本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體地說，本發(fā)明涉及一種與油菜粒重相關(guān)基因ARF18及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著人口的快速增長(zhǎng)，全球食物短缺問題變得越來越嚴(yán)重。因此，在作物產(chǎn)量方面急需突破。作為影響作物產(chǎn)量的三因素之一，粒重已經(jīng)被廣泛認(rèn)為是多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀。對(duì)粒重性狀的遺傳和分子機(jī)制的解析對(duì)于提高作物育種效率非常重要。

種子大小受到一系列細(xì)胞過程的影響。這種影響來源于雙親效應(yīng)和母體/合子組織(Fang et al.,2012)。在模式植物擬南芥中，一些突變體如ap2、arf2、da1、eod3、ttg2、klu等主要通過調(diào)控種皮的細(xì)胞延伸來控制種子大小(Fang et al.,2012；Ohto et al.,2005；Schruff et al.,2006；Garcia et al.,2005；Adamski et al.,2009)，而在mini3、iku1、iku2和shb1突變體中，胚乳在種子發(fā)育早期過早細(xì)胞化或增值影響了種子大小(Garcia et al.,2003；Luo et al.,2005；Wang et al.,2010；Zhou et al.,2009；Kang et al.,2013).met1基因由于CG背景中胞嘧啶殘基甲基化的缺失導(dǎo)致對(duì)種子大小具有雙親效應(yīng)(Feng et al.,2010)。在水稻中，已鑒定出47個(gè)籽粒長(zhǎng)度QTLs和48個(gè)籽粒寬度QTLs(Bao,2014)，一些調(diào)控籽粒大小的基因如GW2、GIF1、qSW5、GS3、GS5、GW8和qGL3被定位(Song et al.,2007；Wang et al.,2008；Shomura et al.,2008；Weng et al.,2008；Mao et al.,2010；Li et al.,2011；Wang et al.,2012；Zhang et al.,2012)。其中，GW2和qSW5通過調(diào)節(jié)外穎殼細(xì)胞數(shù)目影響粒重，而其它基因則是直接調(diào)節(jié)籽粒細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞大小來影響粒重。盡管粒重研究取得不錯(cuò)進(jìn)展，目前在多倍體油菜中仍沒有發(fā)現(xiàn)調(diào)控粒重的新基因。

多倍體是由單倍體多倍化或者兩個(gè)或更多多樣性基因組的組合，后者是在開花植物包括許多重要農(nóng)作物中普遍存在的(Masterson,1994)。多倍體基因組由于不同染色體上同源序列的存在和同源基因的互作使得QTL定位更加困難。如甘藍(lán)型油菜(AACC)，世界上繼大豆之后的第二大油料作物，是由白菜和甘藍(lán)兩個(gè)祖先種自然雜交而來。白菜為A基因組。A基因組與甘藍(lán)的C基因組相似度非常高(Rana et al.,2004)。最近幾年，作為全球重要的農(nóng)業(yè)作物，油菜受到越來越多的關(guān)注。目前為止，盡管有80多個(gè)粒重相關(guān)的QTL被鑒定出來，具體調(diào)控基因尚未見報(bào)道(Quijada et al.,2006；Udall et al.,2006；Fan et al.,2010；Yang et al.,2012)。

我們前期的研究中，利用zy72360和R1構(gòu)建的F2分離群體檢測(cè)到一個(gè)位于A9染色體上的粒重主效QTL，其貢獻(xiàn)率超過30％。在本發(fā)明中，我們通過構(gòu)建近等基因系和資源群體關(guān)聯(lián)分析圖位克隆了A9位點(diǎn)的粒重調(diào)控基因。其中，ARF18作為調(diào)控粒重的候選基因，利 用模式植物擬南芥和油菜作了進(jìn)一步的功能分析。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是在于提供了一種與油菜粒重相關(guān)基因ARF18，其序列為SEQ ID NO：2所示。編碼的蛋白質(zhì)為SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種與油菜粒重相關(guān)基因ARF18在提高植物粒重性狀中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施：

