本發(fā)明屬于治療性生物制劑領(lǐng)域，涉及一種新型羧基末端肽及長效白介素-7。
背景技術(shù)：
：人白介素7(IL-7)于1988年確認(rèn)并定位于染色體8q12-13。人IL-7蛋白含有六個外顯子，小鼠IL-7為5個外顯子，分子量約為25kDa，人比小鼠多的為第5個外顯子，并多了17個氨基酸。IL-7主要由非造血基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生，包括成纖維網(wǎng)狀細(xì)胞、淋巴器官的T細(xì)胞區(qū)、骨髓基質(zhì)細(xì)胞、主要組織相容性復(fù)合體(MHC)、(MHC)Ⅱ類+胸腺上皮細(xì)胞、肝和腸上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、濾泡樹突狀細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，DC細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也可產(chǎn)生少量的IL-7。IL-7分布廣泛，絕大多數(shù)器官包括大腦均表達(dá)。因?yàn)镮L-7存在于大多數(shù)組織內(nèi)，并且?guī)缀跛械耐庵躎細(xì)胞均表達(dá)IL-7受體，最近研究表明IL-7通過一個簡單的IL-7R介導(dǎo)的反饋回路直接控制信號傳導(dǎo)和激活。IL-7由153個氨基酸組成，含有三個二硫鍵，三個N糖基化，一個O糖基化位點(diǎn)。IL-7是γc家族細(xì)胞因子，與細(xì)胞表面IL-7受體復(fù)合物結(jié)合，α鏈(IL-7R,CD127)和γ鏈(CD132)共同形成的受體復(fù)合物。其中CD127為IL-7和胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)共同受體，而CD132為IL-7和IL-2,IL-4,IL-9,IL-15和IL-21共同使用。IL-7二聚體受體在效應(yīng)T細(xì)胞和記憶T細(xì)胞上高表達(dá)，該受體也在單核細(xì)胞、DC細(xì)胞、發(fā)育中的B細(xì)胞和T細(xì)胞上表達(dá)，但是不在成熟的B細(xì)胞上表達(dá)。人IL-7能夠結(jié)合鼠IL-7受體，并能夠通過該受體傳導(dǎo)信號，反之亦然。刺激的IL-7R激活Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活(JAK/STAT主要是JAK1，JAK3和STAT5)，轉(zhuǎn)錄因子(JAK/STAT主要JAK1，JAK3，STAT5)，Src家族激酶和磷脂酰肌醇3-激酶信號通路(phosphatidylinositol3-kinase(PI3K-AKT)signalingpathways)。IL-7是免疫調(diào)節(jié)和免疫增強(qiáng)的重要細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)的各個階段均起作用，從骨髓基質(zhì)細(xì)胞，到胸腺，再到外周血的各種效應(yīng)細(xì)胞，都可見IL-7的作用。在B細(xì)胞分化的某些階段、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的存活、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)等多方面都發(fā)揮著重要作用。因此認(rèn)為IL-7是記憶T細(xì)胞產(chǎn)生和維持的關(guān)鍵因素之一。在造血干細(xì)胞向淋巴細(xì)胞分化和T細(xì)胞的陰陽性選擇中有重要作 用，還可以使初始T細(xì)胞活化后經(jīng)過多輪擴(kuò)增變成效應(yīng)T細(xì)胞。研究表明，IL-7能夠增強(qiáng)CD4+效應(yīng)T細(xì)胞作用，并促使具有IL-7受體的效應(yīng)T細(xì)胞發(fā)展成為長期存活的記憶T細(xì)胞。在胸腺發(fā)育早期對IL-7的需求是因?yàn)镮L-7有利于Rag-1基因的表達(dá)，該基因是TCR重組必須的。Il-7對T細(xì)胞發(fā)育至關(guān)重要，參與T細(xì)胞的陰陽性選擇，并促進(jìn)T細(xì)胞受體(TCR)β,γ和δ基因重排。對于γδT細(xì)胞的分化發(fā)育，IL-7是必不可少的。另外，IL-7也能促進(jìn)記憶細(xì)胞反向分化成效應(yīng)CD4+和CD8+細(xì)胞。另外，IL-7也能促進(jìn)記憶細(xì)胞反向分化成效應(yīng)CD4+和CD8+細(xì)胞。