本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域，具體地，涉及細胞的制備方法，更具體地，涉及臨床治療用間充質(zhì)干細胞及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells,MSC)是干細胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，屬于多能干細胞，廣泛分布于動物體內(nèi)骨髓、肝臟、脂肪等多種組織中。MSCs具有強大的自我更新能力和多向分化潛能，在連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細胞，是移植領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊的再生來源細胞。同時，MSCs易于純化分離，無免疫原性，且沒有倫理問題，使得關(guān)于它的基礎(chǔ)研究及其臨床應(yīng)用蓬勃發(fā)展。

人臍帶間充質(zhì)干細胞(HUMSCs)，是在臍帶中在動靜脈之間的特殊胚胎粘液樣結(jié)締組織華爾通氏膠(Whartonps Jelly)分離得到的基質(zhì)細胞。人臍帶間充質(zhì)干細胞在細胞含量、增殖能力方面要優(yōu)于骨髓MSCs，且免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便，對產(chǎn)婦及新生兒沒有任何的損害，不會有腫瘤細胞，病毒和病原微生物的感染及傳播幾率也相對較低，無倫理學(xué)爭議等優(yōu)點，因此，越來越受到研究工作者們的關(guān)注。

然而，臍帶間充質(zhì)干細胞的臨床應(yīng)用還有待進一步開發(fā)。

目前，通常采用酶消化法或者是植塊法從臍帶組織中獲取MSCs，酶消化法在酶的選擇和消化時間上沒有統(tǒng)一的標(biāo)準，多使用膠原酶，使動物組織細胞間的膠原纖維和胞外蛋白酶解，從而獲得單個細胞。但膠原酶消化過度會導(dǎo)致細胞表面一些生活物質(zhì)的改變進而影響細胞活力，對細胞具有損傷作用。對酶消化臍帶組織的時間有一定的要求，且待消化的臍帶組織又不是一個完全均一的體系，很難保證所有細胞消化程度的統(tǒng)一性，因此很難把握最佳的消化時間，會影響所得細胞的數(shù)量和質(zhì)量，進而影響以后的研究及使用。另由于現(xiàn)有膠原酶來源于動物內(nèi)臟，應(yīng)用酶消化法在分離培養(yǎng)時，存在動物源蛋白和動物源病原物的污染，增加了臨床應(yīng)用干細胞的風(fēng)險。與膠原酶法相比，植塊法可避免上述問題,組織損傷小，臍帶組織利用率高，易獲得存活較好的細胞。由于遷出細胞未受到損害，且在早期有組織塊分泌的營養(yǎng)物質(zhì)支持，因此較易存活。而現(xiàn)有的植塊法雖然操作簡單，但是通過機械操作形成的組織塊質(zhì)量參差不齊，貼壁能力也不盡相同，這樣會大大影響培養(yǎng)周期；且經(jīng)常會有內(nèi)皮細 胞的殘留，影響原代細胞的質(zhì)量和純度；同時對P0代細胞進行傳代后，原代組織塊完全丟棄，細胞的得率受到很大的制約。更重要的是，以上操作對臍帶組織的利用率非常低，且是一個極大的浪費。

因此，間充質(zhì)干細胞的制備方法有待進一步改進。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種臍帶組織利用率高、細胞得率高、且活性好、純度高的臨床治療用間充質(zhì)干細胞，同時提出了該間充質(zhì)干細胞在制備藥物中的用途。

因而，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種制備臨床治療用間充質(zhì)干細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：

(1)將多個含有間充質(zhì)干細胞的組織塊在第一培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，以便獲得從所述多個組織塊中爬出的間充質(zhì)干細胞，并且從所述多個含有間充質(zhì)干細胞的組織塊中選擇優(yōu)化組織塊；以及

(2)將步驟(1)中所獲得的優(yōu)化組織塊在第二培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，以便獲得從所述優(yōu)化組織塊爬出的間充質(zhì)干細胞，

其中，在步驟(1)中選擇優(yōu)化組織塊的條件包括下列至少之一：

(a)無內(nèi)皮細胞爬出；

(b)有間充質(zhì)干細胞爬出；

(c)間充質(zhì)干細胞最快爬出。

發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，與已經(jīng)報道的間充質(zhì)干細胞制備方法相比，本發(fā)明的臨床級臍帶間充質(zhì)干細胞制備方法：對臍帶組織的利用率高，尤其，細胞的產(chǎn)率大大提高，能夠進一步滿足臨床應(yīng)用量大的需求；并且制備得到的臨床治療用間充質(zhì)干細胞純度高，細胞狀態(tài)好，活性高，分化能力強，能夠滿足臨床應(yīng)用的功能性質(zhì)量要求。

另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的制備臨床治療用間充質(zhì)干細胞的方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述含有間充質(zhì)干細胞的組織塊來源于臍帶組織。