一種與油菜粒重相關(guān)基因ARF18，通過以下方式得到：

1.粒重主效QTL位點(diǎn)的近等基因系構(gòu)建

親本zy72360和R1在粒重性狀方面具有顯著差異。通過F2群體對(duì)粒重性狀QTL進(jìn)行初定位。利用雜種F1和親本連續(xù)回交4次，期間利用QTL連鎖標(biāo)記結(jié)合表型進(jìn)行遺傳前景的選擇，同時(shí)利用非連鎖標(biāo)記進(jìn)行遺傳背景的評(píng)估，從BC4F1群體中獲得目標(biāo)QTL雜合且遺傳背景回復(fù)率高的QTL-NIL單株；利用BC4F1代雜合目標(biāo)QTL-NIL單株自交獲得BC4F2代QTL-NIL分離群體。

2.粒重主效QTL位點(diǎn)的精細(xì)定位

基于該區(qū)間新開發(fā)的引物，我們利用近等基因系BC4F2群體縮短區(qū)間。根據(jù)區(qū)間內(nèi)的SNP信息，通過PCR擴(kuò)增繼續(xù)縮短區(qū)間.為了進(jìn)一步縮短QTL區(qū)間的距離，利用380份資源群體，開發(fā)并篩選獲得區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記引物進(jìn)行粒重表型和基因型之間的關(guān)聯(lián)分析。根據(jù)連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析，我們最終將該區(qū)間定位至50kb以內(nèi)并在該區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)7個(gè)基因。

3.確定突變位點(diǎn)，獲得候選基因

根據(jù)油菜基因組序列，我們利用zy72360和R1材料克隆了上述7個(gè)基因的編碼區(qū)和上游調(diào)控區(qū)，序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)其中4個(gè)基因存在SNP和In/Del。其中ARF18基因的變異最大，將其列為調(diào)控粒重主效QTL位點(diǎn)的候選基因。

4.ARF18基因的功能驗(yàn)證

利用模式植物擬南芥為受體，超量表達(dá)ARF18及其等位基因驗(yàn)證其功能。構(gòu)建超表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，將超表達(dá)載體導(dǎo)入擬南芥中，最后每個(gè)基因獲得超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系約30株。獲得轉(zhuǎn)基因材料的純合株系，考察粒重表型，最終發(fā)現(xiàn)ARF18(SEQ ID NO.2所示)的過量表達(dá)可以降低種子重量。通過對(duì)該基因的擬南芥同源基因突變體表型的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)突變體材料的種子粒重增加。這表明ARF18的表達(dá)水平高低可以調(diào)控植物種子的重量。

最終獲得了一種與油菜粒重相關(guān)基因ARF18，其序列為SEQ ID NO.2所示。

一種與油菜粒重相關(guān)基因ARF18在提高油菜粒重性狀中的應(yīng)用，包括通過生物技術(shù)，將油菜中ARF18基因的表達(dá)進(jìn)行抑制，獲得的轉(zhuǎn)基因植物的種子粒重增加。

本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容還包括，與SEQ ID NO.3所示蛋白質(zhì)同源的植物蛋白質(zhì)在提高植物粒重性狀中的應(yīng)用，即將植物中與SEQ ID NO.3所示蛋白質(zhì)同源的植物蛋白質(zhì)的表達(dá)進(jìn)行抑制，獲得的轉(zhuǎn)基因植物的種子粒重增加。

本發(fā)明中所用的術(shù)語“轉(zhuǎn)基因植物”是指含有導(dǎo)入的基因并能夠穩(wěn)定地增強(qiáng)或抑制所導(dǎo)入的基因表達(dá)并產(chǎn)生具有特定的生物學(xué)性狀的植物。本發(fā)明中所提到的植物包括水稻、小麥、玉米等糧食作物，也包括油菜、大豆、棉花等經(jīng)濟(jì)作物，還包括夏季生長(zhǎng)的黃瓜、番茄等蔬菜作物，還包括擬南芥。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

目前油菜中尚未定位到粒重調(diào)控相關(guān)基因，本發(fā)明通過圖位克隆的ARF18基因能夠控制油菜粒重，這對(duì)植物粒重調(diào)控的分子機(jī)理研究將有極大的推動(dòng)作用。雖然在擬南芥中ARF18的基因序列已被公開，但并不清楚其具體的生物學(xué)功能，本發(fā)明克隆的油菜ARF18基因?qū)τ筒肆Ｖ赜酗@著的調(diào)控作用，這對(duì)闡明ARF18基因的生物學(xué)功能有重要意義。通過基因工程技術(shù)提高或減弱ARF18基因的表達(dá)量能夠調(diào)控油菜種子的大小，從而有利于產(chǎn)量三因素的之間的平衡進(jìn)而達(dá)到增產(chǎn)的目的。