IL-7對于B細(xì)胞的發(fā)育也很重要，尤其是pre-pro-B細(xì)胞發(fā)育成B細(xì)胞。IL-7對B淋巴系細(xì)胞發(fā)育的作用首先是與分泌IL-7的骨髓基質(zhì)細(xì)胞作用，在V、D、J重排過程中也發(fā)揮作用。IL-7使Igu鏈成功表達(dá)，并與替代輕鏈、Igα和Igβ的信號亞單位結(jié)合形成B細(xì)胞受體(pre-BCR)，pre-BCR促使一群大的pre-B細(xì)胞(pre-BIIcells)產(chǎn)生和擴(kuò)增。隨著年齡的增長，胸腺退化，對淋巴細(xì)胞從胸腺向外周血轉(zhuǎn)移初始T細(xì)胞的能力顯著降低。與初始T細(xì)胞相比，當(dāng)記憶細(xì)胞針對回憶性抗原的免疫能力增強(qiáng)，但是會限制其針對新抗原的免疫能力。因此，IL-7作用于前T細(xì)胞的生物活性大小與年齡相反的，越小越強(qiáng)。homeostaticperipheralexpansion(HPE)是指在去除或部分去除T細(xì)胞的宿主上過繼移植T細(xì)胞或?qū)κＳ嗟腡細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的方式來重構(gòu)T細(xì)胞數(shù)量和功能的手段。在HPE中，低親和力的抗原作用更大，因?yàn)樵诹馨图?xì)胞減少的情況下，T細(xì)胞針對廣譜抗原的擴(kuò)增便于維持足夠T細(xì)胞受體(TCR)的豐度。IL-7水平提高介導(dǎo)T細(xì)胞針對自身抗原提供持續(xù)的刺激信號擴(kuò)增，這種信號就是低親和力抗原刺激T細(xì)胞受體的信號。對于透析所致的淋巴細(xì)胞減少，HIV所致的淋巴細(xì)胞CD4+減少，骨髓移植等淋巴細(xì)胞減少或者由于治療自身免疫性疾病采用了單抗而導(dǎo)致T細(xì)胞減少的情況，IL-7可以增加TCR的多樣性和T細(xì)胞數(shù)量。另外，抗凋亡效應(yīng)是IL-7生物活性的重要貢獻(xiàn)，IL-7通過上調(diào)Bcl-2和Mcl-1提供抗凋亡信號，抑制前凋亡信號，如BAX或BIM，便于維持長期記憶性T細(xì)胞。IL-7的受體在體內(nèi)廣泛分布，為α鏈(IL-7R,CD127)和γ鏈(CD132)共同形成的受體復(fù)合物。IL-7R可以反饋調(diào)節(jié)IL-7的濃度。因?yàn)镃D132的表達(dá)基本上是恒定的，所以它能夠過調(diào)節(jié)CD127的表達(dá)量來調(diào)節(jié)IL-7的受體表達(dá)量，從而調(diào)節(jié)IL-7的功能。但T細(xì)胞數(shù)量正常時，IL-7信號降低CD127在成熟T細(xì)胞表面的表達(dá)，這種下調(diào)或許可以提高有限數(shù)量的IL-7作用于更多的T細(xì)胞。IL-7下調(diào)CD127的表達(dá)也可以限制T細(xì)胞的無限制分化。因此，動態(tài)調(diào)節(jié)CD127的表達(dá)在效應(yīng)T細(xì)胞向記憶T細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中至關(guān)重要。IL-7注射于正常小鼠時，會導(dǎo)致外周淋巴器官的T細(xì)胞增加，當(dāng)注射到環(huán)磷酰胺使淋巴細(xì)胞減少或在骨髓移植中全身照射小鼠，會加速T細(xì)胞的恢復(fù)而使脾臟和淋巴結(jié)的T細(xì)胞增 加。這些研究為IL-7對胸腺依賴或非胸腺依賴的免疫重構(gòu)提供了依據(jù)。IL-7治療可以提高免疫反應(yīng)，尤其可以大幅度提高對低親和性或弱的免疫原的反應(yīng)。由于自身抗原—腫瘤抗原沒有免疫原性或免疫原性很弱，IL-7的上述特征使得其成為一種針對腫瘤免疫治療的極具可能的潛在佐劑。目前，艾滋病、肝炎和結(jié)核病(HIV、HBV、HCV、TB)等疾病在我國甚至全世界都是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題；并且隨著人口老齡化，腫瘤患病率越來越高。目前，IL-7作為治療慢性病毒性感染疾病、結(jié)核感染和腫瘤的備選藥物或佐劑，開展了多達(dá)27項(xiàng)相關(guān)的臨床試驗(yàn)，應(yīng)用前景光明。接受IL-7治療的病人顯示CD4+和CD8+的數(shù)量都增加，有劑量效應(yīng)關(guān)系，并伴隨著T細(xì)胞循環(huán)加快。淋巴細(xì)胞的增加與年齡關(guān)系不大，然而幼稚T細(xì)胞尤其幼稚CD8+T細(xì)胞最先誘導(dǎo)進(jìn)入循環(huán)，因此他們的數(shù)量比記憶性細(xì)胞的數(shù)量多。