根據(jù)本發(fā)明的另一些實施例，所述含有間充質(zhì)干細胞的組織塊是通過下列步驟獲得的：剔除臍帶組織的臍動脈和臍靜脈；以及從所述臍帶組織中分離華爾通氏膠，其中，所述華爾通氏膠構(gòu)成所述含有間充質(zhì)干細胞的組織塊。由此，得到的臍帶組織的間充質(zhì)干細胞組織的純度高，內(nèi)皮細胞含量少。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(2)之后，進一步包括：(3)將所述優(yōu)化組織塊在第三 培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，5-7天后可獲得從所述優(yōu)化組織塊爬出的P0代間充質(zhì)干細胞。由此，該可以獲得較多P0代間充質(zhì)干細胞，對臍帶組織的利用率高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，重復(fù)步驟(3)至少一次，優(yōu)選2～5次。由此，通過重復(fù)培養(yǎng)，實現(xiàn)了優(yōu)化組織塊的多次利用，可以獲得大量的原代(即P0代)間充質(zhì)干細胞，對臍帶組織的利用率顯著提高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，收集步驟(1)～(3)中所獲得的P0代間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)。由此可以獲得大量的P3-P5代的間充質(zhì)干細胞，從而能夠同時滿足臨床治療用間充質(zhì)干細胞對細胞代數(shù)和數(shù)量的要求。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述傳代培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述傳代培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基(Sciencell)，無任何動物源蛋白和動物源病原物的污染。由此，細胞增殖速度快，活性高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將所述P0代間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)，所述傳代的時間間隔為2-4天，并且將所得到的P3～P5代間充質(zhì)干細胞作為臨床治療用間充質(zhì)干細胞。由此，通過細胞的傳代可快速獲得臨床級別數(shù)量的低代數(shù)間充質(zhì)干細胞。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(1)～(3)中采用無血清培養(yǎng)基對所述組織塊進行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基(Sciencell)，無任何動物源蛋白和動物源病原物的污染。由此，從組織塊爬出的間充質(zhì)干細胞狀態(tài)好，增殖能力強，活力高。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了一種間充質(zhì)干細胞。所述間充質(zhì)干細胞是通過前面所述的制備臨床治療用間充質(zhì)干細胞的方法獲得的。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，與已經(jīng)報道的臨床級臍帶間充質(zhì)干細胞制備方法相比：利用本發(fā)明的方法制備獲得的臨床治療用間充質(zhì)干細胞純度高，細胞狀態(tài)好，活性高，分化能力強，干細胞指標(biāo)好，具有很高的臨床應(yīng)用價值。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了前面所述的間充質(zhì)干細胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療組織損傷。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，利用前面所述的本發(fā)明的方法制備的臨床治療用間充質(zhì)干細胞，細胞純度高，活性好，分化能力強，干細胞指標(biāo)好，能夠有效用于制備用于治療組織損傷的藥物，且對組織損傷治療效果突出。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了前面所述的間充質(zhì)干細胞在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療阿爾茨海默病。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，利用前面所述的本發(fā)明的方法制備的臨床治療用間充質(zhì)干細胞，細胞純度高，活性好，分化能力強，干細胞指標(biāo)好，能夠有效用于制備治療阿爾茨海默病的藥物，該藥物對于阿爾茨海默病病理的各指標(biāo)均有很大程度的改善。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，兩種間充質(zhì)干細胞的顯微觀察的形態(tài)圖片，

其中，

圖1A顯示了采用常規(guī)植塊法制備的原代間充質(zhì)干細胞的細胞形態(tài)圖片，

圖1B顯示了采用本發(fā)明的方法經(jīng)第四次重復(fù)培養(yǎng)獲得的原代間充質(zhì)干細胞的細胞形態(tài)圖片；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，實施例1中的優(yōu)化組織塊進行第四次重復(fù)培養(yǎng)時獲得的原代間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)至第3代(P3)的細胞表面標(biāo)志表達情況的圖片；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，實施例1中的優(yōu)化組織塊進行第四次重復(fù)培養(yǎng)時獲得的原代間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)至第3代(P3)時的間質(zhì)細胞標(biāo)記和上皮細胞標(biāo)記表達情況的免疫化學(xué)熒光方法檢測結(jié)果；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，實施例1中的優(yōu)化組織塊進行第四次重復(fù)培養(yǎng)時獲得的原代間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)至第3代(P3)時向成脂、成骨和成軟骨分化情況的圖片；

圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，實施例1中的優(yōu)化組織塊進行第四次重復(fù)培養(yǎng)時獲得的原代間充質(zhì)干細胞傳代培養(yǎng)至第15代(P15)時的核型分析結(jié)果圖；

圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，實施例1中獲得的間充質(zhì)干細胞用于小鼠對照組和MSC治療組的水迷宮結(jié)果分析圖；

圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，實施例1中獲得的間充質(zhì)干細胞用于小鼠對照組和MSC治療組大腦海馬部位和皮層部位阿爾茨海默病相關(guān)分子標(biāo)記物表達結(jié)果分析圖；以及

圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例，實施例1中獲得的間充質(zhì)干細胞用于小鼠對照組和MSC治療組大腦海馬區(qū)和皮層神經(jīng)干細胞關(guān)鍵標(biāo)志物Nestin蛋白表達結(jié)果分析圖。

具體實施方式

下面詳細描述本發(fā)明的實施例。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。

需要說明的是，術(shù)語“第一”、“第二”僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對重要性或者隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個或者更多個該特征。進一步地，在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種制備臨床治療用間充質(zhì)干細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括：

(1)將多個含有間充質(zhì)干細胞的組織塊在第一培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，以便獲得從所述多個組織塊中爬出的間充質(zhì)干細胞，并且從所述多個含有間充質(zhì)干細胞的組織塊中選擇優(yōu)化組織塊；以及

(2)將步驟(1)中所獲得的優(yōu)化組織塊在第二培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，以便獲得從所述優(yōu)化組織塊爬出的間充質(zhì)干細胞，

其中，在步驟(1)中選擇優(yōu)化組織塊的條件包括下列至少之一：

(a)無內(nèi)皮細胞爬出；

(b)有間充質(zhì)干細胞爬出；

(c)間充質(zhì)干細胞最快爬出。

其中，需要說明的是，與普通的間充質(zhì)干細胞相比，臨床治療用間充質(zhì)干細胞，一般對細胞的需求量比較大，對細胞的純度和活性的要求更高，且干性指標(biāo)正常，即細胞的體外的分化能力得到確認，通常臨床用的間充質(zhì)干細胞為P3-P5代的間充質(zhì)干細胞，因此需要提高原代間充質(zhì)干細胞組織的細胞得率，獲得盡可能多的原代間充質(zhì)干細胞，即P0代間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明的培養(yǎng)方法，通過對快速爬出間充質(zhì)干細胞的組織塊進行挑選，并轉(zhuǎn)移到第二培養(yǎng)皿進行繼續(xù)培養(yǎng)，可以分得高純度，無內(nèi)皮細胞污染的原代間充質(zhì)干細胞，從而可以顯著提高間充質(zhì)干細胞的活性和純度。