附圖說明

圖1兩親本zy72360和R1的粒重表型分析。

圖2近等基因系連鎖分析將粒重QTL區(qū)間縮短至120kb。

圖3資源群體關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該QTL區(qū)間部分標(biāo)記與粒重性狀極顯著相關(guān)。

圖4zy72360和R1材料中ARF18基因的序列差異比較。

圖5來自R1材料中的ARF18在擬南芥中的過量表達(dá)降低種子重量，而來自zy72360中的基因過量表達(dá)沒有導(dǎo)致種子發(fā)生顯著改變。

圖6擬南芥ARF18突變體種子重量增加。

圖7ARF18RNAi的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化R1導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因株系的種子粒重增加。

具體實(shí)施方式

通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)，或Draper等人(Blackwell科學(xué)出版社,1988)所述的條件，或按照所用試劑制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1：

粒重主效QTL位點(diǎn)的近等基因系構(gòu)建

親本甘藍(lán)型油菜zy72360和R1(Hu Z,Hua W,Huang S,Yang H,Zhan G,Wang X,et al.(2012)Discovery of Pod Shatter-Resistant Associated SNPs by Deep Sequen cing of a Representative Library Followed by Bulk Segregant Analysis in Rapesee d.PLoS ONE 7(4):e34253.)在粒重性狀方面具有顯著差異(zy72360為5.53±0.43g，R1為3.98±0.51g)(圖1)。首先，我們通過F2群體將SW QTL定位到W236和W239之間。利用雜種F1和親本連續(xù)回交4次，期間利用QTL連鎖標(biāo)記結(jié)合表型進(jìn)行遺傳前景的選擇，同時(shí)利用非連鎖標(biāo)記進(jìn)行遺傳背景的評(píng)估，從BC4F1群體中獲得目標(biāo)QTL雜合且遺傳背景回復(fù)率高的QTL-NIL單株；利用BC4F1代雜合目標(biāo)QTL-NIL單株自交獲得BC4F2代QTL-NIL分離群體。田間種植該群體，最終獲得3800個(gè)單株。

實(shí)施例2：粒重主效QTL位點(diǎn)的精細(xì)定位

基于該區(qū)間新開發(fā)的引物，我們利用近等基因系BC4F2群體，將該區(qū)間縮短至W024和W004之間的147kb。利用147kb以內(nèi)的SNP信息，通過PCR擴(kuò)增將區(qū)間繼續(xù)縮短至120kb(圖2).為了進(jìn)一步縮短QTL區(qū)間的距離，利用380份資源群體，開發(fā)并篩選獲得11個(gè)QTL區(qū)間內(nèi)的標(biāo)記引物進(jìn)行粒重表型和基因型之間的關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果顯示位于SSR-72and SSR-89之間的標(biāo)記顯示顯著的關(guān)聯(lián)性(圖3)。根據(jù)連鎖分析和關(guān)聯(lián)分析，我們最終將該區(qū)間定位至50kb以內(nèi)。

實(shí)施例3：

確定突變位點(diǎn)，獲得候選基因

根據(jù)油菜基因組序列，設(shè)計(jì)跨基因上游調(diào)控區(qū)和基因區(qū)的兩側(cè)引物以及可擴(kuò)增cDNA文庫(kù)的基因編碼區(qū)引物，用于從油菜中擴(kuò)增候選基因的對(duì)應(yīng)序列。

3.1油菜基因組DNA和總RNA的提取

DNA的提?。?/p>

A.70％(體積比)乙醇擦洗葉片，稱取大約100mg

B.加入600ul抽提緩沖液(0.2M Tris－Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH 7.5)，室溫快速研磨。

C.1.5ml Ependorff管中渦旋混勻5-10s。

D.12000rpm，25min，室溫。取上清，加等體積異丙醇，－20攝氏度沉淀過夜。

E.12000rpm，15min，室溫。加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀。

F.12000rpm，15min，室溫。去乙醇。倒置于紙巾上，待乙醇揮發(fā)干凈。

G.加無菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度計(jì)測(cè)定或電泳估測(cè)其濃度。

RNA的提取(TRIZOL TM Kit提取RNA)

