本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因技術(shù)和動(dòng)物疾病模型的構(gòu)建方法，具體地說，涉及一種轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌營養(yǎng)不良模型的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

人類疾病的動(dòng)物模型是指各種醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中建立的具有人類疾病模擬表現(xiàn)的動(dòng)物。在對(duì)人類疾病的研究中,適合的疾病動(dòng)物模型為探索致病機(jī)理的研究提供了重要的理論依據(jù)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的使用，促進(jìn)了臨床經(jīng)驗(yàn)的積累及藥物開發(fā)的同時(shí)，避免了人體實(shí)驗(yàn)造成的風(fēng)險(xiǎn)和倫理問題。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型分為自發(fā)性動(dòng)物模型和誘發(fā)性動(dòng)物模型。其中誘發(fā)性動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)條件容易控制，重復(fù)性好，在短時(shí)間內(nèi)可誘導(dǎo)出大量疾病模型，更適于藥物篩選、毒理、病理等研究。

Ullrich型先天性肌營養(yǎng)不良是Ⅵ型膠原完全缺失或部分缺失所引起的先天性肌營養(yǎng)不良。主要發(fā)病地區(qū)是北美和日本，嚴(yán)重的Ullrich型先天性肌營養(yǎng)不良病人，需要輔助呼吸，無法學(xué)會(huì)行走。Ⅵ型膠原是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，在大多數(shù)人體組織的細(xì)胞外基質(zhì)中廣泛表達(dá)。它由α1、α2和α3三條不同的肽鏈組成。在骨骼肌中,Ⅵ型膠原與基底膜的主要組分Ⅳ型膠原相互作用,起到將肌細(xì)胞基底膜錨定于周圍結(jié)締組織的作用。

目前對(duì)于Ullrich型先天性肌營養(yǎng)不良的標(biāo)準(zhǔn)治療方式是輔助呼吸，通過輔助呼吸可以將病人的壽命從青年延長(zhǎng)至成年。而對(duì)于肌肉痙攣和早期的脊柱彎曲的治療是本病治療的難點(diǎn)。目前尚未發(fā)現(xiàn)可用于治療的分子靶標(biāo)。

為構(gòu)建肌營養(yǎng)不良小鼠模型，意大利帕多瓦大學(xué)通過基因敲除的方法制備出collagenVIα1敲除鼠。但是該基因的雙敲鼠外觀表現(xiàn)正 常。組織切片分析可見少量肌纖維出現(xiàn)壞死，肌纖維的大小變化幅度增大，并且在一定的區(qū)域內(nèi)，會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核居中的現(xiàn)象。collagenVIα1敲除鼠中肌纖維基底膜是完整的，與人類Ullrich型先天性肌營養(yǎng)不良截然不同，因此無法作為此類疾病的模型動(dòng)物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌營養(yǎng)不良模型的構(gòu)建方法。

為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌營養(yǎng)不良模型的構(gòu)建方法，其是將表達(dá)載體pTet-On-α-actin和pTRE2-29分別通過受精卵原核顯微注射的方式制備轉(zhuǎn)基因小鼠，然后通過pTet-On轉(zhuǎn)基因小鼠與pTRE2轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，即得到在子代中特異性表達(dá)rtTA基因，并且在強(qiáng)力霉素存在時(shí)表達(dá)microRNA29a和microRNA29b1的小鼠。

其中，表達(dá)載體pTet-On-α-actin是以pTet-On為骨架載體，將pTet-On中的Pcmv啟動(dòng)子替換成α-actin啟動(dòng)子；表達(dá)載體pTRE2-29是以pTRE2為骨架載體，將microRNA29a和microRNA29b1的編碼序列串聯(lián)到Pminicmv下游。