發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，與已經(jīng)報道的間充質(zhì)干細胞制備方法相比，本發(fā)明的臨床級臍帶間充質(zhì)干細胞制備方法：對臍帶組織的利用率高，尤其，細胞的產(chǎn)率大大提高，能夠進一步滿足臨床應(yīng)用量大的需求；并且制備得到的臨床治療用間充質(zhì)干細胞純度高，細胞狀態(tài)好，活性高，分化能力強，能夠滿足臨床應(yīng)用的功能性質(zhì)量要求。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，含有間充質(zhì)干細胞的組織塊的來源不受特別的限制，可以通過市售直接購買，也可以從臍帶組織中獲得。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述含有間充質(zhì)干細胞的組織塊來源于臍帶組織。其中，從臍帶組織中獲得所述含有間充質(zhì)干細胞的組織塊的方法也不受特別限制，根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述含有間充質(zhì)干細胞的組織塊是通過下列步驟獲得的：剔除臍帶組織的臍動脈和臍靜脈；以及從所述臍帶組織中分離華爾通氏膠，其中，所述華爾通氏膠構(gòu)成所述含有間充質(zhì)干細胞的組織塊。由此，得到的臍帶組織的間充質(zhì)干細胞組織的純度高，內(nèi)皮細胞含量少。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，在步驟(2)之后，進一步包括：(3)將所述優(yōu)化組織塊在第三培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，5-7天后可獲得從所述優(yōu)化組織塊爬出的P0代間充質(zhì)干細胞。由此，該可以獲得較多P0代間充質(zhì)干細胞，對臍帶組織的利用率高。

需要說明的是，步驟(1)中所獲得的從各組織塊中爬出的間充質(zhì)干細胞，以及步驟(2)～(3)中所獲得的從優(yōu)化組織塊中爬出的間充質(zhì)干細胞，均為P0代間充質(zhì)干細胞。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，重復(fù)步驟(3)至少一次，優(yōu)選2～5次。由此，通過重復(fù)培養(yǎng)，實現(xiàn)了優(yōu)化組織塊的多次利用，可以獲得大量的原代間充質(zhì)干細胞，對臍帶組織的利用率顯著提高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，收集步驟(1)～(3)中所獲得的P0代間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)。由此，可以獲得大量的P3-P5代的間充質(zhì)干細胞，從而能夠同時滿足臨床治療用間充質(zhì)干細胞對細胞代數(shù)和數(shù)量的要求。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，用于進行傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基種類不受特別限制，只要能夠有效實現(xiàn)間充質(zhì)干細胞傳代，保證細胞增殖速度，保持傳代細胞的干細胞活性即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，所述傳代培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述傳代培養(yǎng)采用無血清培養(yǎng)基(Sciencell)，無任何動物源蛋白和動物源病原物的污染。由此，細胞增殖速度快，活性高，且能夠保持良好的干細胞活性。并且上述無血清培養(yǎng)基中不含任何動物來源的血清與抗生素，能夠有效降低傳代培養(yǎng)中的異源性蛋白、支原體等污染。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，將所述P0代間充質(zhì)干細胞進行傳代培養(yǎng)，所述傳代的時間間隔為2-4天，并且將所得到的P3～P5代間充質(zhì)干細胞作為臨床治療用間充質(zhì)干細胞。由此，通過細胞的傳代可快速獲得臨床級別數(shù)量的低代數(shù)間充質(zhì)干細胞。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，步驟(1)～(3)中用于對組織塊進行培養(yǎng)的培養(yǎng)基種類不受特別限制，只要能夠有效促進間充質(zhì)干細胞爬出，且爬出的間充質(zhì)干細胞狀態(tài)好，增殖能力強，活力高即可。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，在步驟(1)～(3)中采用無血清培養(yǎng)基對所述組織塊進行培養(yǎng)。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基(Sciencell)，無任何動物源蛋白和動物源病原物的污染。由此，從組織塊爬出的間充質(zhì)干細胞狀態(tài)好，增殖能力強，活力高。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了一種間充干細胞。所述間充質(zhì)干細胞是通過前面所述的制備臨床治療用間充質(zhì)干細胞的方法獲得的。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，與已經(jīng)報道的臨床級臍帶間充質(zhì)干細胞制備方法相比：利用本發(fā)明的方法制備獲得的臨床治療用間充質(zhì)干細胞純度高，細胞狀態(tài)好，活性高，分化能力強，干細胞指標(biāo)好，具有很高的臨床應(yīng)用價值。

其中，需要說明的是，可以直接將間充質(zhì)干細胞用于治療組織損傷或阿爾茨海默病，也可以將以間充質(zhì)干細胞制備的藥物用于治療組織損傷或阿爾茨海默病。

因而，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了前面所述的間充質(zhì)干細胞在制備藥物中的用途，該藥物用于治療組織損傷。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，利用前面所述的方法制備的臨床治療用間充質(zhì)干細胞，細胞純度高，活性好，分化能力強，干細胞指標(biāo)好，能夠有效用于制備用于治療組織損傷的藥物，且對組織損傷治療效果突出。

根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明提供了前面所述的間充質(zhì)干細胞在制備藥物中的用途， 該藥物可以用于治療阿爾茨海默病。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，利用前面所述的方法制備的臨床治療用間充質(zhì)干細胞，細胞純度高，活性好，分化能力強，干細胞指標(biāo)好，能夠有效用于制備治療阿爾茨海默病的藥物，該藥物對于阿爾茨海默病病理的各指標(biāo)均有很大程度的改善。

其中，根據(jù)本發(fā)明的一些具體實施例，在本發(fā)明的用途中，所采用的間充質(zhì)干細胞為第3代至第5代。由此，細胞的活性好，純度高，分化能力強，干細胞指標(biāo)好，從而，臨床治療效果好。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，通過采用該間充質(zhì)干細胞的治療效果明顯優(yōu)于通過其他方式獲得的間充質(zhì)干細胞。

在本文中所使用的術(shù)語“給藥”指將預(yù)定量的物質(zhì)通過某種適合的方式引入病人。本發(fā)明的間充質(zhì)干細胞可以通過任何常見的途徑被給藥，只要它可以到達預(yù)期的組織。給藥的各種方式是可以預(yù)期的，包括腹膜，靜脈，肌肉，皮下，皮層，口服，局部，鼻腔，肺部和直腸，但是本發(fā)明不限于這些已舉例的給藥方式。然而，由于口服給藥時，肽被消化，口服給藥的組合物的活性成分應(yīng)該被包被或被配制以防止其在胃部被降解。優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物可以注射制劑被給藥。此外，本發(fā)明的藥物組合物可以使用將活性成分傳送到靶細胞的特定器械來給藥。

本發(fā)明的藥物組合物的給藥頻率和劑量可以通過多個相關(guān)因素被確定，該因素包括要被治療的疾病類型，給藥途徑，病人年齡，性別，體重和疾病的嚴重程度以及作為活性成分的藥物類型。根據(jù)本發(fā)明的一些實施例，日劑量可分為適宜形式的1劑、2劑或多劑，以在整個時間段內(nèi)以1次、2次或多次給藥，只要達到治療有效量即可。

