本發(fā)明屬于基因組工程領(lǐng)域，具體地說(shuō)，涉及一種篩選線粒體基因組編輯工具靶向目標(biāo)序列的方法。
背景技術(shù)：
：隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，我們獲得越來(lái)越多的遺傳信息。研究人員試圖通過(guò)對(duì)特定靶向基因的破壞或敲除來(lái)研究它們的相關(guān)功能。與傳統(tǒng)基因打靶技術(shù)相比，新型基因組編輯技術(shù)應(yīng)用范圍更廣、作用效率更高、所需成本更低，可用于模式動(dòng)物構(gòu)建、基因功能研究、基因治療等方面。目前，常用的基因組編輯技術(shù)主要包括以下三種：鋅指蛋白(zincfingerproteins，ZFPs)技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)因子(transcriptionactivator-likeeffectors，TALEs)技術(shù)、CRISPR(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)技術(shù)。它們的大致原理都是通過(guò)造成靶向DNA雙鏈斷裂(double-strandbreaks，DSBs)，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)固有的非同源末端連接(nonhomologousendjoining，NHEJ)或同源重組(homology-directedrepair，HDR)兩種修復(fù)機(jī)制對(duì)DSBs處進(jìn)行修復(fù)，引入插入或缺失突變。三種技術(shù)在具體操作方式上又有所不同：鋅指核酸酶(zinc-fingernuclease，ZFN)與轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶(transcriptionactivator-likeeffectornuclease，TALEN)這兩種人工核酸內(nèi)切酶，均由DNA識(shí)別域與非特異性核酸內(nèi)切酶FokI融合而成。其中，ZFN的鋅指模塊識(shí)別三聯(lián)體堿基，在序列的識(shí)別上靈活性小，設(shè)計(jì)成本昂貴、技術(shù)被少數(shù)公司壟斷，這些都限制了它的發(fā)展。TALEN在結(jié)構(gòu)上較之ZFN更加優(yōu)化。其DNA結(jié)合域中的各單元可與靶向目標(biāo)序列一一對(duì)應(yīng)，組裝更為簡(jiǎn)單，特異性更高。2013年，一種源自細(xì)菌適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的CRISPR/Cas9的出現(xiàn)，為基因靶向修飾領(lǐng)域帶來(lái)了巨大變革。它的主要原理：向?qū)NA(guideRNA，gRNA)與Cas9核酸酶形成的復(fù)合物，在gRNA指導(dǎo)下與靶向目標(biāo)序列結(jié)合，由靶向目標(biāo)序列下游的原型間隔序列相鄰基序(protospaceradjacentmotifs，PAM)激活Cas9核酸酶，使其對(duì)PAM上游3nt處剪切造成DSBs。該系統(tǒng)較之前兩種，應(yīng)用范圍更廣、作用效率更高、使用成本更低，經(jīng)過(guò)短短兩年的發(fā)展，已被用于世界各地的實(shí)驗(yàn)室。線粒體是存在于大多數(shù)真核生物細(xì)胞中的細(xì)胞器，有“細(xì)胞中的能量工廠”之稱(chēng)。它主要通過(guò)氧化磷酸化以三羧酸循環(huán)腺苷(ATP)的形式為細(xì)胞活動(dòng)提供能量。線粒體基因組，又稱(chēng)線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)。長(zhǎng)度一般為幾萬(wàn)至數(shù)十萬(wàn)堿基對(duì)，人類(lèi)mtDNA為16,569bps，共編碼2個(gè)rRNA、13個(gè)多肽、22個(gè)tRNA?；蚺帕芯o湊，除與mtDNA復(fù)制及轉(zhuǎn)錄有關(guān)的一小段區(qū)域外，無(wú)內(nèi)含子序列。mtDNA表現(xiàn)為母系遺傳，突變率高，是細(xì)胞核內(nèi)DNA的10倍左右。且mtDNA突變是導(dǎo)致人類(lèi)線粒體遺傳病及衰老性疾病的重要原因之一。研究表明，它與衰老及神經(jīng)退行性病變?nèi)绨柎暮ＤY、帕金森氏病等老年化疾病有關(guān)，同時(shí)也與腫瘤的形成密切相關(guān)。截至目前，已鑒定出超過(guò)500多個(gè)致病性突變來(lái)自mtDNA，而針對(duì)mtDNA致病性突變的精確改造能力則相對(duì)缺乏。隨著MichalMinczuk等將ZFN作用于mtDNA，SandraRBacman等首次將TALEN用于清除病人線粒體內(nèi)的突變型mtDNA。這兩種基于ZFPs技術(shù)、TALEs技術(shù)的線粒體基因組編輯工具都為更好的進(jìn)行線粒體功能研究、線粒體遺傳病的治療等提供了可能。此外，本實(shí)驗(yàn)室也基于人工CRISPR/Cas9系統(tǒng)獨(dú)特地構(gòu)建了作用于mtDNA的mtCRISPR/Cas9系統(tǒng)，作為新型線粒體基因組編輯工具作用于mtDNA。任何一種基因組編輯技術(shù)，它的靶向剪切效率、切割特異性等問(wèn)題不可回避。由于核基因組中的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)比較完整，當(dāng)發(fā)生DSBs時(shí)，可通過(guò)NHEJ修復(fù)在靶向目標(biāo)序列處引入插入或缺失突變。