液氮研磨100mg材料

A.加1mlTRIZOL,室溫(20-25℃，下同)放置5min。

B.加入200ul氯仿，劇烈振蕩30s，室溫放置2min。

C.12000g，15min，4℃,取上清至新管中，加入500ul異丙醇，混勻后室溫放置15min。

D.12000g，15min，4℃,去上清，加入1ml70％(無水酒精與H2O的體積比)乙醇。

E.7500g，7min，4℃,去上清，空氣干燥。

F.DEPC－H₂O溶解。

3.2基因組序列的擴(kuò)增

以zy72360和R1的基因組DNA為模板，擴(kuò)增7個(gè)基因的上游啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)和基因組序列。PCR反應(yīng)時(shí)間和溫度作如下：94℃3min，94℃45s，59℃45s，72℃2min 30s，30cycles，72℃5min。

3.3基因編碼區(qū)的擴(kuò)增

對(duì)于編碼區(qū)的擴(kuò)增，首先，利用zy72360和R1的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。cDNA第一鏈的反轉(zhuǎn)錄采用RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas)，操作參照所用試劑盒說明進(jìn)行。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)時(shí)間和溫度作如下：94℃3min，94℃45s，59℃45s，72℃2min 30s，30cycles，72℃5min。

3.4上述獲得的擴(kuò)增序列在兩親本間進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)ARF18的編碼區(qū)存在較大差異(zy72360中丟失了一個(gè)外顯子)(圖4)，因此將其列為候選基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證。

實(shí)施例4：候選基因的功能驗(yàn)證

4.1表達(dá)載體的構(gòu)建及擬南芥的轉(zhuǎn)化

將ARF18(SEQ ID NO.2所示)及其等位基因(SEQ ID NO.1所示)的編碼區(qū)序列與TOPO入門載體(invitrogen公司)連接后，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α(invitrogen公司)中，壯觀酶素篩選，載體引物(T7引物)與基因引物(基因上游引物)擴(kuò)增鑒定正向插入克隆，質(zhì)粒經(jīng)小量制備后與Pearleygate100(invitrogen公司)進(jìn)行重組，并轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，卡那霉素篩選，其插入片段經(jīng)載體引物(35S啟動(dòng)字序列引物)與基因引物(基因下游引物)PCR鑒定。

擬南芥的轉(zhuǎn)化過程：

試劑配制

滲透培養(yǎng)基(1L)：1/2xMurashige-Skoog；5％(質(zhì)量比)蔗糖；0.5克MES；用KOH調(diào)至pH5.7；再加：10微升1mg/ml的6-BA母液；200微升Silwet L-77

轉(zhuǎn)化步驟

(1)制備好已轉(zhuǎn)化了相應(yīng)質(zhì)粒的農(nóng)桿菌(根癌農(nóng)桿菌GV3101)菌液10ml，在轉(zhuǎn)化前一天晚上，轉(zhuǎn)入大瓶培養(yǎng)過夜，第二天取出使用時(shí)農(nóng)桿菌液O.D600當(dāng)在1.2到1.6之間。

(2)室溫5000rpm離心15分鐘。

(3)棄上清，將農(nóng)桿菌沉淀懸浮于相應(yīng)體積的滲透培養(yǎng)基里，使O.D600在0.8左右。

(4)將整個(gè)植株直接浸泡至農(nóng)桿菌懸浮液30s。

(5)避光培養(yǎng)過夜，然后正常培養(yǎng)至結(jié)子。

4.2轉(zhuǎn)基因擬南芥的篩選和驗(yàn)證

轉(zhuǎn)化子的篩選

將春化過的擬南芥種子種于澆過飽和PNS營(yíng)養(yǎng)液的人工土中，并用保鮮膜罩上。兩天后人工模擬自然條件光照(光照16小時(shí)，暗8小時(shí))，三天后揭膜。

人工培養(yǎng)室條件：相對(duì)濕度80％，恒溫20-240C，光照強(qiáng)度80-200umol/M2/S，光照周期為8h黑暗﹑16h光照培養(yǎng)。一周左右，噴除草劑篩選陽性植株。

PCR鑒定

(1)用于PCR的轉(zhuǎn)化植株總DNA的提取

A.70％(體積比)乙醇擦洗葉片，稱取大約100mg

B.加入600ul抽提緩沖液(0.2M Tris－Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH 7.5)，室溫快速研磨。

