本發(fā)明涉及了一種海藻酸鹽微球載體產(chǎn)品，具體地說是一種半乳糖基團接枝改性的海藻酸鹽微球載體。
背景技術：
將具有生物活性的物質包封在選擇性透過膜中，形成球狀的微膠囊，稱之為“生物微膠囊”[Chang TMS.Hemoglobin corpuscles.Research report for honours physiology.Medical Library,McGill University,1957]。以生物微膠囊作為細胞的免疫隔離和運載工具，利用基因重組細胞或原代細胞的代謝產(chǎn)物來調節(jié)機體生理功能，治療相關疾病是生物醫(yī)學工作者的研究熱點[Basic D,Vacek I,Sun A M.Microencapsulation and transplantation of engineered cells：a new approach to somatic gene therapy.Art Cells Blood Subs ImmobBiotechnol,1996,24(3)：219-255]。海藻酸鹽因其具有優(yōu)良的物理化學性能和生物醫(yī)學性能，成為微囊化技術的主要材料。現(xiàn)有的微囊化技術在培養(yǎng)肝細胞時，由于肝細胞貼壁依賴的生長特性，微囊內部三維立體環(huán)境不能夠使肝細胞迅速適應生長。半乳糖基團是肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體的特異性配體，能夠特異性識別肝細胞表面去唾液酸糖蛋白受體，因此，在微囊材料上引入肝靶向的半乳糖基團，可誘導和提高肝細胞在微膠囊內部的黏附和增殖行為[Jun Yang,Galactosylated alginate as a scaffold for hepatocytes entrapment,Biomaterials,2002,23:471-479]。目前在微囊內部引入半乳糖基團可通過在海藻酸上的共混或共價修飾。含有半乳糖基團的大分子物質[Seog-Jin Seo,Yun-Jaie Choi,Alginate microcapsules prepared with xyloglucan as a synthetic extracellular matrix for hepatocyte attachment,Biomaterials,2005,26:3607-3615]主要通過與海藻酸共混制備微膠囊來發(fā)揮作用，共混的物質易發(fā)生泄漏因此導致了這類微膠囊的穩(wěn)定性降低；而針對于海藻酸的共價修飾主要發(fā)生在海藻酸的羧基部位，羧基位點的占據(jù)使得海藻酸在凝膠化反應形成微膠囊的時候凝膠化程度降低，為了不過度影響海藻酸的成膠性能，半乳糖基取代度受到限制，文獻報道取代度19％對凝膠化過程無影響[Ivan Donati,AmedeoVetere,Galactose-Substituted Alginate:Preliminary Characterization and Study of Gelling Properties,Biomacromolecules,2003,4:624-631]。由于微膠囊穩(wěn)定性及半乳糖基取代度的限制，無論是共混或共價修飾海藻酸，目前報道的方法中均無法在微膠囊內部引入較高濃度的半乳糖基團。
技術實現(xiàn)要素：
針對上述問題，本發(fā)明提出了一種新型半乳糖共價修飾的海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊產(chǎn)品，能夠在保證微膠囊強度和免疫隔離性能的前提下，利用海藻酸 羥基基團共價接枝半乳糖基團衍生物來制備半乳糖基海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊，實現(xiàn)微膠囊內部含有半乳糖基團的同時又不影響微膠囊的穩(wěn)定性，從而誘導和提高肝細胞在微膠囊內部的黏附和增殖行為。
技術方案