因此，靶向修飾核基因組的相關(guān)基因組編輯技術(shù)可通過(guò)錯(cuò)配酶法、靶向目標(biāo)序列直接PCR后TA克隆測(cè)序或觀察靶向目標(biāo)序列測(cè)序峰圖等方法鑒定。而相應(yīng)的線粒體基因組編輯工具，由于線粒體缺乏完善的DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)，修復(fù)能力較弱，無(wú)法通過(guò)上述方法檢測(cè)。本發(fā)明，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將一段含有待選靶向目標(biāo)序列的mtDNA序列片段或片段組合整合到宿主基因組中，獲得轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。通過(guò)相應(yīng)基因組編輯技術(shù)靶向剪切活性的鑒定方法檢測(cè)待選mtDNA靶向目標(biāo)序列的剪切活性，從中篩選合適mtDNA靶向目標(biāo)序列。建立了一種篩選線粒體基因組編輯工具靶向目標(biāo)序列的方法。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于，提供一種篩選線粒體基因組編輯工具靶向目標(biāo)序列的方法。本發(fā)明基于轉(zhuǎn)基因技術(shù)，構(gòu)建了一個(gè)核基因組中含有線粒體DNA(mtDNA)序列的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。利用相應(yīng)基因組編輯技術(shù)靶向剪切活性的鑒定方法檢測(cè)待選mtDNA靶向目標(biāo)序列的剪切活性，從中篩選合適mtDNA靶向目標(biāo)序列。本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建方法。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系構(gòu)建的主要流程：構(gòu)建一個(gè)含有mtDNA序列的重組克隆質(zhì)粒，將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于作用細(xì)胞后(或線性化后轉(zhuǎn)染)，經(jīng)適宜濃度的藥物篩選(或其它方法)，使這段mtDNA序列隨機(jī)整合到宿主基因組中，挑選單拷貝或低拷貝的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株用于檢測(cè)待選mtDNA靶向目標(biāo)序列的剪切活性，從中篩選合適mtDNA靶向目標(biāo)序列。所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系的構(gòu)建，可將一個(gè)或多個(gè)待選mtDNA靶向目標(biāo)序列、潛在脫靶序列、定點(diǎn)整合所需同源臂序列或其它序列片段(或片段組合)連入克隆載體質(zhì)粒中，并將這段序列整合到宿主基因組中，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。所述克隆載體質(zhì)粒，可以為哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-N1，也可以為其它真核表達(dá)載體。所述重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建，可通過(guò)一步或多步常規(guī)PCR擴(kuò)增得到一段含有一個(gè)或多個(gè)待選mtDNA靶向目標(biāo)序列和其它序列片段(或片段組合)的串聯(lián)序列，將其連入克隆載體質(zhì)粒中，若該載體有熒光標(biāo)簽，可同時(shí)與其中的熒光標(biāo)簽(EGFP、RFP等)編碼序列融合，經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，得正確的重組克隆質(zhì)粒。優(yōu)選地，該克隆載體質(zhì)?？蔀椴溉閯?dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體pEGFP-N1，購(gòu)自Clontech公司，含neo抗性基因和EGFP標(biāo)簽，可在多克隆位點(diǎn)(MCS)處插入外源基因并于EGFP融合，由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)，由于含有熒光標(biāo)簽可通過(guò)熒光顯微鏡觀察綠色熒光情況，檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)情況。所述以pEGFP-N1克隆載體質(zhì)粒為例，將一段含有兩個(gè)mtDNA靶向目標(biāo)序列T1、T2的序列連入其中的重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建流程如圖1A所示：1、以HEK293基因組DNA為模板，經(jīng)CL-F1/CL-R1、CL-F2/CL-R2、CL-F3/CL-R3三對(duì)引物依次擴(kuò)增得一段同時(shí)含有T1、T2靶向目標(biāo)序列的mtDNA序列；2、將上述序列由NheI/AgeI兩位點(diǎn)，經(jīng)雙酶切連入，經(jīng)測(cè)序得正確質(zhì)粒；3、以上述步驟所得正確質(zhì)粒為模板，經(jīng)CL-F4/CL-R4引物對(duì)擴(kuò)增去除EGFP編碼序列前的起始密碼子ATG，由AgeI/NotI經(jīng)雙酶切連入，通過(guò)測(cè)序得到含mtDNA靶向目標(biāo)序列融合基因的正確重組克隆質(zhì)粒pEGFP-mtDNA。