TCR譜測定顯示；IL-7治療后，T細(xì)胞受體豐度大大增加，選擇性的增加了高表達(dá)CD127的群落。CD4+和CD8+T亞群的增加是對IL-7劑量依賴性的。在一些病人中，骨髓中的前B細(xì)胞增加，但是在外周循環(huán)并不出現(xiàn)這種增加。與對照組相比，沒有顯示針對惡性腫瘤的抗原增加了免疫反應(yīng)性，但是相關(guān)數(shù)據(jù)比較少，還需進(jìn)一步驗(yàn)證。HIV病毒的細(xì)胞毒性結(jié)合對細(xì)胞的其他間接性的影響，如慢性活化免疫系統(tǒng)導(dǎo)致消耗T細(xì)胞庫，不完全恢復(fù)失去的T細(xì)胞等使CD4+T細(xì)胞逐漸消失，導(dǎo)致針對特異性免疫反應(yīng)的能力缺失。IL-7能提高HIV-1特異性CD8+的分化和細(xì)胞毒殺傷活性(CTL)。由于IL-7治療能夠提高CD4+，所以可作為治療HIV的候選藥物或佐劑。也能提高用HIV-1膜蛋白免疫后的CD4+T細(xì)胞的體液免疫，提高α干擾素抗HIV復(fù)制的作用，還可以提高CD4+和CD8+T細(xì)胞的抗凋亡的能力。HIV感染者PBMC體外培養(yǎng)證明IL-7能夠增強(qiáng)HIV復(fù)制能力，并且提高CXCR4和CXCR5受體的表達(dá)，使HIV更容易進(jìn)入細(xì)胞。IL-7用于腫瘤治療的機(jī)制在于是：1.在化療后可以使用IL-7來重構(gòu)免疫系統(tǒng)；2.通常在使用藥物化療后，淋巴細(xì)胞減少，T細(xì)胞數(shù)量也減少，尤其是CD4+細(xì)胞，免疫細(xì)胞低于正常值長達(dá)數(shù)月至數(shù)年。一種策略是利用過繼性免疫治療技術(shù)，將細(xì)胞在體外激活和擴(kuò)增，然后回輸給患者，這種策略也可用在放射性病人或化療后的病人。重構(gòu)腫瘤病人免疫系統(tǒng)，使用IL-7治療年齡越小越好，因?yàn)樾『⒕哂挟a(chǎn)生初始T細(xì)胞譜的能力更強(qiáng)，并且比成人更完善。通過糖基化來延長半衰期：Ceaglio等通過定點(diǎn)突變的方法將一段N糖基化共有序列插入到干擾素分子的不同位置，構(gòu)成4N和5N-干擾素的變異體，使得分子大小和電荷數(shù)均有所增加，后者的生物學(xué)活性與未突變的重組人干擾素-α2活性相當(dāng)，但降低了腎臟對干擾素的清除作用，延長了半衰期。人絨毛膜促性腺激素(HCG)-β亞單羧基端肽(CTP)：HCG是由胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，它是由α和β二聚體的糖蛋白組成。HCG-β末端比人黃體生成素末端多37個氨基酸。常用其中的一部分融合其他蛋白，增加其半衰期(WO/2014/080401A2)。CTP蛋白具有延長融合蛋白在體內(nèi)半衰期的作用，不影響被融合蛋白的生物活性，并且來源于人體，不會產(chǎn)生抗體。為了增加蛋白的分子量，可以在同一蛋白上融合一個或多個CTP蛋白，可在蛋白的N端融合，也可在蛋白的C端融合。有研究表明融合多個CTP也不影響蛋白的結(jié)構(gòu)，且效果更好。CTP與促卵泡激素或生長激素融合的蛋白，在體內(nèi)沒發(fā)現(xiàn)免疫性，并且與促卵泡激素融合的蛋白已經(jīng)在歐洲獲得批號，融合CTP蛋白的生長激素也在進(jìn)行二期實(shí)驗(yàn)。常用的流式細(xì)胞儀篩選高表達(dá)細(xì)胞株的方法：直接針對分泌蛋白的：微膠滴法(Gelmicrodrops)、親和捕獲術(shù)(Affinitycapturesurfacedisplay，ACSD)、分泌捕獲技術(shù)(Secretionandcapturetechnology，SECANTTM)和冷凍捕獲法等，但這些方法不是很準(zhǔn)確，檢測指標(biāo)和是否是高表達(dá)細(xì)胞株相關(guān)性較低。流式細(xì)胞儀對于細(xì)胞分泌性蛋白檢測效果不好，而針對膜蛋白檢測效果較好。如目的蛋白協(xié)同表達(dá)某一膜蛋白，用流式細(xì)胞儀針對膜蛋白分選，則可獲得高表達(dá)細(xì)胞。IRES原件采用5’端介導(dǎo)翻譯機(jī)制，可以較低效率的翻譯其后面的蛋白。人CD20不在CHO細(xì)胞上表達(dá)，通過IRES元件把CD20與目的蛋白核酸序列結(jié)合，基因表達(dá)盒如附圖1所示。轉(zhuǎn)錄于同一mRNA上，所以轉(zhuǎn)錄水平是一致的，但可翻譯成不同的蛋白，目的蛋白分泌在培養(yǎng)液中，CD20在細(xì)胞膜上，這樣可以通過檢測CD20來評估目的蛋白的表達(dá)情況，篩選出表達(dá)量高的細(xì)胞株。