本發(fā)明構(gòu)建的表達(dá)載體pTet-On-α-actin和pTRE2-29的核苷酸序列分別如Seq ID No.1和2所示。

小鼠出生后即飼喂母鼠強(qiáng)力霉素，通過母鼠的乳汁實(shí)現(xiàn)仔鼠中microRNA29a和microRNA29b1的過表達(dá)。

本發(fā)明利用Tet-on系統(tǒng)與轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建了可以在肌肉內(nèi)特異性誘導(dǎo)表達(dá)microRNA29a和microRNA29b1的轉(zhuǎn)基因小鼠，該轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后開始過表達(dá)microRNA29a和microRNA29b1。對(duì)該類轉(zhuǎn)基因鼠的體重進(jìn)行記錄發(fā)現(xiàn)，從小鼠出生第三天到兩月齡，轉(zhuǎn)基因鼠的體重均顯著低于對(duì)照組，由于骨骼肌不能正常發(fā)育，導(dǎo)致部分小鼠會(huì)出現(xiàn)脊柱彎曲。

與Ullrich型先天性肌營養(yǎng)不良的表現(xiàn)相同，本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在生長(zhǎng)過程中也存在嚴(yán)重的呼吸問題，約17％的小鼠會(huì)在斷乳前由于呼吸障礙而死亡。

本發(fā)明首次建立了轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌營養(yǎng)不良模型，可作為人Ullrich型先天性肌營養(yǎng)不良的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，為人Ullrich型先天性肌營養(yǎng)不良的治療與研究提供了有力的工具。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例3中轉(zhuǎn)基因鼠(29過表達(dá))與對(duì)照組小鼠的體重比較結(jié)果。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例3中轉(zhuǎn)基因鼠(29過表達(dá))與對(duì)照組小鼠脛骨前肌蘇木精伊紅染色結(jié)果。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3中轉(zhuǎn)基因鼠(29過表達(dá))與對(duì)照組小鼠脛骨前肌馬松染色結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。

實(shí)施例1表達(dá)載體的構(gòu)建

分別構(gòu)建表達(dá)載體pTet-On-α-actin和pTRE2-29。表達(dá)載體pTet-On-α-actin是以pTet-On為骨架載體，將pTet-On中的Pcmv啟動(dòng)子替換成α-actin啟動(dòng)子。表達(dá)載體pTRE2-29是以pTRE2為骨架載體，將microRNA29a和microRNA29b1的編碼序列串聯(lián)到Pminicmv下游。

構(gòu)建得到的表達(dá)載體pTet-On-α-actin和pTRE2-29的核苷酸序列分別如Seq ID No.1和2所示。

實(shí)施例2原核顯微注射制備轉(zhuǎn)基因小鼠

將實(shí)施例1構(gòu)建的表達(dá)載體分別通過受精卵原核顯微注射的方式(Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA，Gordon，Proc Natl Acad Sci U S A)制備轉(zhuǎn)基因小鼠，然后通過pTet-On轉(zhuǎn)基因小鼠與pTRE2轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行的雜交，得到在子代中特異性表達(dá)rtTA基因，并且在強(qiáng)力霉素存在時(shí)表達(dá)microRNA29a和microRNA29b1的小鼠，即為轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌營養(yǎng)不良模型。

實(shí)施例3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的驗(yàn)證

實(shí)施例2的小鼠出生后即飼喂母鼠強(qiáng)力霉素，通過母鼠的乳汁實(shí)現(xiàn)仔鼠出生后開始microRNA29a和microRNA29b1的過表達(dá)(參見Post-transcriptional Regulation of Keratinocyte Progenitor Cell Expansion,Differentiation and Hair Follicle Regression by miR-22，PLoS Genet，2015)，并對(duì)小鼠的體重、運(yùn)動(dòng)能力及呼吸狀況進(jìn)行觀察和記錄。由圖1結(jié)果可知轉(zhuǎn)基因鼠的體重均顯著低于對(duì)照組(以含有pTet-On或pTRE2的轉(zhuǎn)基因鼠作為對(duì)照)。

為了進(jìn)一步說明上述構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠骨骼肌營養(yǎng)不良模型是良好的Ullrich型先天性肌營養(yǎng)不良的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對(duì)小鼠的膈肌和脛骨前肌進(jìn)行了取材和組織切片及蘇木精伊紅染色、馬松染色和Laminin免疫熒光檢測(cè)，由圖2和圖3可知，本發(fā)明構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠模型肌纖維發(fā)育不良。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。