本發(fā)明的一種新型海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊，海藻酸鹽羥基經(jīng)含有氨基基團的半乳糖基衍生物修飾，微膠囊內為含有活細胞的經(jīng)半乳糖接枝改性的海藻酸鹽的液體或水凝膠環(huán)境。微膠囊表面可以通過聚陽離子和海藻酸鹽形成聚電解質復合水凝膠膜，此類聚陽離子材料包括：殼聚糖，其脫乙酰度為80-98％，分子量為1kDa-800kDa；α-聚賴氨酸，分子量為2kDa-500kDa；ε-聚賴氨酸，分子量為2kDa-500kDa；聚精氨酸，分子量為1kDa-500kDa；聚鳥氨酸，分子量為1kDa-500kDa；聚組氨酸，分子量為1kDa-500kDa。微膠囊可浸入有機金屬螯合劑溶液中，液化微膠囊內部海藻酸鹽凝膠，參與液化反應的有機金屬螯合劑溶液為40-70mmol/L的檸檬酸鈉或50-200mmol/L的EDTA溶液，微膠囊與有機金屬螯合劑溶液體積比范圍為1:1～1:40，反應1-60分鐘，取出用生理鹽水洗滌，此時得到內部液態(tài)核心的微膠囊。
本發(fā)明中，半乳糖基海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊粒徑在100-1000微米；所用海藻酸鹽分子量為10kDa-10000kDa，海藻酸鹽接枝含氨基基團的半乳糖基衍生物的接枝率為1％-199％。氨基基團的半乳糖基衍生物中，以乳糖胺(monoamine terminated lactobionic lactone)為例，其反應過程如下：
其中，alginate代表海藻酸鹽；M代表金屬離子(例如：鈉，鉀)；CN-alginate代表經(jīng)CNBr活化羥基后的海藻酸鹽分子；L-NH2代表乳糖胺(monoamine terminated lactobionic lactone)分子；L-NH2-alginate代表半乳糖接枝改性后的海藻酸鹽；X所代表的基團為：
含半乳糖基團的L-NH2由乳糖酸(LA)在二甲基亞砜溶劑(DMSO)中與乙二胺(NH2CH2CH2NH2)共熱制備，反應式如下：
微膠囊中半乳糖基海藻酸鹽凝膠為二價金屬鈣，鋇或鋅的半乳糖基海藻酸水凝膠，半乳糖基海藻酸鹽溶液為半乳糖基海藻酸的鈉鹽或鉀鹽溶液。
上述的微膠囊可直接由半乳糖基海藻酸鹽經(jīng)螯合制備得到包埋型水凝膠微球載體，再與聚陽離子反應形成聚陽離子薄膜形成微膠囊，產(chǎn)品的具體制備步驟為：
1、半乳糖基海藻酸的合成
1)乳糖酸與乙二胺在二甲基亞砜溶液中共熱制備L-NH2。
2)制備海藻酸溶液，將海藻酸溶于水中制備成1-10g/L的海藻酸溶液。其中，海藻酸分子量為10KDa-10000kDa。
3)過濾海藻酸溶液除去雜質，NaOH溶液調節(jié)海藻酸溶液pH至堿性。
4)稱取一定質量的CNBr固體，用少量有機溶劑溶解，滴加于海藻酸溶液中并控制pH值不變。
5)清洗活化后的溶液，直至去除未反應的CNBr小分子。
6)在清洗后的溶液中加入一定質量的L-NH2，室溫攪拌反應2天。
7)清洗反應后的溶液，直至去除未反應的L-NH2。
8)冷凍干燥清洗后的溶液，得到半乳糖基海藻酸。
2、半乳糖基海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊制備
1)稱取半乳糖基海藻酸固體，溶于生理鹽水中形成濃度為5-50g/L的溶液。
2)制備海藻酸鹽包埋型水凝膠微球載體，通過銳孔擠出法、靜電液滴法、乳化法、旋轉盤法等制備成半乳糖基海藻酸鹽水凝膠微球。
3)將步驟2)中的包埋型凝膠微球浸入聚陽離子溶液中，包埋型凝膠微球與聚陽離子溶液體積比為1:1-1:40，反應時間為1-60分鐘，反應溫度在0-37℃，此時得到半乳糖基海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊。
聚陽離子溶液的配制方法是：
殼聚糖溶于pH為5.0-7.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，殼聚糖濃度為0.1-15g/L；
α-聚賴氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，α-聚賴氨酸濃度為0.01-10g/L；
ε-聚賴氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，ε-聚賴氨酸濃度為0.01-10g/L；
聚精氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚精氨酸濃度為0.01-10g/L；
聚鳥氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚鳥氨酸濃度為0.01-10g/L；
