本發(fā)明屬于醫(yī)學分子生物學領(lǐng)域，具體涉及幽門螺桿菌gyrA基因突變檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術(shù)：
：自1983年幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori，Hp)首次被發(fā)現(xiàn)以來，其根除治療已成為全球臨床治療的一個難題，據(jù)統(tǒng)計全世界人群中幽門螺旋桿菌感染率達50％，我國的感染率高達60％-90％。幽門螺旋桿菌感染可導致多種疾病，如慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴組織組織(mucosa-associatedlymphoidtissuelymphoma，MALT)淋巴瘤，另外幽門螺旋桿菌感染還是心血管疾病、不明原因的缺鐵性貧血和慢性特發(fā)性血小板減少性紫癜的獨立危險因素。因此，對于這類疾病的患者，根除幽門螺旋桿菌刻不容緩。目前全球推薦的幽門螺旋桿菌根除的一線標準治療方案是質(zhì)子泵抑制劑聯(lián)合兩種抗生素的三聯(lián)療法，常用的抗生素主要是甲硝唑、克拉霉素、阿莫西林、喹諾酮、呋喃唑酮、四環(huán)素。但治療現(xiàn)狀不容樂觀，隨著時間的變遷，幽門螺旋桿菌的根除失敗率逐年增高，由最初的大于90％的根除率到近期的70％左右甚至有些低于60％。而現(xiàn)有的資料表明，幽門螺旋桿菌的耐藥性是導致根除失敗的主要原因。中華醫(yī)學會消化病學分會H.pylori學組和H.pylori科研協(xié)作組于2005年3月～2006年5月完成了一項涉及全國16個省市的流行病學調(diào)查和耐藥原因分析顯示，我國幽門螺旋桿菌對抗生素的耐藥率為：甲硝唑50％～100％(平均73.3％)，克拉霉素0～40％(平均23.9％)，阿莫西林0～2.7％，喹諾酮類0～26.6％，呋喃唑酮0～45.9％。分析其原因主要在于幽門螺旋桿菌培養(yǎng)周期長且難培養(yǎng)，難以在臨床實踐中常規(guī)開展幽門螺旋桿菌的藥敏試驗，進而無法指導臨床醫(yī)生合理應用抗生素。幽門螺旋桿菌抗生素耐藥機制較為復雜，主要與抗生素作用靶點相關(guān)基因突變有關(guān)，同時外排泵和孔道蛋白等改變亦會影響抗生素敏感性。幽門螺旋桿菌喹諾酮類抗生素耐藥主要與gyrA基因87和91密碼子突變有關(guān)，并且攜帶兩個或以上突變的菌株耐藥性一般高于單個突變菌株，其它gyrA基因突變和gyrB基因突變單獨并不導致耐藥，但可增強87和91密碼子突變的耐藥作用。檢測分析患者幽門螺桿菌gyrA耐藥突變位點，能夠在短時間內(nèi)迅速的得到患者喹諾酮類抗生素耐藥情況，有助于臨床醫(yī)師采取正確的治療手段，提高幽門螺桿菌的根除率。用于gyrA基因突變檢測的方法很多，包括如測序、焦磷酸測序(Pyrosequencing)、變性高效液相色譜法(HDPLC)、高分辨率溶解曲線技術(shù)(HRM)、限制性片段長度多態(tài)性分析法(RFLP)等。其中測序為突變檢測的金標準。該方法存在以下缺點：敏感性較低，如果突變基因的含量占基因組DNA總量的10％以下時，則用直接測序法檢測不到突變樣本的存在；費時，操作過程復雜，對操作人員要求高；非閉管操作，涉及到PCR擴增后的操作，因此易被污染；測序結(jié)果的判讀主觀性強；通量低。因此直接測序法難以在臨床普遍開展。本試劑盒采用引物增敏的擴增阻礙突變系統(tǒng)(amplificationrefractorymutationsystem，ARMS)結(jié)合熒光PCR技術(shù)針對gyrA基因突變區(qū)特異性擴增相應突變模板DNA。檢測敏感性高，與突變檢測“金標準”直接測序的結(jié)果符合率≥95％。此外本方法還具有快速，操作簡單，閉管反應污染少等優(yōu)點，適于在臨床中普遍開展?；谏鲜鰞?nèi)容，本方法用于用于幽門螺桿菌gyrA基因87和91密碼子突變的檢測，檢測結(jié)果可用于指導幽門螺桿菌的根除治療。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種幽門螺桿菌gyrA基因突變檢測試劑盒，能有效地檢測幽門螺桿菌gyrA基因耐藥突變，使臨床醫(yī)生能獲知患者幽門螺桿菌喹諾酮類抗生素耐藥情況，有助于臨床醫(yī)生采取正確的治療手段，提高幽門螺桿菌的根除率。