型的電泳圖。

具體實(shí)施方式

根據(jù)已公布的棉蚜nAChR beta1基因mRNA編碼區(qū)序列，以及已經(jīng)報(bào)道的242位點(diǎn)的突變(G-C)，應(yīng)用Primer Primer5.0軟件設(shè)計(jì)包含該突變位點(diǎn)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為586bp的一對(duì)引物，并且根據(jù)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)可以區(qū)分突變和未突變的兩條等位特異性下游引物，這兩條引物除3’端為突變堿基外，其他的堿基均相同。應(yīng)用下述步驟檢測(cè)棉蚜種群nAChR beta1基因的突變頻率。

1.RNA的提取

(1)取單頭棉蚜放入1.5mL離心管中。

(2)先加入100μL裂解液，用組織研磨器研磨，然后補(bǔ)足350μL裂解液。

(3)向上一步研磨液中加入350μL 70％乙醇，充分混勻(移液吸打，勿離心)。

(4)將700μL樣品(包含全部沉淀)，轉(zhuǎn)入吸附柱中，10000rpm離心15s，棄去濾液。

(5)加入700μL RW1緩沖液到吸附柱中，10000rpm離心15s，棄濾液。離心后小心移出柱子，確保不接觸棄液。

(6)加500μL RPE緩沖液到柱內(nèi)，10000rpm離心15s，棄濾液。

(7)再加500μL RPE緩沖液到柱內(nèi)，10000rpm離心2min，棄濾液。將吸附柱放入一個(gè)新的2mL收集管中，蓋好蓋子，再10000rpm離心1min

(8)將吸附柱放入一個(gè)新的1.5mL離心管中。直接向吸附柱中間膜部位懸空加入30-50μL RNase-free水。蓋好蓋子10000rpm離心1min，洗滌RNA。

2.反轉(zhuǎn)錄，得到cDNA

(1)基因組DNA的除去反應(yīng)

將10μL體系，42℃孵育2min。

(2)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

將上述20μL體系，按如下程序反應(yīng)：37℃15min，85℃5s。

3.PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系如下：10×PCR Buffer(Mg²⁺Plus)2.5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)2μL，通用上游引物(cPASA-F)、競(jìng)爭(zhēng)性下游引物(cPASA-X)、特異性下游引物cPASA-3R或者cPASA-3S各1μL，Taq DNA聚合酶0.3μL，模板DNA 2μL，總體積25μL。

擴(kuò)增條件如下：

94℃4min；94℃30s，55℃30s，72℃40s，35個(gè)循環(huán)；72℃7min。

3.PCR產(chǎn)物檢測(cè)

取5μLPCR產(chǎn)物用2％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳緩沖液為1×TAE，150V恒壓電泳20min。用紫外凝膠成像系統(tǒng)鑒定PCR產(chǎn)物條帶大小。

4.種群等位基因突變頻率檢測(cè)

從田間采回3-4個(gè)棉蚜種群，每個(gè)種群挑取50-100頭棉蚜，用上述方法對(duì)其等位基因進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)敏感等位基因頻率(％)＝(敏感純合子個(gè)數(shù)×2+抗性雜合子個(gè)數(shù))÷2÷總個(gè)體數(shù)×100；R81T突變等位基因 頻率(％)＝(抗性純合子個(gè)數(shù)×2+抗性雜合子個(gè)數(shù))÷2÷總個(gè)體數(shù)×100，獲得種群突變頻率。