C.1.5ml Ependorff管中渦旋混勻5-10s。

D.12000rpm，25min，室溫。取上清，加等體積異丙醇，－20攝氏度沉淀過夜。

E.12000rpm，15min，室溫。加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀。

F.12000rpm，15min，室溫。去乙醇。倒置于紙巾上，待乙醇揮發(fā)干凈。

G.加無菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度計(jì)測(cè)定或電泳估測(cè)其濃度。

H.以總DNA為模板，進(jìn)行PCR。

(2)PCR程序

PCR反應(yīng)利用植物表達(dá)載體中35S啟動(dòng)子序列和基因下游引物[5’-TCAGCCAGAGATCTGGATAG-3’]，反應(yīng)的時(shí)間和溫度作如下：

94℃3min

94℃45s，

59℃45s

72℃2min 30s，30cycles

72℃5min

檢測(cè)結(jié)果顯示，大多數(shù)轉(zhuǎn)化植株均能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的電泳條帶，而陰性對(duì)照則沒有，表明轉(zhuǎn)基因擬南芥基因組中已經(jīng)含有外源基因DNA片段。

4.3轉(zhuǎn)基因株系的表型考察

對(duì)轉(zhuǎn)基因材料的純合株系進(jìn)行粒重表型的考察，發(fā)現(xiàn)過量表達(dá)來自R1材料中的ARF18 降低了部分轉(zhuǎn)基因株系的種子重量，降低幅度在10％左右(圖5)，而過量表達(dá)來自zy72360材料中的ARF18則基本與野生型對(duì)照一致，種子重量沒有明顯變化。

通過對(duì)該基因的擬南芥同源基因缺失突變株(商業(yè)來源:https://www.arabidopsis.org/)表型的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)突變體材料的種子粒重增加(圖6)。這表明ARF18的表達(dá)水平高低可以調(diào)控植物種子的重量。

實(shí)施例5：

油菜ARF18抑制表達(dá)載體的構(gòu)建及在油菜中的轉(zhuǎn)化

5.1CaMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ARF18反義RNA表達(dá)的載體構(gòu)建

根據(jù)R1材料的ARF18編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增部分編碼區(qū)片段(300bp)引物序列為：ARF18RNAiF：5‘-atggcgaatgtagatggagatga-3’，ARF18RNAiR：5‘-tgaagtctacgctcagatcacat/atgtgatctgagcgtagacttca-3’。將其反向連接到topo載體上并重組到pEarleyGate100中。將載體轉(zhuǎn)化到LBA4404中準(zhǔn)備轉(zhuǎn)化油菜。

5.2油菜的農(nóng)桿菌LBA4404轉(zhuǎn)化

A.無菌苗的準(zhǔn)備：種子經(jīng)70％乙醇1min，氯化汞(HgCl2)浸泡13-15min，ddH2O洗5次后，平鋪于MS培養(yǎng)基(PH 5.8)中，瓊脂濃度0.8％。油菜無菌苗備用。

B.油菜子葉柄轉(zhuǎn)化：接種根癌農(nóng)桿菌LBA4404于固體培養(yǎng)基LB上，兩天后挑取單菌落于50ml YEP液體培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g+酵母提取物10g+NaCl5g+MgSO40.5g)中培養(yǎng)。取4-5天無菌苗子葉柄，于菌液中浸泡5-8min，其間輕搖，而后倒去菌液，以無菌濾紙吸去外植體上殘留菌液。置于共培養(yǎng)基(MS+0.2mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-BA)+1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-D)+200um乙酰丁香酮(AS)，PH5.8)，上培養(yǎng)2-3天。

C.將共培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)入只含青霉素(Car)不含Kan的分化培養(yǎng)基中，黑暗條件的溫室中進(jìn)行脫菌與分化培養(yǎng)5-7天。再繼代在添加Kan篩選壓的選擇培養(yǎng)基(MS+3mg/L6-BA+0.1mg/Lα-萘乙酸(NAA)+5mg/L硝酸銀(AgNO3)+400mg/L Car+15mg/L Kan；pH5.8)中，進(jìn)行篩選，待分化出再生綠芽。

D.待再生芽長(zhǎng)至1cm時(shí)切取小芽移至生根培養(yǎng)基(MS+0.2mg/L NAA+10mg/L Kan+400mg/L Car；pH5.8)上,用加Car與Kan的固體MS培養(yǎng)基篩選。