聚組氨酸溶于3-9g/L NaCl溶液，聚組氨酸濃度為0.01-10g/L。
上述包埋型水凝膠微球載體可用于活細胞的包埋，細胞含量為105-2*107個/mL，活性保持80％以上。所述活細胞為人或動物來源的離體的肝細胞，干細胞，干細胞分化的具有肝細胞功能的細胞，肝細胞系細胞，轉分化的具有肝細胞功能的細胞，內皮細胞，肝枯否氏細胞，肝星形細胞，成纖維細胞，骨髓間充質干細胞中一種或二種以上。
本發(fā)明的有益效果
1、與傳統(tǒng)的海藻酸接枝改性相比，本發(fā)明方法的反應基團被限定在海藻酸羥基基團上，不會因羧基反應位點被占據(jù)而影響海藻酸的成膠性能。
2、與傳統(tǒng)的半乳糖基海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊制備方法相比，該方法能夠保證形成微膠囊機械強度不因海藻酸接枝改性受影響。
3、該方法制備的半乳糖基海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊，可以通過反應物投料比的變化調整微膠囊內部半乳糖基團的含量，較已經(jīng)公開的在海藻酸鹽羧基上接枝半乳糖的方法相比，在羥基上的接枝取代度最高可達199％，而不影響海藻酸鹽凝膠微球性能。
4、本發(fā)明方法的接枝改性反應過程條件溫和，有利于肝細胞的活性保持和功能提高。
5、本發(fā)明方法制備的微膠囊保持優(yōu)良生物相容性，能保證作為組織細胞移植、細胞培養(yǎng)應用過程中微膠囊保持完整性。
6、本發(fā)明產(chǎn)品的微膠囊免疫隔離性能不受接枝改性的影響，用于異種組織細胞移植時，能保持免疫隔離性能，即微膠囊內包埋的細胞不能出微膠囊，微膠囊外的抗體分子、補體分子、免疫細胞不能進入微膠囊內殺死細胞，同時又保持了微膠囊本身應有的通透性，即細胞代謝分泌的活性成分、微膠囊外的營養(yǎng)小分子能自由進出微膠囊。
具體實施方式
制備半乳糖基海藻酸鹽/聚陽離子微膠囊的方法為靜電液滴法(參考文獻：In Vivo Culture of Encapsulated Endostatin-Secreting Chinese Hamster Ovary Cells for Systemic Tumor Inhibition,Human Gene Therapy.2007,18:474-481)。
實施例1
1)制備海藻酸溶液：海藻酸溶于水中制備成1g/L的海藻酸溶液，體積為500mL。其中，海藻酸分子量為350kDa。
2)過濾1)溶液除雜質，用質量濃度240g/L NaOH溶液調節(jié)海藻酸溶液pH到10。
3)將0.06gCNBr固體用0.5mL乙腈溶解后滴加入步驟2)的海藻酸溶液中，并控制pH值不變。
4)清洗步驟3)制備的活化后溶液，直至去除未反應的CNBr小分子。
5)在清洗后的溶液中加入0.4g乳糖胺固體，室溫攪拌反應2天。
6)清洗步驟5)反應后的溶液，直至去除未反應的乳糖胺分子。
7)將步驟6)清洗后的溶液冷凍干燥，得到半乳糖基海藻酸，接枝度30％。
8)將7)制得的半乳糖基海藻酸溶于生理鹽水中制備成15g/L的半乳糖基海藻酸鈉溶液。
9)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。
10)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液。
11)制備半乳糖基海藻酸鈣水凝膠微球：將步驟8)制備的半乳糖基海藻酸鈉溶液在高壓靜電場下形成射流，液滴落入步驟10)配制的氯化鈣凝膠浴溶液中，固化30分鐘，即獲得半乳糖基海藻酸鈣水凝膠微球。
12)制備半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊：將該半乳糖基海藻酸鈣水凝膠微球浸入步驟9)配制的α-聚賴氨酸溶液中，水凝膠微球與聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊，顯微鏡下觀察，微囊粒徑450μm，球形度好，膜厚度10微米。
13)將步驟12)制得的半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊，按微膠囊：IgG＝1：20體積比放入FITC標記的IgG(γ-免疫球蛋白)溶液中，振蕩孵育24小時，激光共聚焦顯微鏡下觀察，微囊內沒有熒光信號，表明微膠囊保持良好的免疫隔離性能。