所述重組克隆質(zhì)粒pEGFP-mtDNA中外源基因表達(dá)模塊如圖1B所示，核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。其中，CMV啟動(dòng)子的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第1-589位核苷酸所示；NheI限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第591-596位核苷酸所示；KozaK序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第597-602位核苷酸所示；起始密碼子的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第603-605位核苷酸所示；T1靶向目標(biāo)序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第636-655位核苷酸所示；T2靶向目標(biāo)序列的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第752-771位核苷酸所示；AgeI限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第773-778位核苷酸所示；編碼EGFP的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第780-1493位核苷酸所示；終止密碼子的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第1494-1496位核苷酸所示；NotI限制性酶切位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQIDNO.1中第1498-1505位核苷酸所示。所述鑒定用單拷貝或低拷貝轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的挑選，可首先通過(guò)常規(guī)PCR、蛋白質(zhì)印跡法(WesternBlot)等方法初篩陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，再經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、SouthernBlot法或其它方法檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)。優(yōu)選地，陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株的初篩可通過(guò)常規(guī)PCR法完成。優(yōu)選地，外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)可通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR法完成。所述常規(guī)PCR法初篩陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，以所述構(gòu)建的重組克隆質(zhì)粒pEGFP-mtDNA為例，主要流程：1、將pEGFP-mtDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于培養(yǎng)在60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的作用細(xì)胞中；2、24小時(shí)后，將細(xì)胞傳代至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中同時(shí)開(kāi)始藥篩；3、每隔3-4天更換一次含有相同濃度抗生素的新鮮培養(yǎng)基，至細(xì)胞不再大批量死亡，且形成清晰單克隆細(xì)胞團(tuán)后，挑取單克隆于24孔板中；4、收取含綠色熒光的細(xì)胞，同時(shí)提取基因組，以此為模板分別用P1(P1-F/P1-R)、P2(P2-F/P2-R)、P3(P3-F/P3-R)三對(duì)引物進(jìn)行常規(guī)PCR初篩，均可擴(kuò)增出目的條帶的細(xì)胞為初篩所得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株。所述P1、P2、P3引物對(duì)，根據(jù)pEGFP-mtDNA序列設(shè)計(jì)，擴(kuò)增范圍涵蓋啟動(dòng)子區(qū)、編碼區(qū)、終止區(qū)。其中，P1-F位于CMV啟動(dòng)子區(qū)、P1-R位于EGFP編碼序列上、P2-F位于CMV啟動(dòng)子區(qū)、P2-R位于EGFP編碼序列上(含終止密碼子)、P3-R位于PolyA的編碼序列上，基于pEGFP-N1構(gòu)建的重組克隆質(zhì)粒普遍適用；P3-F位于外源基因序列上(含起始密碼子ATG)，可根據(jù)實(shí)際情況自行設(shè)計(jì)。