E.苗生根后，移栽入室外。10天后移栽下土缽。

實(shí)施例6：轉(zhuǎn)化植株的鑒定

(1)用于PCR的轉(zhuǎn)化植株總DNA的提取

A.70％乙醇擦洗葉片，稱取大約100mg

B.加入600ul抽提緩沖液(0.2M Tris－Cl，0.25NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS，pH 7.5)，室溫快速研磨。

C.1.5ml Ependorff管中渦旋混勻5-10s。

D.12000rpm，25min，室溫。取上清，加等體積異丙醇，－20攝氏度沉淀過夜。

E.12000rpm，15min，室溫。加入70％乙醇200ul泡洗DNA沉淀。

F.12000rpm，15min，室溫。去乙醇。倒置于紙巾上，待乙醇揮發(fā)干凈。

G.加無菌水100ul溶解粗提DNA沉淀。用分光光度計(jì)測(cè)定或電泳估測(cè)其濃度。

H.以總DNA為模板，進(jìn)行PCR。

(2)PCR程序

PCR反應(yīng)體系的總體積為20μl，基因組DNA模板1ul(約50ng)、1×Taq酶反應(yīng)緩沖液、25mM MgCL2 1.2ul、2mM dNTP 1.5ul、10uM引物各0.2ul、50％甘油2ul、0.3單位rTaq酶(Takara公司),加ddH2O至20μl。依據(jù)植物表達(dá)載體中目的基因設(shè)計(jì)并合成跨內(nèi)含子的PCR引物。(正向引物：[5’-CACGTCTTCAAAGCAAGTGGA-3’]和反向引物[5’-atcagaaatatggtcagtcac-3’]，反應(yīng)的時(shí)間和溫度作如下：94℃3min，94℃45s，59℃45s，72℃2min 30s，30cycles，72℃5min。

檢測(cè)結(jié)果顯示，陽性對(duì)照和大多數(shù)轉(zhuǎn)化植株均能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的電泳條帶，而陰性對(duì)照則沒有，表明轉(zhuǎn)基因油菜基因組中已經(jīng)含有外源基因DNA片段。

實(shí)施例7：對(duì)T1代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行表型分析

油菜ARF18RNAi轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照完全成熟后收獲，油菜籽脫粒并充分曬干稱取千粒重。最終結(jié)果顯示，與非轉(zhuǎn)基因株系相比，部分轉(zhuǎn)基因株系種子重量增加，最大的增幅超過15％(圖7)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所

<120> 一種與油菜粒重相關(guān)基因ARF18及其應(yīng)用

<130> 一種與油菜粒重相關(guān)基因ARF18及其應(yīng)用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.1

<210> 1

<211> 1521

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggcgaatg tagatggaga tgattccaga agttctttcc caagttgtta tcaggatcag 60

