高強(qiáng)度光敏感水凝膠在調(diào)節(jié)細(xì)胞貼附行為中的應(yīng)用本發(fā)明申請(qǐng)是母案申請(qǐng)“高強(qiáng)度光敏感水凝膠及其制備方法和應(yīng)用”的分案申請(qǐng)，母案申請(qǐng)?zhí)枮?01310473943.1，申請(qǐng)日為2013年10月11日。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明高分子水凝膠技術(shù)領(lǐng)域，更加具體地說(shuō)，涉及具有脫附細(xì)胞能力和轉(zhuǎn)基因功效的高強(qiáng)度水凝膠的制備，即聚乙二醇甲基丙烯酸酯-共聚-2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪-共聚-含螺吡喃單體共聚物(PEGMA-co-PVDT-co-PSP)水凝膠的制備以及對(duì)其應(yīng)用的研究。

背景技術(shù)：
高分子水凝膠是一類具有較高的水含量并且在吸水后能夠保持原有結(jié)構(gòu)而不被溶解的三維網(wǎng)狀聚合物，因其特征類似于軟組織且生物相容性良好，因而在生物醫(yī)學(xué)工程領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值。但是，對(duì)于傳統(tǒng)水凝膠，凝膠中的水分子對(duì)高分子網(wǎng)絡(luò)的稀釋作用、交聯(lián)點(diǎn)無(wú)序性分布和鏈節(jié)長(zhǎng)短不一，以及在成膠過(guò)程中交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的不均一性造成水凝膠的力學(xué)性能很弱，難以用于承受較高載荷的軟組織替代，甚至在移動(dòng)過(guò)程中鑷子等器物的觸動(dòng)也很容易使凝膠破損，因此限制了其作為生物材料的應(yīng)用。近年來(lái)，科研人員在解決水凝膠較差的力學(xué)性能這一問(wèn)題中取得了重要的進(jìn)展，提出了許多構(gòu)筑高強(qiáng)水凝膠的新觀點(diǎn)、方法和制造技術(shù)。例如雙網(wǎng)絡(luò)(DN)凝膠(J.P.Gong,Y.Katsuyama,T.Kurokawa,Y.Osada,Double-NetworkHydrogelswithExtremelyHighMechanicalStrength.Adv.Mater.15(2003)1155-1158)、大分子微球復(fù)合凝膠(MMC)、納米復(fù)合材料凝膠(NC)、環(huán)滑凝膠(TP)、四臂-聚乙二醇凝膠和偶極-偶極增強(qiáng)凝膠等。這些文獻(xiàn)報(bào)道的技術(shù)主要是致力于增強(qiáng)水凝膠的強(qiáng)度，如拉伸、壓縮、延展性和斷裂能等。最近，我們課題組報(bào)道了一系列基于二氨基三嗪氫鍵的高強(qiáng)度凝膠(L.Tang,W.Liu,G.Liu,High-StrengthHydrogelswithIntegratedFunctionsofH‐bondingandThermoresponsiveSurface-MediatedReverseTransfectionandCellDetachmentAdv.Mater.22(2010)2652-2656)。其優(yōu)異的力學(xué)強(qiáng)度源于凝膠本體中二氨基三嗪基團(tuán)之間形成的剛性超分子六元環(huán)結(jié)構(gòu)的氫鍵；同時(shí)，凝膠表面的二氨基三嗪可與DNA的堿基對(duì)形成氫鍵從而錨固DNA，這樣可實(shí)現(xiàn)表面介導(dǎo)的反向轉(zhuǎn)染或基質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。已有文獻(xiàn)報(bào)道(Z.Cao,W.Liu,D.Liang,G.Guo,J.Zhang,DesignofPoly(vinyldiaminotriazine)-BasedNonviralVectorsviaSpecificHydrogenBondingwithNucleicAcidBasePairs.Adv.Funct.Mater.17(2007)246-252)線性聚2-乙烯基-4，6-二氨基，1，3，5-三嗪(PVDT)可以與質(zhì)粒DNA形成復(fù)合物(PVDT/pDNA)在細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效的基因轉(zhuǎn)染。通過(guò)PVDT與凝膠表面的二氨基三嗪殘基之間的強(qiáng)氫鍵作用可將PVDT/pDNA復(fù)合物吸附在凝膠表面，可有效提高轉(zhuǎn)染效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