屬于同一mRNA的CD20的表達(dá)量與目的蛋白表達(dá)量是線性相關(guān)的，可反應(yīng)同一mRNA的翻譯情況，所以其既可以作為流式細(xì)胞儀篩選標(biāo)記，同時又能反映細(xì)胞目的蛋白表達(dá)水平。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是不受特異性抗體的限制，可以篩選目前還沒有抗體的蛋白質(zhì)。鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的首要發(fā)明目的在于提出一種新型的羧基末端肽。本發(fā)明的第二發(fā)明目的在于提出一種長效白介素-7。本發(fā)明的第三發(fā)明目的在于提出該長效白介素-7的應(yīng)用。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，采用的技術(shù)方案為：本發(fā)明涉及一種羧基末端肽，該羧基末端肽上具有N-糖基化位點(diǎn)，該N-糖基化位點(diǎn)可設(shè) 置于羧基末端肽的任意位置，并優(yōu)選設(shè)置于羧基末端肽的末端；并且，本發(fā)明的N-糖基化位點(diǎn)可包含所有的可構(gòu)成N-糖基化位點(diǎn)的氨基酸序列，進(jìn)一步優(yōu)選的，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。本發(fā)明還涉及一種如SEQIDNO：2所示的編碼權(quán)利要求1所述羧基末端肽的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及一種重組表達(dá)載體，該重組表達(dá)載體含有SEQIDNO：2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞含有上述重組表達(dá)載體，宿主細(xì)胞為CHO細(xì)胞。本發(fā)明還涉及一種長效干擾素，該長效干擾素由本發(fā)明的羧基末端肽與白介素-7連接而成，該長效白介素-7的核苷酸序列如SEQIDNO：5所示，該白介素-7的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。該長效白介素-7的制備方法為：將編碼N糖基化修飾的羧基末端肽的核苷酸序列與編碼白介素-7的核苷酸序列連接，克隆到表達(dá)載體pcDNA5/FRT和pIRES，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Flp-In-CHO和CHO-K1細(xì)胞，篩選高表達(dá)的細(xì)胞株。其中，篩選高表達(dá)細(xì)胞株的方法為HygromycinB加壓篩選和流式細(xì)胞儀針對pIRES的IRES元件后表達(dá)的人CD20篩選；濃縮和純化方法為：細(xì)胞培養(yǎng)上清用(NH4)2SO4進(jìn)行沉淀濃縮，等電點(diǎn)沉淀、疏水層析、離子交換、BlueSepharose6FF和分子篩s-200對樣品進(jìn)行純化。本發(fā)明還涉及該長效白介素-7在制備治療腫瘤、慢性病毒性疾病、免疫性疾病或放射、化療以及移植引發(fā)的免疫系統(tǒng)損傷的藥物中的應(yīng)用。下面對本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的說明書。人絨毛膜促性腺激素(HCG)-β亞單羧基端肽(CTP)：HCG是由胎盤的滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，它是由α和β二聚體的糖蛋白組成。HCG-β末端比人黃體生成素末端多37個氨基酸。CTP是人絨毛膜促性腺激素亞基(hCGβ)的羧基末端肽(C-terminalpeptide，CTP)，含有四個O-糖基化位點(diǎn)，其中的19-30個氨基酸常被用于融合蛋白表達(dá)的CTP蛋白。本發(fā)明提出了一種全新的羧基末端肽，其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。編碼該多肽的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。hCGβ亞基含有145個氨基酸，109-145位氨基酸是CTP，共37個氨基酸，本發(fā)明去掉前面13個氨基酸，利用后面的24個氨基酸作為長效的CTP分子。本發(fā)明CTP在N端加上4個連接肽，與前面要表達(dá)的蛋白質(zhì)的核酸相連接，在C端加上4個氨基酸為N-糖基化位點(diǎn)。