14)將步驟12)制得的半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊與瑪瑙球、生理鹽水共同放置于三角瓶內，在37度，170r/min條件下震蕩球磨24小時，微膠囊的完整率保持在95％以上，表明微膠囊具有良好的機械強度。
比較例1
1)制備海藻酸溶液：海藻酸溶于生理鹽水中制備成15g/L的海藻酸鈉溶液，其中，海藻酸分子量為350kDa。
2)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。
3)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液。
4)制備海藻酸鈣水凝膠微球：將步驟1)制備的海藻酸鈉溶液在高壓靜電場下形成射流，液滴落入步驟3)配制的氯化鈣凝膠浴溶液中，固化30分鐘，即獲得海藻酸鈣水凝膠微球。
5)制備海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊：將該海藻酸鈣水凝膠微球浸入步驟2)配制的α-聚賴氨酸溶液中，水凝膠微球與聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊，顯微鏡下觀察，微囊粒徑450μm，球形度好，膜厚度10微米。
6)將步驟5)制得的海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊，按微膠囊：IgG＝1：20體積比放入FITC標記的IgG溶液中，振蕩孵育24小時，激光共聚焦顯微鏡下觀察，微囊內沒有熒光信號，表明微膠囊具有良好的免疫隔離性能。
7)將步驟5)制得的海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊與瑪瑙球、生理鹽水共同放置于三角瓶內，在37度，170r/min條件下震蕩球磨24小時，微膠囊的完整率保持在95％以上，表明微膠囊具有良好的機械強度。
比較例2
1)制備海藻酸溶液：海藻酸溶于水中制備成1g/L的海藻酸溶液，體積為500mL。其中，海藻酸分子量為350kDa。
2)過濾1)溶液除雜質，在溶液中加入TEMED(N＇，N＇，N＇-tetramethylethylenediamine)、氯化鈉、EDC(1-ethyl-(dimethylaminopropyl)carbodiimide)、sulfo-NHS(N-hydroxy-sulfosuccinimide)，室溫反應24h。
3)清洗步驟2)反應后的溶液。
4)將步驟3)清洗后的溶液冷凍干燥，得到羧基接枝半乳糖基海藻酸，接枝率30％。
5)將4)制得的羧基接枝半乳糖基海藻酸溶于生理鹽水中制備成15g/L的羧基接枝半乳糖基海藻酸鈉溶液。
6)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。
7)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液。
8)制備羧基接枝半乳糖基海藻酸鈣水凝膠微球：將步驟5)制備的羧基接枝半乳糖基海藻酸鈉溶液在高壓靜電場下形成射流，液滴落入步驟7)配制的氯化鈣凝膠浴溶液中，固化30分鐘，即獲得羧基接枝半乳糖基海藻酸鈣水凝膠微球。
9)制備羧基接枝半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊：將該羧基接枝半乳糖基海藻酸鈣水凝膠微球浸入α-聚賴氨酸溶液中，水凝膠微球與聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成羧基接枝半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊，顯微鏡下觀察，微囊粒徑450μm，球形度好，膜厚度10微米。
10)將步驟9)制得的羧基接枝半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊，按1：20體積比放入FITC標記的IgG溶液中，振蕩孵育24小時，激光共聚焦顯微鏡下觀察，微囊內熒光信號達到微囊外熒光信號強度的10％，表明微膠囊的免疫隔離性能被破壞。