術(shù)語“治療有效量”是指化合物足以顯著改善某些與疾病或病癥相關(guān)的癥狀的量，也即為給定病癥和給藥方案提供治療效果的量。例如，在阿爾茨海默病治療中，減少、預(yù)防、延緩、抑制或阻滯疾病或病癥的任何癥狀的藥物或化合物應(yīng)當(dāng)是治療有效的。治療有效量的藥物或化合物不需要治愈疾病或病癥，但將為疾病或病癥提供治療，使得個體的疾病或病癥的發(fā)作被延緩、阻止或預(yù)防，或者疾病或病癥的癥狀得以緩解，或者疾病或病癥的期限被改變，或者例如疾病或病癥變得不嚴重，或者加速康復(fù)。

術(shù)語“治療”用于指獲得期望的藥理學(xué)和/或生理學(xué)效果。所述效果就完全或部分預(yù)防疾病或其癥狀而言可以是預(yù)防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病導(dǎo)致的不良作用而言可以是治療性的。本文使用的“治療”涵蓋哺乳動物、特別是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未確診得病的個體中預(yù)防疾病(例如預(yù)防阿爾茨海默病)或病癥發(fā)生；(b)抑制疾病，例如阻滯疾病發(fā)展；或(c)緩解疾病，例如減輕與疾病相關(guān)的癥狀。本文使用的“治療”涵蓋將藥物或化合物給予個體以治療、治愈、緩解、改善、減輕或抑制個體的疾病的任何用藥，包括但不限于將含本文所述間充質(zhì)干細胞的藥物給予有需要的個體。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的間充質(zhì)干細胞或藥物組合物可與常規(guī)治療方法和/或療 法相結(jié)合使用，或者可與常規(guī)治療方法和/或療法分開使用。當(dāng)本發(fā)明的間充質(zhì)干細胞或藥物組合物在采用與其它藥物的聯(lián)合療法中給藥時，它們可序貫地或同時地給予個體?；蛘撸景l(fā)明的藥物組合物可包含本發(fā)明的間充質(zhì)干細胞、藥學(xué)上可接受的載體或藥學(xué)上可接受的賦形劑以及本領(lǐng)域已知的其它治療藥或預(yù)防藥的組合。

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自Gibco公司。

實施例1

以常規(guī)植塊法為對照(具體方法可參見：Nekanti U,Mohanty L,et al.Optimization and scale-up of Wharton’s jelly-derived mesenchymal stem cells for clinical applications.Stem Cell Res.2010；5(3):244–254.，通過參照將其全文并入本文)，根據(jù)本發(fā)明的制備臨床治療用間充質(zhì)干細胞的方法，按照以下步驟制備間充質(zhì)干細胞：

首先，收集XX醫(yī)院新生兒的臍帶組織，用含青霉素和鏈霉素的生理鹽水將無乙肝、梅毒、艾滋病感染的健康的新生兒臍帶組織充分洗凈，去除血污；將臍帶剪成長度均勻的小段，進行機械法分離，鈍性剝離華通氏膠，同時去除臍動脈和臍靜脈；將剝離的華通氏膠均勻剪碎，其中該剪碎的華通氏膠即為包含間充質(zhì)干細胞的組織塊。

接著，將上述獲得的多個包含間充質(zhì)干細胞的組織塊接種于培養(yǎng)皿中，利用無血清培養(yǎng)基(為美國Sciencell公司生產(chǎn)的MSC無血清培養(yǎng)基MSCM-SF，貨號：7511)重懸，置于體積分數(shù)為5％的CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)7-10天，鏡檢挑選出最快爬出MSCs(即間充質(zhì)干細胞)并且無內(nèi)皮細胞爬出的組織塊——即優(yōu)化組織塊。

接下來，將上述篩選獲得的優(yōu)化組織塊轉(zhuǎn)移到新培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，并收集原培養(yǎng)皿中從組織塊爬出的間充質(zhì)干細胞(即P0代間充質(zhì)干細胞)進行傳代培養(yǎng)。其中，優(yōu)化組織塊的培養(yǎng)仍采用上述的無血清培養(yǎng)基，5-7天后可獲得從所述優(yōu)化組織塊爬出的P0代間充質(zhì)干細胞。

進一步，再將所述優(yōu)化組織塊轉(zhuǎn)至新培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)(同樣采用上述的無血清培養(yǎng)基)，以便獲得從所述優(yōu)化組織塊爬出的間充質(zhì)干細胞。

接下來，重復(fù)上述步驟2-5次，以便充分利用所述優(yōu)化組織塊，獲得從優(yōu)化組織快中爬出的間充質(zhì)干細胞。

收集每次培養(yǎng)中從組織塊爬出的P0代間充質(zhì)干細胞，至新培養(yǎng)皿中進行傳代培養(yǎng)，其 中，該傳代培養(yǎng)采用上述的無血清培養(yǎng)基，每2-4天傳代一次，利用該方法可以得到大量的高純度原代MSCs。

對比發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的方法在P0代細胞在得率方面較對照(即常規(guī)植塊法)提高20-50倍，以此得率傳代至臨床用細胞代數(shù)，可級數(shù)增長獲得同一批細胞，完全能夠滿足一個人的多次治療或者多個人的同時治療。且與對照相比，本方法對原代細胞的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，間充質(zhì)干細胞在無血清培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，可以獲得很好的擴增能力，更重要的是，不含任何動物來源血清與抗生素能夠降低異源性蛋白、支原體等污染。利用上述無血清培養(yǎng)基進行間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)，細胞的狀態(tài)好，增殖能力快，活力高。

實施例2

發(fā)明人選取實施例1中的優(yōu)化組織塊進行第4次重復(fù)培養(yǎng)時獲得的原代間充質(zhì)干細胞進行形態(tài)學(xué)檢測和表面分子標(biāo)記物流式檢測，以便確保沒有內(nèi)皮細胞以及其他造血細胞的污染，保證細胞的純度；進行免疫化學(xué)熒光、分化實驗和細胞核型分析檢測，以便確保獲得的原代間充質(zhì)干細胞的質(zhì)量。具體如下：