SEQIDNO：1KAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQGNGSSEQIDNO：2本發(fā)明為了增加蛋白的表達(dá)，對白介素IL-7的核苷酸進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后白介素IL-7核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。SEQIDNO：3Atgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatctgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaaca以IL-7-CTPON為模板，通過PCR技術(shù)獲得了IL-7-CTP的核酸序列，同時在引物兩端引入與載體相匹配的酶切位點(diǎn)。其核苷酸序列如SEQIDNO：4所示：ggGGCTAGCatgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatctgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacacGGCGGTTCCTCTTCCTCTCTTAAGgg由于優(yōu)化后不能從組織中使用PCR等技術(shù)獲得序列，所以本發(fā)明直接合成帶有羧基末端肽的白介素IL-7-CTPON核苷酸序列，并且在兩端合成了與表達(dá)載體相符的酶切位點(diǎn)，其核苷酸序列如，其核苷酸序列如SEQIDNO：5所示：ggGGCTAGCatgttccatgtttcttttaggtatatctttggacttcctcccctgatccttgttctgttgccagtagcatcatctgattgtgatattgaaggtaaagatggcaaacaatatgagagtgttctaatggtcagcatcgatcaattattggacagcatgaaagaaattggtagcaattgcctgaataatgaatttaacttttttaaaagacatatctgtgatgctaataaggaaggtatgtttttattccgtgctgctcgcaagttgaggcaatttcttaaaatgaatagcactggtgattttgatctccacttattaaaagtttcagaaggcacaacaatactgttgaactgcactggccaggttaaaggaagaaaaccagctgccctgggtgaagcccaaccaacaaagagtttggaagaaaataaatctttaaaggaacagaaaaaactgaatgacttgtgtttcctaaagagactattacaagagataaaaacttgttggaataaaattttgatgggcactaaagaacacGGCGGTTCCTCTTCCTCTCTTAAGgg兩端下劃線為實(shí)線的部分為酶切位點(diǎn)和酶切位點(diǎn)保護(hù)堿基，字體傾斜部分為IL-7序列，黑體部分為linker序列，而下劃線為虛線的部分為CTP蛋白，雙實(shí)現(xiàn)下劃線部分為增加的N糖基化位點(diǎn)。本發(fā)明還涉及該羧基末端肽在制備長效多肽、長效蛋白或長效細(xì)胞因子中的應(yīng)用。通過O-糖基化位點(diǎn)和N-糖基化位點(diǎn)的協(xié)同作用，從而不僅可以延長與其融合的蛋白分子的半衰期，并且可增強(qiáng)其活性。同時在IL-7的末端融合了經(jīng)過改造的CTPON蛋白，CTPON蛋白的主要功能就是延長預(yù)期融合蛋白的半衰期，并且不影響被融合蛋白的生物活性。所以本發(fā)明使用了兩種方式延長蛋白在體內(nèi)的半衰期，一是增加蛋白的糖基化，二是融合長效蛋—CTPON蛋白。目前白介素-7廣泛地被認(rèn)為是慢性病毒性疾病如HIV/HBV/HCV等，一些腫瘤、免疫性疾病和放射、化療以及移植等免疫系統(tǒng)損傷后免疫系統(tǒng)重構(gòu)的潛在有效藥物。但普通白介素-7半衰期短，在臨床使用中給病人帶來較多的不便，而長效IL-7既可以減輕病人的痛苦，同時可以使血藥濃度保持比較平穩(wěn)，有利于疾病的治療。因此白介素-7長效研究成為熱點(diǎn)。本發(fā)明為IL-7的長效化提供了一個全新的方式。本發(fā)明的長效白介素-7的制備方法為：1.IL-7-CTP和IL-7-CTPON載體構(gòu)建及穩(wěn)定細(xì)胞株篩選首先對人CTP蛋白進(jìn)行改造，在其末端增加了一個N糖基化氨基酸，接著對IL-7-CTPON進(jìn)行密碼子優(yōu)化，參考密碼子為倉鼠密碼子表，優(yōu)化方法為本專業(yè)常用手段。