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)，以所述構(gòu)建的重組克隆質(zhì)粒pEGFP-mtDNA為例，主要流程：1、以ΔCt(ΔCt＝Ct特異-Ct內(nèi)參)和標(biāo)準(zhǔn)樣品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(以2為底)作圖得絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；2、提取初篩陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株基因組，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)其對(duì)應(yīng)的ΔCt值；3、將各細(xì)胞株的ΔCt值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式中，得拷貝數(shù)。所述絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線建立流程：1、將重組克隆質(zhì)粒與作用細(xì)胞的基因組DNA混合，分別設(shè)置含有1、2、4、8、16個(gè)外源基因拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照(若重組克隆質(zhì)粒abp，作用細(xì)胞基因組DNA用量bng、大小cbp，則bng基因組DNA中含有一個(gè)外源基因拷貝數(shù)的質(zhì)量為a×b×0.5/cng，該法為通用方法)；2、以上述標(biāo)準(zhǔn)品為樣品，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，經(jīng)RT-F/RT-R、Actin-F/Actin-R(內(nèi)參)兩引物對(duì)擴(kuò)增，得ΔCt；3、由ΔCt值和對(duì)應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)樣品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(以2為底)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線。所述外源基因拷貝數(shù)的檢測(cè)流程：1、提取初篩所得細(xì)胞株的基因組DNA，以此為模板，經(jīng)RT-F/RT-R、Actin-F/Actin-R(內(nèi)參)兩引物對(duì)擴(kuò)增，得ΔCt；2、將各個(gè)細(xì)胞株對(duì)應(yīng)的ΔCt值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線所得公式中，計(jì)算相應(yīng)拷貝數(shù)。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR法起始模板量小、靈敏性高、簡(jiǎn)單高效，足以滿足本發(fā)明的篩選需要。兩引物對(duì)RT-F/RT-R(127bp)、Actin-F/Actin-R(130bp)，擴(kuò)增大小相近、Tm值基本相等、擴(kuò)增效率基本相同。本發(fā)明還提供了一種檢測(cè)mtDNA靶向目標(biāo)序列剪切活性的方法。所述mtDNA靶向目標(biāo)序列剪切活性檢測(cè)的主要流程：將含有相應(yīng)mtDNA靶向目標(biāo)序列的基因組編輯技術(shù)作用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到所構(gòu)建的單拷貝或低拷貝轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中，經(jīng)合適作用時(shí)間，利用相應(yīng)基因組編輯技術(shù)靶向剪切活性的鑒定方法進(jìn)行檢測(cè)。所述基因組編輯技術(shù)靶向剪切活性的鑒定方法主要有：1、對(duì)靶向目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性、退火后形成錯(cuò)配，通過(guò)錯(cuò)配酶剪切不完全匹配的DNA序列，驗(yàn)證靶向目標(biāo)序列剪切活性；2、對(duì)靶向目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，通過(guò)TA克隆測(cè)序與理論序列比對(duì)驗(yàn)證靶向目標(biāo)序列剪切活性；3、對(duì)靶向目標(biāo)序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，擴(kuò)增產(chǎn)物直接測(cè)序，通過(guò)觀察靶位點(diǎn)處的套峰情況驗(yàn)證靶向目標(biāo)序列剪切活性，等多種方式進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)選地，基因組編輯技術(shù)靶向剪切活性的鑒定方法可通過(guò)觀察PCR產(chǎn)物的測(cè)序峰圖檢測(cè)。所述觀察測(cè)序峰圖檢測(cè)靶向目標(biāo)序列剪切活性的原理：如果靶向目標(biāo)序列在核基因組中發(fā)生DSBs，則會(huì)引發(fā)細(xì)胞中的NHEJ修復(fù)機(jī)制，得到插入或缺失突變。而對(duì)樣品全基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得的擴(kuò)增產(chǎn)物為混合產(chǎn)物，其中既含有野生型原始靶向目標(biāo)序列，又含有引入插入或缺失的突變型靶向目標(biāo)序列。因此，查看靶向剪切處是否有套峰出現(xiàn)，如有套峰，則證明靶向目標(biāo)序列有剪切活性，反之則無(wú)。