基于以上技術(shù)背景，本發(fā)明的目的在于提供一種高強(qiáng)度光敏感型PEGMA-co-PVDT-co-PSP水凝膠及其制備方法和應(yīng)用。該光敏感性水凝膠具有較高的抗拉伸和抗壓縮能力，具有良好的生物相容性。并且該水凝膠具有吸附DNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力以及通過(guò)光照調(diào)節(jié)細(xì)胞的貼附和脫貼附行為。本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：高強(qiáng)度光敏感水凝膠，由聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)，2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪(VDT)和帶有螺吡喃結(jié)構(gòu)的含雙鍵單體(SP)通過(guò)自由基聚合共聚而成，將這三種單體和引發(fā)劑、交聯(lián)劑溶解在溶劑中，通過(guò)引發(fā)劑引發(fā)它們分子上的不飽和鍵，通過(guò)自由基聚合反應(yīng)制備出水凝膠。在上述技術(shù)方案中，所述聚乙二醇甲基丙烯酸酯根據(jù)分子中聚乙二醇片段的大小，以調(diào)整其數(shù)均分子量，選擇數(shù)均分子量300—800的低聚乙二醇甲基丙烯酸酯(OEGMA)，由于在引發(fā)自由基聚合后，所述聚乙二醇甲基丙烯酸酯分子中的雙鍵被引發(fā)實(shí)現(xiàn)自由基聚合，最終形成水凝膠網(wǎng)絡(luò)，故對(duì)作為初始原料使用的聚乙二醇甲基丙烯酸酯的分子量及其分布不做特意要求。在上述技術(shù)方案中，所述帶有螺吡喃結(jié)構(gòu)的含雙鍵單體，命名為2-[1-丙烯酸-3’,3’-二甲基-6-硝基螺(吲哚-2’,2[2氫-1]苯并吡喃)酯]基丙烯酰胺；按照下述步驟進(jìn)行制備：將羧基螺吡喃(化學(xué)命名為1-(β-羧乙基)-3’,3’-二甲基-6-硝基螺(吲哚-2’,2[2氫-1]苯并吡喃))、N-(2-羥乙基)丙烯酰胺和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶于四氫呋喃中，向其中滴加二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，于室溫20—25℃下反應(yīng)至少24小時(shí)，優(yōu)選24—30小時(shí)；將得到的沉淀洗滌后溶于苯中并再次過(guò)濾，所得溶液加入正己烷中，經(jīng)沉淀得到純化的帶有螺吡喃結(jié)構(gòu)的含雙鍵單體(SP)。其中所述羧基螺吡喃、N-(2-羥乙基)丙烯酰胺、4-二甲氨基吡啶(DMAP)和二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)的用量為等摩爾，即四個(gè)參與反應(yīng)的物質(zhì)的摩爾比為1：1：1：1。所述羧基螺吡喃按照下述步驟進(jìn)行制備【羧基螺吡喃參考文獻(xiàn)J.Chen,F.Zeng,S.Wu,J.Zhao,Q.Chen,Z.Tong,ReversiblefluorescencemodulationthroughenergytransferwithABCtriblockcopolymermicellesasscaffolds.Chem.Commun.43(2008)5580–5582.】：2,3,3-三甲基-3H-吲哚(0.06mol)和3-碘丙酸(0.06mol)溶于5ml甲基乙基酮，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加熱至100℃回流三小時(shí)。將上述反應(yīng)所得季銨鹽溶液溶于大量蒸餾水中，用1,2-二氯乙烷(DCE)反復(fù)洗滌溶液。