1、細胞形態(tài)檢測

針對實施例1中的優(yōu)化組織塊進行第4次重復(fù)培養(yǎng)時獲得的原代間充質(zhì)干細胞(即利用本發(fā)明的方法制備的)，以及與本發(fā)明的方法同步的對照獲得的間充質(zhì)干細胞進行形態(tài)檢測，結(jié)果見圖1。如圖1所示，圖A顯示了利用對照“常規(guī)植塊法”獲得的原代MSC出現(xiàn)明顯的內(nèi)皮細胞；而圖B顯示了利用本發(fā)明的方法“優(yōu)化組織塊法”制備的優(yōu)化組織塊經(jīng)第四次重復(fù)培養(yǎng)時獲得的原代MSC，無內(nèi)皮細胞，形態(tài)均一，呈旋渦狀貼壁生長。由此，表明采用本發(fā)明的方法培養(yǎng)制備的間充質(zhì)干細胞的純度和細胞活性明顯優(yōu)于采用常規(guī)植塊法(對照)獲得的間充質(zhì)干細胞。

2、流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)志

利用流式細胞儀對實施例1中利用本發(fā)明的方法獲得的P3代間充質(zhì)干細胞進行表面標(biāo)志檢測，其中該P3代間充質(zhì)干細胞是將通過本發(fā)明的方法制備的優(yōu)化組織塊經(jīng)第4次重復(fù)培養(yǎng)得到的原代間充質(zhì)干細胞，進行傳代培養(yǎng)至P3代獲得的。檢測方法具體如下：

(1)將優(yōu)化組織塊經(jīng)第4次重復(fù)培養(yǎng)得到的原代MSC細胞傳代培養(yǎng)至P3代的細胞，消化后制成單細胞懸液，計數(shù)，按4×10⁵個每管分裝至離心管。

(2)將離心后的細胞用PBS洗一次，300g離心10min，棄上清。

(3)100微升PBS重懸細胞，加入一抗CD3-FITC，CD29-PE，CD73-PE，CD166-PE，CD105-FITC，CD90-PE，CD14-FITC，CD45-PE，HLA-DR-PE，CD38-FITC，CD31-APC，CD34-PE，并設(shè)兩個對照，其中一管為直標(biāo)抗體PE-isotype空白對照，另一管為直標(biāo)抗體FITC-isotype空白對照，然后于4℃搖床避光反應(yīng)40min。

其中，各一抗的加入量如下：

(4)用PBS對反應(yīng)后的細胞清洗3次，每次300g離心10min，1％多聚甲醛固定，4℃下放置，然后進行流式細胞儀檢測(一周之內(nèi)檢測完畢)，檢測結(jié)果見圖2。圖2顯示了細胞的表面標(biāo)志表達情況。如圖2所示，細胞表型均一，細胞表達間質(zhì)細胞標(biāo)記CD73、CD90、CD105、CD29、CD44、CD166，不表達造血細胞標(biāo)記CD3、CD14、CD34、CD38和內(nèi)皮細胞標(biāo)記CD31，且不表達人白細胞抗原HLA-DR，完全符合“國際細胞治療協(xié)會”關(guān)于間充質(zhì)干細胞表面標(biāo)志物規(guī)定的標(biāo)準。

3、免疫熒光染色法檢測細胞表面標(biāo)志

通過免疫熒光染色檢測法對間充質(zhì)干細胞進行染色觀察，具體方法如下：

(1)將實施例1中通過本發(fā)明的方法制備的優(yōu)化組織塊經(jīng)第4次重復(fù)培養(yǎng)得到的原代間充質(zhì)干細胞，傳代培養(yǎng)至P3代以5.0×10³個/孔接種于24孔板，將24孔板中的培養(yǎng)基棄去，用PBS洗滌1～2次。

(2)固定：用新鮮配制(2周內(nèi))的4％多聚甲醛室溫固定15min，冷卻至室溫后用含0.05％Tween-20的PBS洗2次。

(3)破膜：常溫加0.1％triton-x-100破膜10分鐘，PBS洗2次。

(4)封閉：用封閉液(10％山羊血清)室溫封閉30分鐘，吸去封閉液。

(5)一抗孵育：一抗用封閉液稀釋(1:200)，4℃孵育過夜，PBS洗，3×5min。其中一抗包括下列：小鼠抗人a-SMA(Sigma,1:800)，小鼠抗人E-cadherin(BD,1:100)，小 鼠抗人N-cadherin(BD,1:100)，兔抗人CK18(Santa cruz,1:50)。

(6)二抗孵育：加入TRITC/FITC標(biāo)記的IgG二抗(1:100)室溫避光反應(yīng)30min，PBS洗，3×5min。其中二抗包括下列：羅丹明(TRITC)標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1:100)、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，1:100)。

(7)加入室溫反應(yīng)2min，PBS洗，3×5min，第三次PBS留于孔中，置于熒光顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果見圖3。

由圖3可知，間充質(zhì)干細胞表達間質(zhì)細胞標(biāo)記α-SMA和N-cadherin，不表達上皮細胞標(biāo)記CK18，E-cadherin。說明采用本發(fā)明的方法培養(yǎng)制備的間充質(zhì)干細胞是典型的間質(zhì)細胞。

4、免疫化學(xué)熒光檢測細胞分化能力

通過免疫化學(xué)熒光方法對實施例1中第4次重復(fù)培養(yǎng)的原代間充質(zhì)干細胞(即實施例1中通過本發(fā)明的方法制備的優(yōu)化組織塊經(jīng)第4次重復(fù)培養(yǎng)得到的原代間充質(zhì)干細胞)傳代培養(yǎng)至P3代的細胞進行分化能力(包括間充質(zhì)干細胞的成脂肪分化、成骨分化和成軟骨分化)的檢測，具體如下：

4.1誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成脂肪分化

4.1.1誘導(dǎo)分化

將上述的P3代間充質(zhì)干細胞進行誘導(dǎo)分化，具體方法為：以1.0×10⁴個/孔種于24孔板，培養(yǎng)24h后，將細胞分為2組，一組為誘導(dǎo)分化組，將培養(yǎng)基更換為脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基，另一組為對照組，采用的培養(yǎng)基為DMEM-HG(即DMEM高糖培養(yǎng)基)+10％FBS，進行繼續(xù)培養(yǎng)，其中，脂肪誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成份為：DMEM-HG培養(yǎng)基(即DMEM高糖培養(yǎng)基)、10％FBS，10^-6M地塞米松(DEX)、0.5mM IBMX(3-異丁基-1-甲基黃嘌呤)、60微摩爾/升消炎痛和5微克/ml胰島素，每三天換液一次，共誘導(dǎo)2周。