而后合成帶有酶切位點(diǎn)的IL-7-CTPON，酶切位點(diǎn)為：NheⅠ/NotⅠ；而后應(yīng)用PCR技術(shù)獲得IL-7序列，引入酶切位點(diǎn)NheⅠ/NotⅠ，并與表達(dá)載體pcDNA5/FRT連接。分別構(gòu)建了pcDNA5/FRT-IL-7和pcDNA5/FRT-IL-7-CTPON兩個質(zhì)粒，測序確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。按照本專業(yè)的常規(guī)手段，提取質(zhì)粒，并純化質(zhì)粒后使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將構(gòu)建的質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒pOG44按照說明書以1:9的比例轉(zhuǎn)入Flp-In-CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后用600ug/mlHygromycinB篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)IL-7和IL-7-CTPON的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。使用PCR技術(shù)將IL-7-CTPON酶切位點(diǎn)換成NheI和ECORI，插入pIRES載體的第一個克隆位點(diǎn)；將人CD20mRNA序列反向優(yōu)化后合成，在其兩端引入酶切位點(diǎn)：XbaⅠ/NotⅠ將其插入在IRES元件后面的第二個克隆位點(diǎn)。克隆在DH5α菌里后提取質(zhì)粒，并測序驗(yàn)證后，按照上述手段，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO-K1細(xì)胞里，在G418500ug/ml篩選作用后使用流式細(xì)胞儀篩選出表達(dá)量較高的細(xì)胞株，并繼續(xù)測定和放大培養(yǎng)。而后再使用ELISA法測定細(xì)胞表達(dá)量。2.IL-7-CTP和IL-7-CTPON蛋白純化由于IL-7-CTP和IL-7-CTPON均是糖蛋白，并且有數(shù)個糖基化位點(diǎn)，所以在對其進(jìn)行真核表達(dá)時，可能會出現(xiàn)不同糖基化的蛋白，即分子量大小不一的數(shù)個蛋白，因此在純化的各階段會獲得不同的蛋白。針對本表達(dá)產(chǎn)物的純化使用了硫酸銨沉淀、等電點(diǎn)沉淀、疏水層析、BlueSepharose6FastFlow和分子篩s-200等獲得IL-7-CTP和IL-7-CTPON蛋白，獲得較純的表達(dá)產(chǎn)物，該產(chǎn)物為多種糖基化不同的蛋白構(gòu)成的混合物，如附圖2所示。對IL-7-CTPON較純的產(chǎn)品進(jìn)行westernblot檢測后，發(fā)現(xiàn)至少有6中不同分子量大小的糖蛋白構(gòu)成，IL-7-CTP也有4種分子量大小的糖蛋白構(gòu)成，如附圖6所示。本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明制備得到的長效白介素的半衰期得到大大延長，從而得到了一種生理活性高、體內(nèi)半衰期顯著增加的長效白介素。IL-7是免疫調(diào)節(jié)和免疫增強(qiáng)的重要細(xì)胞因子，在免疫系統(tǒng)的各個階段均起作用，從骨髓基質(zhì)細(xì)胞，到胸腺，再到外周血的各種效應(yīng)細(xì)胞，都可見IL-7的作用。在B細(xì)胞分化的某些階段、T細(xì)胞和NK細(xì)胞的存活、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)等多方面都發(fā)揮著重要作用。因此認(rèn)為IL-7是記憶T細(xì)胞產(chǎn)生和維持的關(guān)鍵因素之一。在體外IL-7可以刺激小鼠的T細(xì)胞增殖，也可以刺激人的外周血單核細(xì)胞增殖。本試驗(yàn)通過在體外使用本實(shí)驗(yàn)室表達(dá)的IL-7-CTP和IL-7-CTPON對小鼠CTLL細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)，以R&D公司的原核表達(dá)的IL-7為對照產(chǎn)品，采用了promega的G4000測定。