所述通過(guò)觀察測(cè)序峰圖檢測(cè)mtDNA靶向目標(biāo)序列剪切活性，以pEGFP-mtDNA所構(gòu)建的單拷貝或低拷貝轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系為例，主要流程：1、將含有相應(yīng)mtDNA靶向目標(biāo)序列的基因組編輯技術(shù)作用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到所構(gòu)建的單拷貝或低拷貝轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中；2、48-72小時(shí)后，收取細(xì)胞提基因組DNA，以此為模板經(jīng)P1引物對(duì)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測(cè)序；3、觀察測(cè)序峰圖，若靶向剪切位置處有套峰出現(xiàn)，則證明靶向目標(biāo)序列有剪切活性，反之則無(wú)。本發(fā)明的一種篩選線粒體基因組編輯工具靶向目標(biāo)序列的方法，具有如下優(yōu)點(diǎn)：所述重組克隆質(zhì)粒在構(gòu)建時(shí)，研究者可以將一個(gè)或多個(gè)待選mtDNA靶向目標(biāo)序列、潛在脫靶序列、定點(diǎn)整合所需同源臂序列或其它序列片段(或片段組合)連入克隆載體質(zhì)粒中，并將這段序列整合到宿主基因組中，構(gòu)建單拷貝或低拷貝的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系。該細(xì)胞系不僅可以檢測(cè)多個(gè)待選靶向目標(biāo)序列的剪切活性，還可以比較不同靶向目標(biāo)序列的剪切效率、分析單堿基或多堿基不匹配下的潛在脫靶效應(yīng)等問(wèn)題，為更好的篩選靶向目標(biāo)序列、設(shè)計(jì)線粒體基因組編輯工具提供重要的參考依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，一舉多得。所述挑選的單拷貝或低拷貝單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，在轉(zhuǎn)入定量作用質(zhì)粒后，可以更加清晰的檢測(cè)待選靶向目標(biāo)序列剪切活性，減少背景干擾。所述檢測(cè)方法適用范圍廣，基于ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9等基因組編輯技術(shù)改造而成的線粒體基因組編輯工具，或其它線粒體基因組編輯工具均可使用此方法檢測(cè)靶向目標(biāo)序列的剪切活性，比較不同靶向目標(biāo)序列間的剪切效率，篩選合適靶向目標(biāo)序列，簡(jiǎn)單高效。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明中pEGFP-mtDNA重組克隆質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。其中，圖1A為pEGFP-mtDNA重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖，紅色方塊表示mtDNA靶向目標(biāo)序列T1、T2，藍(lán)色方塊表示flag標(biāo)簽；圖1B為pEGFP-mtDNA重組克隆質(zhì)粒中外源基因表達(dá)模塊示意圖，紅色部分表示mtDNA靶向目標(biāo)序列T1、T2，藍(lán)色部分表示flag標(biāo)簽，黃色部分表示T1、T2分別對(duì)應(yīng)的PAM，綠色部分表示EGFP。圖2為本發(fā)明中的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株初篩結(jié)果。其中，圖2A為pEGFP-mtDNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率圖；圖2B為單克隆細(xì)胞株常規(guī)PCR初篩結(jié)果圖。圖3為本發(fā)明利用絕對(duì)定量PCR法檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)。其中，圖3A為特異性引物對(duì)RT-F/RT-R的擴(kuò)增曲線與熔解曲線；圖3B為內(nèi)參引物對(duì)Actin-F/Actin-R的擴(kuò)增曲線與熔解曲線；圖3C為ΔCt與拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(log2N)作圖得標(biāo)準(zhǔn)曲線，Log2N＝-1.1772ΔCt+2.7793(R2＝0.9971)。圖4為本發(fā)明中T1、T2兩個(gè)靶向目標(biāo)序列剪切活性的檢測(cè)。其中，圖4A為不含mtDNA靶向目標(biāo)序列T1、T2的CRISPR/Cas9空骨架質(zhì)粒，即Control-T1、Control-T2，轉(zhuǎn)染于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株10#，48小時(shí)后的測(cè)序峰圖；圖4B為將含mtDNA靶向目標(biāo)序列T1、T2的CRISPR/Cas9質(zhì)粒，即CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2，轉(zhuǎn)染于轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株10#，48小時(shí)后的測(cè)序峰圖；紅色方框表示靶向目標(biāo)序列，黃色方框表示PAM，灰色閃電狀圖標(biāo)指示Cas9核酸酶剪切位置(PAM上游3nt處)。