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)：在本發(fā)明的一個方面，提供了一種幽門螺桿菌gyrA突變檢測試劑盒，包括基因擴增試劑、引物和探針，所述探針與待測的gyrA突變的核苷酸序列和/或其互補序列進行雜交。本方法結(jié)合了PCR的高度靈敏度和熒光探針的高精確性等有點，具有操作簡單，結(jié)果直觀和無污染的特點。本方法設(shè)計一種使用特異性探針的檢測方法，本方法在同一個PCR反應中進行g(shù)yrA耐藥突變的檢測，利用熒光定量PCR儀和熒光探針的簡便性和高靈敏度讀取結(jié)果，判讀所檢測的樣本中是否存在gyrA基因87和91密碼子突變。為達到上述目的，采取的技術(shù)方案：1.使用商業(yè)化的試劑盒對組織中的DNA進行提取和純化；該步驟中，對DNA的提取和純化使用DNA聚合酶，具體地為TaqDNA聚合酶，所述TaqDNA聚合酶為無核酸外切酶活性；具體包括5’核酸外切酶活性和3’核酸外切酶活性；2.根據(jù)本方法的特點設(shè)計引物和探針，其中探針的處理方法如表1所示；在該步驟中，所述引物包括正向引物、反向引物；具體的，所述引物為SEQIDNO：1～2he6～7所示序列的核苷酸鏈或其互補鏈；所述探針包括通用探針、分型探針和內(nèi)參探針，其中，所述通用探針為SEQIDNO：3所示序列的核苷酸鏈或其互補鏈；所述分型探針為SEQIDNO：4和5所示序列的核苷酸鏈或其互補鏈；所述通用探針3’端使用BHQ標記；所述分型探針5’端使用FAM或TET標記，3’端最后一個核苷酸進行磷酸化處理；所述內(nèi)參探針3’端使用BHQ標記，5’端使用FAM或TET標記；所述探針全部處于引物的內(nèi)部，并且無重疊的序列。所使用的分型探針位于通用探針下游第1個核苷酸位置開始；表111.3.PCR反應條件為：95℃預變性10分鐘，95℃15秒，58℃40秒，擴增反應40循環(huán)，在60℃40秒階段收集熒光；PCR擴增的過程中PCR循環(huán)時的退火溫度應該低于引物的Tm值；12.4.根據(jù)△Ct值對樣本中是否存在gyrA基因87和91密碼子突變進行判斷；在該步驟中，對有效擴增的情況下，樣品檢測結(jié)果可信，否則試驗需要重復；在檢測中的陽性對照為有效擴增時，樣本結(jié)果判斷標準如下：△Ct值(受檢標本Ct值-內(nèi)參Ct值)≤12為陽性。附圖說明圖1為熒光定量PCR擴增曲線圖具體實施方式下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進一步說明。檢測疑似具有g(shù)yrA基因87和91密碼子突變的胃粘膜組織樣本、糞便或培養(yǎng)的幽門螺桿菌樣本。1.設(shè)計合成如表1的引物探針。其中RnaseP為內(nèi)參基因。表12.DNA提取：使用商業(yè)化的試劑盒對組織中的DNA進行提取和純化。3.擴增3.1PCR擴增體系按照以下方法配置PCR反應液。組份體積2×PCRBuffer10ulgyrA引物1ul16SrDNA引物1ul內(nèi)參探針0.5ul通用探針1ul87密碼子探針0.5ul91密碼子探針0.5ulTaq酶1ulH2O5ulDNA模板4.5ul共計25ul3.2PCR擴增程序按照以下方法進行PCR擴增PCR反應條件為：95℃預變性10分鐘，95℃15秒，58℃40秒，擴增反應40循環(huán)，在60℃40秒階段收集熒光。4.結(jié)果分析參照附圖，根據(jù)△Ct值(受檢標本Ct值-內(nèi)參Ct值)判斷樣本中是否存在gyrA基因87和91密碼子突變?！鰿t值≤12為陽性。例如，內(nèi)參和陽性對照擴增曲線Ct值較小，用于監(jiān)控檢測體系。如內(nèi)參和陽性對照擴增曲線均正常，而受檢樣本無gyrA基因擴增曲線，，則表明樣本中無gyrA基因87和91密碼子突變。附圖中，受檢樣本出現(xiàn)gyrA基因擴增曲線(△Ct值＝10)，則表明樣本中存在gyrA基因87和91密碼子突變。如內(nèi)參或陽性對照無擴增曲線，需排除操作、試劑盒或樣本問題后，重新進行實驗。本發(fā)明不局限于上述具體的實施方式，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員從上述構(gòu)思出發(fā)，不經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動，所作出的種種變換，均落在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當前第1頁1 2 3