ctgtacacag agctatggaa agcctgtgca ggtccattag tggaggttcc tcttgttgga 120

gagagagttt tctacttccc tcagggtcac atggaacaac ttgtggcctc aactaatcaa 180

ggaattgaat cagagaaaat acctgatttt aaacttcctc ccaagatact ctgtcaagtt 240

cttagtgtga tgctaaaggc agagcatgac acagatgaag tctacgctca gatcacatta 300

aaaccagagg aagatcaaag tgaaccaaca agtcttgatc caccaattgt tgaaccaaca 360

aagcaaatgt tccactcttt tgtaaagatt ctaacagctt cagacacaag cactcatgga 420

gggttctctg ttcttcgtaa acacgccact gaatgcttgc ctgccttgga catgacacaa 480

gctactccta ctcaagaact tgtgactaga gatcttcatg ggtttgagtg gaggtttaag 540

catattttca gaggacaacc taggaggcat ttgcttacta caggctggag tacctttgtt 600

tcctcaaaaa gacttgtagc tggagatgct tttgtgttct tgaggataag ccaattcata 660

gtaggtgtga acaagtatat ggaagctatg aagcatggtt tctctcttgg tacaagattc 720

aggatgaagt ttgaaggaga agagtctcct gagagaatat ttaccggtac tattgtggga 780

attggagatt tatcttcaca atggccagct tctacatgga gatcattgca ggtccaatgg 840

gatgagccaa caacagttca gagaccagac aaagtctcac catgggagat tgagcctttc 900

ttgccatctt ccccagcttc aacaccttct caacaatcac aacccaaaag caaaaggtca 960

aaacctgttg aatcatcaag tttgagtcca ggtcaagcta gtttcttagg cgtccaagct 1020

gagcctcctc ctcctcctcc tcctgcgagt agttgctata ggttgtttgg atttgatctc 1080

acaagcaatc ctccagctcc aatacctcca gacaagcaac cgatggatac ttctgaagct 1140

gccaagtgtc aagaccccat cactccaagc tcagttaatg agccaaagaa gcaacaaaca 1200

tcaaggactc gaaccaaagt gcaaatgcaa gggatagctg ttggtcgtgc ggtagattta 1260

acgctgttga aatcatatga tgaactgatt aaggagcttg aggagatgtt tgagatccaa 1320

ggacagcttc ttccccgaga taaatggatc gttgtcttca ctgatgatga aggtgacatg 1380

atgcttgctg gagatgatcc atggaatgag ttttgtaaga tggcgaagaa gatatttata 1440

tattcaagcg atgaggttaa gaaaatgaca aggagaatga agagttcttc ttcgttagag 1500

aatgaagcaa gcatggatta a 1521

<210> 2

<211> 1680

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggcgaatg tagatggaga tgattccaga agttctttcc caagttgtta tcaggatcag 60

ctgtacacag agctatggaa agcctgtgca ggtccattag tggaggttcc tcttgttgga 120

gaaagagttt tctacttccc tcagggtcac atggaacaac ttgtggcctc aactaatcaa 180

ggaattgaat cagagaaaat acctgatttt aaacttcctc ccaagatact ctgtcaagtt 240

cttagtgtga tgttaaaggc agagcatgac acagatgaag tctacgctca gatcacatta 300

aaaccagagg aagatcaaag tgaacctaca agtcttgatc caccaattgt tgaaccaaca 360

aagcaaatgt tccactcctt tgtaaagatt ctaaccgctt cagacacaag cactcatggt 420

ggattctctg ttcttcgtaa acacgccact gaatgcttgc ctgccttgga catgacacaa 480

gctattccta ctcaagaact tgtgactaga gatcttcatg ggtttgagtg gaggtttaag 540

catattttca gaggacaacc taggaggcat ttgcttacta caggctggag tacatttgtt 600

tcctcaaaaa gacttgtagc tggagatgct tttgtgttct tgaggggtga gaatggagat 660

ttaagagttg gagtgaggcg tttagctagg catcagaaca ccatgcctgc ttcagttatc 720

tctagtcaga gcatgcattt aggagtcctt gctacagctt ctcatgctgt gaacacccaa 780

actatgtttc ttgtgcttta caagcctagg ataagccaat tcatagtaag tgtgaacaag 840

tatatggaag ctatgaagca tggtttctct cttggtacaa gattcaggat gaggtttgaa 900

ggagaagagt ctcctgagag aatatttacc ggtactattg tgggaattgg agatttatct 960

tcacaatggc cagcttctac atggagatca ttgcaggtcc aatgggatga gccaacaaca 1020

gttcagagac cagacaaagt ctcaccatgg gagattgagc ctttcttgcc atcttcccca 1080

gcttcaacac cttctcaaca atcacaaccc aaaagcaaaa ggtcaaaacc cattgaatca 1140

tcaagtttga gtccaggtca agctagtttc ttaggcgtcc aagctgagcc tcctcctcct 1200

cctgcgagta gttgctatag gttgtttgga tttgatctca caagcaatcc tccagctcca 1260

atacctccag acaagcaacc gatggatact tctgaagctg ccaagtgtca agaccccatc 1320

actccaagct cagttaatga gccaaagaag caacaaacat caaggactcg aaccaaagtg 1380

caaatgcaag ggatagctgt tggtcgtgcg gtagatttaa cgctgttgaa atcatatgat 1440

gaactgatta aggagcttga ggagatgttt gagatccaag gacagcttct tccccgagat 1500

aaatggatcg ttgtcttcac tgatgatgaa ggtgacatga tgcttgctgg agatgatcca 1560

tggaatgagt tttgtaagat ggcgaagaag atatttatat attcaagcga tgaggttaag 1620

aaaatgacaa ggagaatgaa gagttcttct tcgttagaga atgaagcaag catggattaa 1680

<210> 3

<211> 559

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Asn Val Asp Gly Asp Asp Ser Arg Ser Ser Phe Pro Ser Cys