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，但并不限定本發(fā)明。在本發(fā)明基礎(chǔ)上，所做的同類(lèi)型改進(jìn)均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。實(shí)施例1單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的獲得本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株，其構(gòu)建流程：將含有mtDNA靶向目標(biāo)序列的重組克隆質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于細(xì)胞中，經(jīng)藥物篩選，挑單克隆于24孔板。提取單克隆細(xì)胞株的基因組DNA，通過(guò)常規(guī)PCR初篩得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，再利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR挑選其中單拷貝或低拷貝的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株。1.1構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒：以pEGFP-N1為載體，將一段同時(shí)含有兩個(gè)靶向目標(biāo)序列(T1、T2)的mtDNA序列與EGFP的N端融合，除去EGFP前的起始密碼子ATG，最終得到重組克隆質(zhì)粒：pEGFP-mtDNA(如圖1所示)。具體步驟如下：1)以HEK293基因組為模板，用CL-F1/CL-R1引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(335bp)，得產(chǎn)物J；2)對(duì)J進(jìn)行膠回收，并以此為模板用CL-F2/CL-R2(CL-F2帶有flag標(biāo)簽，如表1橫線部分所示)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(167bp)，得產(chǎn)物K；3)對(duì)K進(jìn)行膠回收，并以此為模板用CL-F3/CL-R3(CL-F3帶有NheI酶切位點(diǎn)和flag標(biāo)簽、CL-R3帶有AgeI酶切位點(diǎn)，如表1相應(yīng)橫線、橫線斜體部分所示)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(194bp)，得產(chǎn)物L(fēng)；4)對(duì)純化后的產(chǎn)物L(fēng)及pEGFP-N1質(zhì)粒做NheI/AgeI雙酶切，分別以此為插入片段及載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、挑單克隆鑒定、鑒定正確樣品測(cè)序；5)以上一步驟中的正確質(zhì)粒為模板，用CL-F4/CL-R4(CL-F4帶有AgeI酶切位點(diǎn)，如表1橫線斜體部分所示；刪去EGFP起始密碼子ATG，添加一個(gè)堿基C調(diào)整編碼框，該堿基的選擇應(yīng)避免引入終止密碼子)引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增(902bp)，得產(chǎn)物M；6)對(duì)純化后的產(chǎn)物M及上一步驟所用質(zhì)粒做AgeI/NotI雙酶切，分別以此為插入片段及載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、挑單克隆鑒定、鑒定正確樣品測(cè)序，即得最終質(zhì)粒：pEGFP-mtDNA。重組克隆質(zhì)粒的構(gòu)建流程如圖1A所示，其中的外源基因表達(dá)模塊如圖1B所示。上述具體步驟并不限定本發(fā)明，在構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒時(shí)，可根據(jù)需要將一個(gè)或多個(gè)待選靶向目標(biāo)序列、潛在脫靶序列等同時(shí)串聯(lián)入質(zhì)粒中，便于同時(shí)檢測(cè)其剪切活性，篩選合適靶向目標(biāo)序列。在外源基因與EGFP的N端融合時(shí)要注意是否需要調(diào)整編碼框，是否引入了起始密碼子或終止密碼子等問(wèn)題。相關(guān)引物序列具見(jiàn)表1：1.2初篩陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株：具體步驟如下：1)轉(zhuǎn)染前一天，將HEK293細(xì)胞接種于60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中；2)第二天，將1.1中所述鑒定正確的重組克隆質(zhì)粒pEGFP-mtDNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于HEK293細(xì)胞中，24小時(shí)后觀察EGFP的表達(dá)情況(轉(zhuǎn)染效率達(dá)95％以上，如圖2A所示)，并將細(xì)胞傳代至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中；3)加800ug/ml的G418篩選陽(yáng)性細(xì)胞，每隔3-4天更換一次含有相同濃度抗生素的新鮮培養(yǎng)基；4)培養(yǎng)至細(xì)胞不再大批量死亡，且形成清晰單克隆細(xì)胞團(tuán)后，挑取單克隆于24孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