4.1.2鑒定

通過油紅O染色鑒定脂肪分化，具體方法如下：將6ml 0.5％油紅O和4ml蒸餾水，靜置8min，濾紙過濾。將誘導(dǎo)細胞去掉培養(yǎng)基，PBS洗一次，加入4％多聚甲醛固定30min。用蒸餾水洗3次，油紅O染色20min，蒸餾水再洗3次，鏡下觀察，細胞形態(tài)如圖4中的成脂分化圖所示，誘導(dǎo)組出現(xiàn)明顯的脂滴，油紅O染色呈陽性；而對照組無脂滴，油紅O染色呈陽性，說明細胞具有強的向脂肪細胞分化的能力。

4.2誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成骨分化

4.2.1誘導(dǎo)分化

將上述的P3代間充質(zhì)干細胞以5.0×10³個/孔種于24孔板，培養(yǎng)24h后，將細胞分為 2組，一組為誘導(dǎo)分化組，將培養(yǎng)基更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，另一組為對照組，采用的培養(yǎng)基為DMEM-HG+10％FBS，進行繼續(xù)培養(yǎng)，其中，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成份為：高糖DMEM培養(yǎng)基、10％FBS、10^-7M地塞米松(DEX)、50mM維生素C和10微摩爾/升β-磷酸甘油，每三天換液，共誘導(dǎo)5周。

4.2.2鑒定

通過茜素紅染色和硝酸銀染色兩種方法分別鑒定間充質(zhì)干細胞的成骨分化情況，具體方法如下：

(1)茜素紅染色

將經(jīng)成骨誘導(dǎo)2-3周的間充質(zhì)干細胞移除培養(yǎng)基，1×PBS洗滌，用4％多聚甲醛固定30min，然后，將固定后的細胞用1×PBS洗2次，利用Alizarin Red染色5min，然后1×PBS洗3次，光鏡下觀察拍照，細胞形態(tài)如圖4中的成骨分化茜素紅染色圖所示，誘導(dǎo)分化組茜素紅染色呈陽性；而對照組呈陰性，說明細胞具有強的向成骨細胞分化的能力。

(2)硝酸銀染色

成骨誘導(dǎo)4～5周后，細胞去掉培養(yǎng)基后，PBS洗一遍，加入4％多聚甲醛固定20min，去離子水洗3次，每次5min，加入5％AgNO₃水溶液，于強光下反應(yīng)1h，去離子水徹底清洗，5％Na₂S₂O₃.5H₂O水溶液處理1min，以去除多余的銀，充分水洗。光鏡下觀察拍照，細胞形態(tài)如圖4中的成骨分化硝酸銀染色圖所示。誘導(dǎo)分化組經(jīng)染色能夠看到明顯的骨結(jié)節(jié)，而對照組呈陰性，說明細胞具有強的向成骨細胞分化的能力。

4.3誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞成軟骨分化

4.3.1誘導(dǎo)分化

將上述的P3代間充質(zhì)干細胞以3.0×10⁵個鋪于15ml塑料尖底試管，220g低速離心8min，使細胞形成微團，將細胞分為2組，一組為誘導(dǎo)分化組，將培養(yǎng)基更換為軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，另一組為對照組，采用的培養(yǎng)基為DMEM-HG(即DMEM高糖培養(yǎng)基)+10％FBS，進行繼續(xù)培養(yǎng)，其中，軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的成份為：高糖DMEM、2×10^-7M地塞米松(DEX)、50微克/ml維生素C，1×ITS(胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑)(I2521)、10mM丙酮酸鈉、1×P/S(即青霉素/鏈霉素)、50微克/ml脯氨酸和10ng/ml TGF-β3，每4天換液，共誘導(dǎo)5周。

4.3.2鑒定

需要說明的是，MSC形成的微團不能進行正常培養(yǎng)，只有經(jīng)誘導(dǎo)液培養(yǎng)的微團才可以一直保持微團形態(tài)。誘導(dǎo)完畢后，將經(jīng)誘導(dǎo)的細胞進行石蠟包埋和切片。石蠟切片經(jīng)二甲苯5min，二甲苯5min，無水乙醇1min，95％乙醇1min，85％乙醇1min，75％乙醇1min，自來水洗2min，蒸餾水洗2min，脫蠟后經(jīng)HE(蘇木素-伊紅染色)和阿爾辛藍染色鑒定軟骨特異性蛋白聚糖，顯微鏡下進行觀察，細胞形態(tài)如圖4中的成軟骨分化圖所示，“對照組”未 經(jīng)誘導(dǎo)細胞的阿爾辛藍染色呈陰性，而成軟骨分化的細胞經(jīng)阿爾辛蘭染色能夠明顯看到軟骨特異性蛋白聚糖呈陽性，說明細胞具有強的向軟骨細胞分化的能力。

其中，HE是形態(tài)學(xué)觀察，說明誘導(dǎo)后的組織中仍是完整的細胞結(jié)構(gòu)。而阿爾辛藍是針對軟骨特異性蛋白聚糖的特異染色，完全能夠說明分化后的細胞具有軟骨細胞的特性。

上述對獲得的間充質(zhì)干細胞進行分化及分化鑒定的結(jié)果，表明通過本發(fā)明的方法獲得的間充質(zhì)干細胞分化能力強，具有向脂肪、成骨和軟骨方向分化的特性。

5、細胞核型分析

將實施例1中第4次重復(fù)培養(yǎng)的原代間充質(zhì)干細胞((即實施例1中通過本發(fā)明的方法獲得的優(yōu)化組織塊經(jīng)第4次重復(fù)培養(yǎng)得到的P0代間充質(zhì)干細胞))進行傳代培養(yǎng)，根據(jù)細胞的狀態(tài)，每3天傳代一次，待細胞培養(yǎng)到15代時，對細胞進行染色體核型分析，結(jié)果如圖5所示，G-帶核型分析未見異常，與正常核型完全一致，為男性正常核型。