1 5 10 15

Tyr Gln Asp Gln Leu Tyr Thr Glu Leu Trp Lys Ala Cys Ala Gly Pro

20 25 30

Leu Val Glu Val Pro Leu Val Gly Glu Arg Val Phe Tyr Phe Pro Gln

35 40 45

Gly His Met Glu Gln Leu Val Ala Ser Thr Asn Gln Gly Ile Glu Ser

50 55 60

Glu Lys Ile Pro Asp Phe Lys Leu Pro Pro Lys Ile Leu Cys Gln Val

65 70 75 80

Leu Ser Val Met Leu Lys Ala Glu His Asp Thr Asp Glu Val Tyr Ala

85 90 95

Gln Ile Thr Leu Lys Pro Glu Glu Asp Gln Ser Glu Pro Thr Ser Leu

100 105 110

Asp Pro Pro Ile Val Glu Pro Thr Lys Gln Met Phe His Ser Phe Val

115 120 125

Lys Ile Leu Thr Ala Ser Asp Thr Ser Thr His Gly Gly Phe Ser Val

130 135 140

Leu Arg Lys His Ala Thr Glu Cys Leu Pro Ala Leu Asp Met Thr Gln

145 150 155 160

Ala Ile Pro Thr Gln Glu Leu Val Thr Arg Asp Leu His Gly Phe Glu

165 170 175

Trp Arg Phe Lys His Ile Phe Arg Gly Gln Pro Arg Arg His Leu Leu

180 185 190

Thr Thr Gly Trp Ser Thr Phe Val Ser Ser Lys Arg Leu Val Ala Gly

195 200 205

Asp Ala Phe Val Phe Leu Arg Gly Glu Asn Gly Asp Leu Arg Val Gly

210 215 220

Val Arg Arg Leu Ala Arg His Gln Asn Thr Met Pro Ala Ser Val Ile

225 230 235 240

Ser Ser Gln Ser Met His Leu Gly Val Leu Ala Thr Ala Ser His Ala

245 250 255

Val Asn Thr Gln Thr Met Phe Leu Val Leu Tyr Lys Pro Arg Ile Ser

260 265 270

Gln Phe Ile Val Ser Val Asn Lys Tyr Met Glu Ala Met Lys His Gly

275 280 285

Phe Ser Leu Gly Thr Arg Phe Arg Met Arg Phe Glu Gly Glu Glu Ser

290 295 300

Pro Glu Arg Ile Phe Thr Gly Thr Ile Val Gly Ile Gly Asp Leu Ser

305 310 315 320

Ser Gln Trp Pro Ala Ser Thr Trp Arg Ser Leu Gln Val Gln Trp Asp

325 330 335

Glu Pro Thr Thr Val Gln Arg Pro Asp Lys Val Ser Pro Trp Glu Ile

340 345 350

Glu Pro Phe Leu Pro Ser Ser Pro Ala Ser Thr Pro Ser Gln Gln Ser

355 360 365

Gln Pro Lys Ser Lys Arg Ser Lys Pro Ile Glu Ser Ser Ser Leu Ser

370 375 380

Pro Gly Gln Ala Ser Phe Leu Gly Val Gln Ala Glu Pro Pro Pro Pro

385 390 395 400

Pro Ala Ser Ser Cys Tyr Arg Leu Phe Gly Phe Asp Leu Thr Ser Asn

405 410 415

Pro Pro Ala Pro Ile Pro Pro Asp Lys Gln Pro Met Asp Thr Ser Glu

420 425 430

Ala Ala Lys Cys Gln Asp Pro Ile Thr Pro Ser Ser Val Asn Glu Pro

435 440 445

Lys Lys Gln Gln Thr Ser Arg Thr Arg Thr Lys Val Gln Met Gln Gly

450 455 460

Ile Ala Val Gly Arg Ala Val Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ser Tyr Asp

465 470 475 480

Glu Leu Ile Lys Glu Leu Glu Glu Met Phe Glu Ile Gln Gly Gln Leu

485 490 495

Leu Pro Arg Asp Lys Trp Ile Val Val Phe Thr Asp Asp Glu Gly Asp

500 505 510

Met Met Leu Ala Gly Asp Asp Pro Trp Asn Glu Phe Cys Lys Met Ala

515 520 525

Lys Lys Ile Phe Ile Tyr Ser Ser Asp Glu Val Lys Lys Met Thr Arg

530 535 540

Arg Met Lys Ser Ser Ser Ser Leu Glu Asn Glu Ala Ser Met Asp

545 550 555