IL-7-RD的ED50在為0.635ng/ml，比活性為1.58×106U/mg；IL-7-CTP的ED50為0.675ng/ml，比活性為1.48×106U/mg，IL-7-CTPON的ED50為0.90ng/ml，比活性為1.11×106U/mg。以R&D公司的原核IL-7為參照，小鼠分別注射三種白介素-7，在0.5，2，6，26.2和30小時分別測定血清中白介素-7的含量，IL-7-RD的半衰期為5.79小時，MRT為8.17小時，IL-7的半衰期為17.32小時，MRT為28.12小時，IL-7-CTPON的半衰期為25.68小時，MRT為36.27小時。IL-7和IL-7-CTPON在體外促進(jìn)人外周血單核細(xì)胞的增殖，經(jīng)實(shí)驗(yàn)檢測，本發(fā)明的IL-7-CTPON和IL-7-CTP均可以促使人外周血單個核細(xì)胞的增殖，并且在相同濃度下，IL-7-CTPON效果優(yōu)于IL-7-CTP，IL-7-CTP效果又優(yōu)于IL-7-RD；并且在一定濃度范圍內(nèi)(<10ng/ml)可見，隨著濃度增加，效果越明顯；在三種藥物相同劑量組中可見，第五天效果比作用3天的效果明顯。表明本發(fā)明的IL-7-CTP和IL-7-CTPON的在體外具有很強(qiáng)的生物活 性。附圖說明圖1為IRES原件的基因表達(dá)盒示意圖；圖2為IL-7和IL-7-CTPON的page圖；圖3為IL-7和IL-7-CTPON的比活性測定；圖4為IL-7和IL-7-CTPON對人外周血單個核細(xì)胞增殖作用2天增殖情況；圖5為IL-7和IL-7-CTPON對人外周血單個核細(xì)胞增殖作用5天增殖情況；圖6為IL-7-CTPON的westernblot檢測結(jié)果。本發(fā)明的具體實(shí)施方式是對本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的解釋和說明，并不對本發(fā)明的內(nèi)容構(gòu)成限制。具體實(shí)施方式實(shí)施例11材料1.1主要試劑與材料IL-7-CTPON序列均由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。大腸桿菌E.Coli菌株DH5α感受態(tài)購自天根生物公司?？寺≥d體pMD18T購自Takara公司。T4DNA連接酶為Promega產(chǎn)品。Flp-In-CHO細(xì)胞、pOG44質(zhì)粒和pcDNA5/FRT質(zhì)粒購自Invitrogen公司(美國)IL-7-RD標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自R&D公司；IL-7HumanELISAKit購自Abcam公司。TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NheⅠ/HindⅢ、NotⅠ等均購自Takara公司。蛋白純化凝膠SPSepharoseFF，BlueSepharose6，S-200均購自美國GE公司。TRIZOL、RT-PCRKit、Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自Invitrogen公司；QiagenRNeasyprotectminkit、RNasefreeDNaseset均購自Qiagen公司；Non-RadioactiveCellProliferationAssaypromegaG4000試劑盒購自Promega公司。2.方法2.1.序列優(yōu)化：由于CHO細(xì)胞來源于中國倉鼠的卵巢細(xì)胞，而IL-7和CTP均來源于人，二者之間存在物種間遺傳背景的差異，因此所使用的密碼子頻率有差異，可能會因?yàn)檗D(zhuǎn)運(yùn)RNA的數(shù)量等不一樣，影響翻譯和表達(dá)速度。為了更好的利用倉鼠體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后修飾機(jī) 制，需要對表達(dá)的IL-7-CTP進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化成小鼠偏嗜的密碼子，減少因?yàn)槊艽a子的不一致而影響目標(biāo)的表達(dá)量。密碼子的優(yōu)化通常是通過大量的測序確認(rèn)需要用到的表達(dá)體系的密碼子，然后根據(jù)其密碼子偏好性，通常將需要表達(dá)的目標(biāo)的密碼子的第三位進(jìn)行修改，使之蛋白沒有改變，但是密碼子已經(jīng)改變。本發(fā)明對IL-7的核苷酸序列的密碼子進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。