蒸發(fā)掉水分，得到純化的碘化l-(β-羧乙基)-2,3,3-三甲基-3H-吲哚。上述碘化物和等摩爾的5-硝基水楊醛、哌啶溶于5ml甲基乙基酮中加熱回流三小時(shí)。反應(yīng)所得紅棕色溶液在室溫下放置過(guò)夜，將產(chǎn)生的黃色結(jié)晶顆粒用甲醇反復(fù)洗滌得到純化的含羧基的螺吡喃。制備上述本發(fā)明水凝膠的方法，按照下述步驟進(jìn)行：將聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)，2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪(VDT)，帶有螺吡喃結(jié)構(gòu)的含雙鍵單體(SP)和引發(fā)劑、交聯(lián)劑溶解在溶劑中，通過(guò)引發(fā)劑引發(fā)三種單體的不飽和鍵，在隔絕氧氣的條件下通過(guò)自由基聚合反應(yīng)制備出既可脫附細(xì)胞又可介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染的水凝膠。在本發(fā)明的技術(shù)方案中，以(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪、含螺吡喃單體為共聚單體，以聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA，Mn＝575)作為交聯(lián)劑。聚乙二醇二丙烯酸酯分子鏈中間為“氧－碳－碳－氧”單鍵相連的骨架結(jié)構(gòu)(即聚乙二醇分子的主鏈結(jié)構(gòu)—(CH2CH2O)n)，采用熱源或者光源使引發(fā)劑提供自由基，再由自由基引發(fā)低聚乙二醇甲基丙烯酸酯、2-乙烯基-4,6-二氨基-1,3,5-三嗪和含螺吡喃單體中的雙鍵，發(fā)生共聚交聯(lián)。最終制備的水凝膠材料中，具有(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯、聚2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪和聚螺吡喃三種物質(zhì)的鏈段。其中，2-乙烯基-4，6-二氨基-1，3，5-三嗪分子上的大量氨基間形成大量氫鍵，極大提高了水凝膠的韌性和強(qiáng)度，同時(shí)可以將質(zhì)粒DNA固定在凝膠的表面，賦予該凝膠負(fù)載基因的功能；(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯能提供柔性的親水鏈段，提高凝膠的親水性；螺吡喃的引入，使水凝膠具有光敏性，在可見(jiàn)光下提高凝膠的疏水性，紫外光下提高凝膠的親水性，從而使凝膠表面在紫外/可見(jiàn)光刺激下發(fā)生可逆的親疏水變化，有利于控制細(xì)胞的貼附和脫附(含螺吡喃結(jié)構(gòu)的分子可以在可見(jiàn)光和紫外光下分別異構(gòu)化為閉環(huán)非離子結(jié)構(gòu)和開(kāi)環(huán)的兩性離子結(jié)構(gòu))。上述三部分協(xié)同作用，使整個(gè)水凝膠材料體現(xiàn)出高吸水性，高力學(xué)強(qiáng)度，以及良好的生物相容性，同時(shí)具有雙重功能：細(xì)胞脫附和基因轉(zhuǎn)染。利用引發(fā)劑提供的自由基引發(fā)(低)聚乙二醇甲基丙烯酸酯，VDT和SP共聚，利用交聯(lián)劑PEGDA使其發(fā)生交聯(lián)。其中引發(fā)劑可以選擇高分子聚合領(lǐng)域中常用的熱引發(fā)劑，如偶氮二異丁腈(ABIN)、過(guò)氧化苯甲酰(BPO)，或者光引發(fā)劑，如1-[4-(2-羥乙氧基)-亞苯基]-2-羥基-2′，2′-二甲基乙酮(Irgacure2959)、甲基乙烯基酮、安息香。如果選擇熱引發(fā)劑，則需要首先利用惰性氣體(如氮?dú)?、氬氣或者氦?排除反應(yīng)體系中的氧氣，避免阻聚作用；然后根據(jù)引發(fā)劑的活性和用量，將反應(yīng)體系加熱到所用引發(fā)劑的引發(fā)溫度之上并保持相當(dāng)長(zhǎng)的時(shí)間，如1h以上或者更長(zhǎng)(1-5h)，以保證引發(fā)劑能夠產(chǎn)生足夠多的自由基，引發(fā)反應(yīng)體系持續(xù)發(fā)生自由基聚合反應(yīng)，...