綜上所述，本發(fā)明的間充質(zhì)干細胞制備方法效果顯著，可獲得大量的MSCs，而且簡單易行，成本低，安全性好，對于開發(fā)MSC在臨床上的各種應(yīng)用具有很高的價值。

實施例3臍帶間充質(zhì)干細胞干預(yù)對快速腦老化鼠認知功能障礙的實驗研究

1.材料

1.1研究對象

快速老化小鼠SAMP820只(雄性)。

1.2人臍帶間充質(zhì)干細胞是通過實施例1所述的方法得到的。

1.3實驗儀器及設(shè)備

Morris水迷宮(Morris water maze)的組成：水迷宮由圓形水池、平臺和記錄系統(tǒng)三部分組成。水池直徑150cm，高50cm，隨意將水池分為四個象限(東北、東南、西南和西北象限)。每天實驗開始，水池注水30cm深，并加入1斤奶粉，使水成不透明乳白色，水溫保持在21℃±1℃左右。水池四周存在豐富的空間參照物(門、燈、桌椅、攝像頭及實驗者等)，且位置保持不變，以供小鼠定為平臺。圓柱形平臺直徑6cm，高29cm，置于任一象限中央，平面沒于水面下1cm。攝像頭置于水池中央的上方1.5m處，自動采集動物游泳圖像，所收集信號直接輸入計算機，由圖像自動采集和分析系統(tǒng)自動分析和處理，包括動物的逃避潛伏期、游泳路徑、不同象限的停留時間、初始角度及游泳路線的長度、搜索策略及中、外環(huán)游泳距離百分比等參數(shù)。

2.方法

2.1動物分組

小鼠隨機分為對照組(注射生理鹽水)、MSC治療組，每組10只，MSC的給藥劑量為5×10⁶hUC-MSCs/只,腹腔注射。模型組及空白對照組給予等體積的生理鹽水。10周后進行行為 學(xué)測試。

2.2行為學(xué)測試

主要包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分

定位航行試驗

歷時5天，每天將小鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中1次，記錄其尋找到隱藏在水面下平臺的時間(逃避潛伏期)。

空間探索試驗

是在定位航行試驗后去除平臺，隨機選取一個入水點后，將小鼠依次從該入水點放入水池中，記錄其在一定時間內(nèi)的游泳軌跡，考察小鼠對原平臺的記憶。

2.3數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準差(x±S)，表示，定位航行實驗所獲得的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的雙因素方差分析(two-way ANOVA)。在空間探索實驗樣本間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)。檢驗水準定位P＜0.05為差異有顯著性。結(jié)果如圖6所示。

圖6.A是水迷宮實驗中小鼠的逃避軌跡；圖6.B是定位航行實驗中第3、4、5天小鼠逃避潛伏期；圖6.C空間探索實驗中第6天，小鼠穿臺次數(shù)。由圖6可以看出，加入MSC治療，從第三天開始收集數(shù)據(jù)進行分析，可發(fā)現(xiàn)在數(shù)據(jù)收集的第3、4、5天后的小鼠的逃避潛伏期相比PBS注射組有明顯縮短的趨勢，MSC治療小組小鼠的逃避軌跡有著明顯的徑向性和目的性。在空間探索實驗中也可以看到，治療組小鼠的穿臺次數(shù)增。以上結(jié)果表明，MSC確實有改善模型小鼠空間記憶的作用。

實施例4臍帶間充質(zhì)干細胞干預(yù)對快速腦老化鼠中阿爾茨海默病相關(guān)分子標(biāo)記物影響的研究1.材料

1.1研究對象

快速老化小鼠SAMP812只(雄性)。

1.2人臍帶間充質(zhì)干細胞是通過實施例1所述的方法得到的。

2.方法

2.1標(biāo)本準備：

2.1.1用于免疫組化取材：最后1次Morris水迷宮測試24h后，小鼠用1％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射，麻醉后立即開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至主動脈，同時剪開右心耳，快速灌注生理鹽水，至肝臟變白改灌注液為4％多聚甲醛，灌注時間約30min，見小鼠尾巴、四肢僵硬視為滿意；灌注完畢后斷頭取腦，投入4％多聚甲醛溶液中過夜，脫水后，石蠟包埋。

2.1.2提取大腦皮層和海馬蛋白：最后1次Morris水迷宮測試24h后，小鼠用1％戊 巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射，麻醉后立即開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至主動脈，同時剪開右心耳，快速灌注生理鹽水，至肝臟變白后斷頭取腦。參照小鼠腦立體定位圖譜分離海馬和大腦皮層。分別至于EP管中，每管加入500微升Ripa+1％PI置于4℃裂解過夜。然后3000轉(zhuǎn)/離心20分鐘，吸取上清并用分光光度儀測量濃度，置于-80℃保存。

2.2檢測

2.2.1免疫組化：取小鼠大腦石蠟標(biāo)本，以4％多聚甲醛固定15min，PBS洗2min×3次。再加蒸餾水新鮮配置0.5％H₂O₂，室溫30min以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶。雙氧水洗2min×3次。滴加正常山羊血清，室溫20min。甩去多余液體，不洗。分別滴加一抗BACE(1∶800)，一抗GSK-3β(1∶800)，一抗P-tau(1∶800)，以PBS代替一抗作陰性對照，37℃下孵育1h，PBS洗2min×3次。滴加生物素化二抗IgG(山羊抗兔)37℃30min。PBS洗2min×3次。滴加SABC，20～37℃20min。PBS洗5min×4次。DAB顯色。蒸餾水反復(fù)洗滌。脫水，透明，封片。標(biāo)本于顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.2.2蛋白免疫印跡：取海馬區(qū)的蛋白，進行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育之后進行顯影。