11)將步驟9)制得的羧基接枝半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊與瑪瑙球、生理鹽水共同放置于三角瓶內，在37度，170r/min條件下震蕩球磨24小時，微膠囊的完整率低于80％，表明羧基接枝半乳糖基海藻酸微膠囊機械強度較弱。
實施例2
1)制備半乳糖基海藻酸鈉溶液：半乳糖基海藻酸溶于生理鹽水中制備成15g/L的半乳糖基海藻酸鈉溶液，其中，半乳糖基海藻酸分子量為350kDa。
2)制備殼聚糖溶液：殼聚糖溶于pH為6.0的醋酸-醋酸鈉緩沖液，殼聚糖 濃度為5g/L。其中，殼聚糖分子量30kDa，脫乙酰度90％。
3)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液。
4)制備半乳糖基海藻酸鈣/殼聚糖微膠囊：高壓靜電法制備半乳糖基海藻酸鈣包埋型水凝膠微球，將該包埋型水凝膠微球浸入殼聚糖溶液中，包埋型水凝膠微球與殼聚糖溶液體積比為1:10，反應10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成半乳糖基海藻酸鈣/殼聚糖微膠囊。
5)顯微鏡下觀察包埋型水凝膠微球以及半乳糖基海藻酸鈣/殼聚糖微膠囊，二者的球形度均良好，成膜反應10分鐘，膜厚度大于10微米。
實施例3
1)制備半乳糖基海藻酸鈉溶液：半乳糖基海藻酸溶于生理鹽水中制備成15g/L的半乳糖基海藻酸鈉溶液，無菌過濾。其中，半乳糖基海藻酸分子量為350kDa。
2)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液，無菌過濾。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。
3)配制凝膠浴溶液：無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液，過濾除菌。
4)制備包裹肝細胞的半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸包埋型水凝膠微球載體：取3mL半乳糖基海藻酸鈉溶液，加入6*10^6個大鼠原代肝細胞，混合均勻后，使用靜電液滴法制備包埋有原代大鼠肝細胞的半乳糖基海藻酸鈣包埋型水凝膠微球。
5)制備包裹肝細胞的半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊：將包埋有原代大鼠肝細胞的半乳糖基海藻酸鈣包埋型水凝膠微球浸入步驟2)制備的α-聚賴氨酸溶液中，包埋型水凝膠微球與α-聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成半乳糖基海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊。
6)對該微膠囊內的原代大鼠肝細胞進行培養(yǎng)和肝細胞功能表征，一周后，微膠囊保持完整形態(tài)，球形度良好；微膠囊內細胞活性保持初始活性的75％，肝細胞白蛋白分泌量為2.24±0.68μg/10^6個細胞，尿素合成量為388±11μg/10^6個細胞。
比較例3
1)制備海藻酸鈉溶液：海藻酸溶于生理鹽水中制備成15g/L的海藻酸鈉溶液，無菌過濾。其中，海藻酸分子量為350kDa。
2)制備α-聚賴氨酸溶液：將α-聚賴氨酸溶于生理鹽水中制備成5g/L的α-聚賴氨酸溶液，無菌過濾。其中，α-聚賴氨酸分子量30kDa。
3)配制凝膠浴溶液，無水氯化鈣溶于去離子水中制備成11g/L的氯化鈣溶液，過濾除菌。
4)制備包裹肝細胞的海藻酸鈣/α-聚賴氨酸包埋型水凝膠微球載體：取3mL海藻酸鈉溶液，加入6*10^6個大鼠原代肝細胞，混合均勻后，使用靜電液滴法制備包埋有原代大鼠肝細胞的海藻酸鈣包埋型水凝膠微球。
5)制備包裹肝細胞的海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊：將包埋有原代大鼠肝細胞的海藻酸鈣包埋型水凝膠微球浸入步驟2)制備的α-聚賴氨酸溶液中，包埋型水凝膠微球與α-聚賴氨酸溶液體積比為1:10，反應10分鐘，生理鹽水洗滌，制備成海藻酸鈣/α-聚賴氨酸微膠囊。
6)對該微膠囊內的原代大鼠肝細胞進行培養(yǎng)和肝細胞功能表征，一周后，微膠囊保持完整形態(tài)，球形度良好；微膠囊內細胞活性保持初始活性的44％，肝細胞白蛋白分泌量為0.46±0.05μg/10^6個細胞，尿素合成量為231±29μg/10^6個細胞。