；5)待24孔板長(zhǎng)滿后，將其中11個(gè)含有綠色熒光的單克隆細(xì)胞傳代至6孔板中擴(kuò)大培養(yǎng)并收取部分細(xì)胞提基因組(基因組提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司，貨號(hào)DP304-03)；6)以步驟5)中所述11個(gè)基因組樣品為模板，分別用P1(P1-F/P1-R)、P2(P2-F/P2-R)、P3(P3-F/P3-R)三對(duì)引物(相關(guān)序列如表2所示)進(jìn)行常規(guī)PCR初篩，三對(duì)引物均可擴(kuò)增出目的條帶的細(xì)胞，則為初篩所得陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，即編號(hào)為2#、3#、5#、8#、10#的5株細(xì)胞(如圖2B所示)。所述步驟6)中，三對(duì)引物P1、P2、P3均根據(jù)pEGFP-mtDNA序列設(shè)計(jì)，擴(kuò)增范圍涵蓋啟動(dòng)子區(qū)、編碼區(qū)、終止區(qū)，保證篩選結(jié)果準(zhǔn)確性的同時(shí)又確保了外源基因能夠完整表達(dá)。具體擴(kuò)增范圍如下：1)P1：CMV部分+mtDNA靶向目標(biāo)序列+EGFP部分(967bp)；2)P2：CMV小部分+mtDNA靶向目標(biāo)序列+EGFP(1074bp)；3)P3：mtDNA靶向目標(biāo)序列+EGFP+polyA部分(1069bp)。相關(guān)引物序列具見(jiàn)表2：引物名稱(chēng)引物序列(5’-3’)對(duì)應(yīng)IDP1-FATGTTCCCATAGTAACGCCAASEQIDNO.10P1-RGGGTCTTGTAGTTGCCGTCGSEQIDNO.11P2-FGATTTCCAAGTCTCCACCCCSEQIDNO.12P2-RTCACTTGTACAGCTCGTCCATGSEQIDNO.13P3-FATGGACTACAAGGACGACGATGSEQIDNO.14P3-RTTTGTGATGCTATTGCTTTATTTGSEQIDNO.151.3挑選單拷貝或低拷貝的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株：經(jīng)過(guò)藥物篩選得到的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株，其外源基因往往隨機(jī)整合在染色體上。因此，在經(jīng)1.2所述方法初篩陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株后，檢測(cè)其外源基因拷貝數(shù)，挑選單拷貝或低拷貝的單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株是有效鑒定靶向目標(biāo)序列剪切活性的關(guān)鍵步驟。所述檢測(cè)外源基因拷貝數(shù)的流程：1)以ΔCt(ΔCt＝Ct特異-Ct內(nèi)參)和標(biāo)準(zhǔn)樣品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(以2為底)作圖得絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；2)提取初篩陽(yáng)性單克隆細(xì)胞株基因組并以此為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR得各細(xì)胞株的ΔCt值；3)將各細(xì)胞株的ΔCt值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)應(yīng)的計(jì)算公式中，得拷貝數(shù)(N)；1.3.1建立絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線：具體步驟如下：1)將pEGFP-mtDNA質(zhì)粒與HEK293基因組DNA混合，分別設(shè)置含有1、2、4、8、16個(gè)外源基因拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照(假設(shè)質(zhì)粒大小為abp，HEK293基因組DNA用量為bng，HEK293基因組DNA大小為3×109bp，則bng基因組DNA中含有一個(gè)外源基因拷貝數(shù)的質(zhì)量為a×b×0.5/3×109ng)；2)設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增外源基因序列(RT-F/RT-R)的引物對(duì)和擴(kuò)增內(nèi)參β-actin(Actin-F/Actin-R)的引物對(duì)(引物序列具見(jiàn)表3)；3)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以步驟1)中5個(gè)不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品為樣品，經(jīng)RT-F/RT-R、Actin-F/Actin-R(內(nèi)參)兩引物對(duì)擴(kuò)增，每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，取平均Ct值。所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)總體系20ul(上/下游引物各0.5ul、ddH2O9ul、2×SYBRpremixE×Taq10ul)，反應(yīng)程序：95℃3min；95℃15S、60℃30S(40個(gè)循環(huán))，熔解曲線60℃-95℃，每個(gè)樣品做3次重復(fù)。