結(jié)果如圖7所示，

圖7.A是鼠海馬區(qū)和大腦皮層內(nèi)的P-Tau表達；圖7.B是鼠海馬區(qū)和大腦皮層內(nèi)的GSK-3β表達；圖7.C是鼠海馬區(qū)內(nèi)的BACE的表達；圖7.D是蛋白免疫印跡結(jié)果，鼠海馬區(qū)內(nèi)的APP和P-tau蛋白表達。由圖7可以看出，經(jīng)MSC治療的快速腦老化小鼠中與Aβ形成老年斑相關(guān)的BACE1限速酶，引起Aβ聚集的GSK-3β都下降明顯，引起神經(jīng)元纖維纏結(jié)的P-tau蛋白也在經(jīng)過MSC治療的快速腦老化小鼠中出現(xiàn)了下降，而蛋白免疫印跡的結(jié)果也顯示只用PBS治療的快速腦老化小鼠的APP蛋白表達相比MSC治療小鼠組增加，而經(jīng)MSC治療的快速腦老化小鼠中P-tau蛋白的下調(diào)，表明MSC的治療一定程度上可以緩解引起阿爾茨海默病最主要的兩個病理特征。

實驗例5臍帶間充質(zhì)干細胞干預(yù)提高快速腦老化鼠中海馬和皮層的神經(jīng)干細胞關(guān)鍵標(biāo)志表達

1.材料

1.1研究對象

快速老化小鼠SAMP820只(雄性)。

1.2人臍帶間充質(zhì)干細胞是通過實施例1所述的方法得到的。

2.方法

2.1標(biāo)本準備：

2.1.1用于免疫組化取材：最后1次Morris水迷宮測試24h后，小鼠用1％戊巴比妥 鈉50mg/kg腹腔注射，麻醉后立即開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至主動脈，同時剪開右心耳，快速灌注生理鹽水，至肝臟變白改灌注液為4％多聚甲醛，灌注時間約30min，見小鼠尾巴、四肢僵硬視為滿意；灌注完畢后斷頭取腦，投入4％多聚甲醛溶液中過夜，脫水后，石蠟包埋。

2.1.2提取大腦皮層和海馬蛋白：最后1次Morris水迷宮測試24h后，小鼠用1％戊巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射，麻醉后立即開胸暴露心臟，經(jīng)左心室插管至主動脈，同時剪開右心耳，快速灌注生理鹽水，至肝臟變白后斷頭取腦。參照小鼠腦立體定位圖譜分離海馬和大腦皮層。分別至于EP管中，每管加入500微升Ripa+1％PI置于4℃裂解過夜。然后3000轉(zhuǎn)/離心20分鐘，吸取上清并用分光光度儀測量濃度，置于-80℃保存。

2.2檢測方法

2.2.1免疫組化：取小鼠海馬區(qū)石蠟標(biāo)本，以4％多聚甲醛固定15min，PBS洗2min×3次。再加蒸餾水新鮮配置0.5％H₂O₂，室溫30min以滅活內(nèi)源性過氧化氫酶。雙氧水洗2min×3次。滴加正常山羊血清，室溫20min。甩去多余液體，不洗。滴加一抗Nestin(1∶800)，以PBS代替一抗作陰性對照，37℃下孵育1h，PBS洗2min×3次。滴加生物素化二抗IgG(山羊抗兔)37℃30min。PBS洗2min×3次。滴加SABC，20～37℃20min。PBS洗5min×4次。DAB顯色。蒸餾水反復(fù)洗滌。脫水，透明，封片。標(biāo)本于顯微鏡下觀察結(jié)果。

2.2.2蛋白免疫印跡：取海馬區(qū)或者是大腦皮層的蛋白，進行電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育之后進行顯影。

結(jié)果如圖8所示，圖8.A顯示對比治療對照組，MSC治療組在海馬區(qū)和大腦皮層內(nèi)Nestin陽性細胞數(shù)目增多，細胞密集，胞體肥大，伸出長短不一、粗細各異的突起；

圖8.B顯示對比治療對照組，MSC治療組促進海馬區(qū)和大腦皮層內(nèi)Nestin陽性的神經(jīng)干細胞的增殖，可見細胞呈卵圓形、三角形或梭形，胞漿呈棕黃色，胞核為藍色；

圖8.C顯示蛋白免疫印跡結(jié)果，相比治療對照組，MSC治療可提高海馬區(qū)及大腦皮層的Nestin蛋白表達

綜上，由圖8可以看出，經(jīng)MSC治療的快速腦老化小鼠的大腦皮層與海馬區(qū)中Nestin陽性細胞數(shù)目增多，細胞密集，而對大腦皮層與海馬區(qū)的蛋白免疫印跡結(jié)果也顯示nestin蛋白的上調(diào)，表明MSC的治療一定程度上可以促進誘導(dǎo)神經(jīng)干細胞的激活。

傳統(tǒng)方法獲得臍帶間充質(zhì)干細胞主要存在的問題有：首先，數(shù)量受到很大限制，因為傳統(tǒng)方法所獲細胞得率較低，同時間充質(zhì)干細胞本身存在代數(shù)的限制(一般為3-5代用于臨床治療)，這使得干細胞在實際應(yīng)用過程中其數(shù)量成為首要解決的問題。其次，質(zhì)量問題，因為傳統(tǒng)方法獲得的細胞純度和均一性仍然存在不足，也會影響其干性的維持；再加上數(shù)量不足而不能滿足每次治療所需的細胞數(shù)從而導(dǎo)致治療的效果不明顯甚至沒有效果，例如，為了 確保每次輸注足夠數(shù)量的細胞，經(jīng)常發(fā)生同一個體輸注不同來源的臍帶間充質(zhì)干細胞產(chǎn)品，產(chǎn)品之間的均一性和穩(wěn)定性不能保證，這樣會直接影響治療效果的穩(wěn)定和評估，輸注不同個體來源的臍帶間充質(zhì)干細胞也增加了很多未知的治療隱患。另外，傳統(tǒng)方法所獲得的細胞由于上述問題也會增加更多經(jīng)濟負擔(dān)。而通過我們的方法獲得的臍帶間充質(zhì)干細胞是針對應(yīng)用的臨床級臍帶間充質(zhì)干細胞，其突出特點是細胞的產(chǎn)率高，與傳統(tǒng)方法相比至少提高8-10倍，更重要的是，細胞活性高，純度高，分化能力強，穩(wěn)定性和均一性大大提高，也就是說，數(shù)量和質(zhì)量的提高對于臨床需求是最重要的。另外，利用優(yōu)化的方法本身也能大大降低成本和經(jīng)濟負擔(dān)。因此，通過我們的方法所獲得的臍帶間充質(zhì)干細胞對于臨床應(yīng)用較傳統(tǒng)方法相比具有非常明顯的優(yōu)勢。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。