結(jié)果如圖3所示，特異性引物對(duì)RT-F/RT-R的擴(kuò)增曲線、熔解曲線如圖3A所示，內(nèi)參引物對(duì)Actin-F/Actin-R的擴(kuò)增曲線、熔解曲線如圖3B所示，兩熔解曲線均在86℃附近有且只有一個(gè)單峰，證明兩引物對(duì)均為特異性擴(kuò)增。將RT-F/RT-R擴(kuò)增的CtpEGFP-mtDNA值減去Actin-F/Actin-R擴(kuò)增的CtActin值，得ΔCt，ΔCt與標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值(log2N)作圖得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖3C所示)，Log2N＝-1.1772ΔCt+2.7793，決定系數(shù)R2＝0.9971。相關(guān)引物序列具見(jiàn)表3：引物名稱(chēng)引物序列(5’-3’)對(duì)應(yīng)IDRT-FCACAGCCCTATACTCCCTCTACATSEQIDNO.16RT-RTTACGTCGCCGTCCAGCSEQIDNO.17Actin-FAACGGTGAAGGTGACAGCAGTSEQIDNO.18Actin-RCTTCCTGTAACAACGCATCTCATASEQIDNO.191.3.2檢測(cè)單克隆轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株的拷貝數(shù)：具體步驟如下：1)提取1.2初篩所得2#、3#、5#、8#、10#5株細(xì)胞的基因組；2)利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以上述所提基因組為模板，經(jīng)RT-F/RT-R、Actin-F/Actin-R(內(nèi)參)兩引物對(duì)擴(kuò)增，得ΔCt；3)將5個(gè)細(xì)胞株對(duì)應(yīng)的ΔCt值帶入Log2N＝-1.1772ΔCt+2.7793公式中，計(jì)算相應(yīng)拷貝數(shù)(N)。結(jié)果如表4所示，標(biāo)準(zhǔn)差在0.9351和0.1387之間，結(jié)果可信。挑選單拷貝的細(xì)胞株10#用于檢測(cè)線粒體基因組編輯工具靶向剪切活性。外源基因拷貝數(shù)檢測(cè)結(jié)果具見(jiàn)表4：克隆編號(hào)拷貝數(shù)(N±S)2#2.08±0.93513#1.39±0.66805#1.36±0.13878#5.70±0.514910#1.03±0.1948實(shí)施例2待選mtDNA靶向目標(biāo)序列的篩選本發(fā)明還提供了一種篩選線粒體基因組編輯工具靶向目標(biāo)序列的方法，主要流程：將含有相應(yīng)待選mtDNA靶向目標(biāo)序列的基因組編輯技術(shù)作用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到所選轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株中。48-72小時(shí)后，收取細(xì)胞提基因組，并以此為模板，用P1-F/P1-R引物對(duì)PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測(cè)序，測(cè)序引物為P1-R。觀察測(cè)序峰圖，若靶向剪切位置處有套峰出現(xiàn)，則證明靶向目標(biāo)序列有剪切活性，反之則無(wú)。根據(jù)待選mtDNA靶向目標(biāo)序列的測(cè)序峰圖套峰強(qiáng)弱，比較其剪切活性，從中篩選合適靶向目標(biāo)序列。具體步驟如下：1)構(gòu)建分別含有mtDNA靶向目標(biāo)序列T1、T2的兩個(gè)CRISPR/Cas9質(zhì)粒，命名為CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2；2)將CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2和相應(yīng)不含T1、T2靶向目標(biāo)序列的CRISPR/Cas9空骨架質(zhì)粒(Control-T1、Control-T2)分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到1.3.2所述的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞株10#中；3)48小時(shí)后，收取細(xì)胞提基因組，以此為模板用P1-F/P1-R引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送樣測(cè)序。檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，陰性對(duì)照Control-T1、Control-T2在靶向目標(biāo)序列處均無(wú)套峰出現(xiàn)(圖4A)，而作用質(zhì)粒CRISPR/Cas9-T1、CRISPR/Cas9-T2在靶向目標(biāo)序列處均有套峰出現(xiàn)，且CRISPR/Cas9-T1處的套峰強(qiáng)于CRISPR/Cas9-T2處(圖4B)。證明兩個(gè)靶向目標(biāo)序列T1、T2均有剪切活性，且T1的剪切效率高于T2。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3