序列優(yōu)化后，與原序列相似性為73％，但是密碼子適應(yīng)指數(shù)(codonadaptationindex，CAI)由0.68升高到1.0，有效密碼子數(shù)(effectivenumberofcodons，ENC)由54降到21，與倉鼠的密碼子更加符合，優(yōu)化后GC％含量也得到提高。2.2.載體構(gòu)建和單克隆篩選直接合成帶有酶切位點(diǎn)的IL-7-CTPON(SEQIDNO：5)，酶切位點(diǎn)為：NheⅠ/NotⅠ。IL-7-CTP的制備：使用PCR從IL-7-CTPON上擴(kuò)增IL-7-CTP序列(SEQIDNO：4)，并引入酶切位點(diǎn)NheⅠ/NotⅠ；PCR體系為：PCR引物序列如表1所示：表1：Primername編號Sequence(5’—3’)FSEQIDNO:6ggGGCTAGCatgttccatgtttcttttaRSEQIDNO:7GGCTTAAGTCAttgtgggaggatcggggtPCR反應(yīng)條件：95℃5min，(95℃30s，58℃30s，72℃60s)35循環(huán)，72℃7min。產(chǎn)物純化回收后，與pGEM-T-easy載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，經(jīng)測序鑒定正確的 質(zhì)粒，用NheI和ECORI分別雙酶切質(zhì)粒和pIRES載體，回收酶切下來的IL-7-CTP和載體，以T4連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，經(jīng)測序確認(rèn)正確的菌落留存待用。小提質(zhì)粒pcDNA5/FRT、IL-7-CTP和IL-7-CTPON質(zhì)粒。對三種質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，酶切體系如表2所示：表2：試劑體積NheⅠ1ulNotⅠ2ulbuffer2.11.5ul質(zhì)粒10.5ul37℃酶切過夜，膠回收酶切產(chǎn)物。將IL-7-CTP和IL-7-CTPON質(zhì)粒與載體pcDNA5/FRT在T4連接酶鏈接4℃連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌，測序確定質(zhì)粒構(gòu)建成功。提取質(zhì)粒，純化質(zhì)粒后使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將構(gòu)建的質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒pOG44按照說明書以1:9的比例轉(zhuǎn)入Flp-In-CHO細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24小時后用600ug/mlHygromycinB篩選，得到穩(wěn)定表達(dá)IL-7和IL-7-CTPON的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。使用引物SEQIDNO:8、SEQIDNO:9從pcDNA5/FRT-frt-IL-7-CTPON上擴(kuò)增IL-7-CTPON片段，獲得含有NheI和ECoRI酶切位點(diǎn)的IL-7-CTPON；使用引物SEQIDNO:8、SEQIDNO:10從pcDNA5/FRT-frt-IL-7-CTP上擴(kuò)增IL-7-CTP片段，獲得含有NheI和ECoRI酶切位點(diǎn)的IL-7-CTP。引物序列圖表3所示；表3：Primername編號Sequence(5’—3’)IL-7-CTPNheISEQIDNO:8GCTAGCATGTTCCACGTGTCCIL-7-CTPECoRI1SEQIDNO:9ccgGAATTCTTATCAGGAGCCGTIL-7-CTPECoRI2SEQIDNO:10ccgGAATTCTTAttgtgggaggatc將人CD20mRNA序列反向優(yōu)化后合成(CD20核苷酸序列如SEQIDNO:11所示)，在其兩端引入酶切位點(diǎn)：XbaⅠ/NotⅠ將其插入在IRES元件后面的第二個克隆位點(diǎn)。克隆在DH5α菌里后提取質(zhì)粒，并測序驗(yàn)證后，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)CHO-K1細(xì)胞里，經(jīng)G418500ug/ml篩選作 用，將G418篩選到的CHO-K1-IL-7-CTP-IRES-CD20或CHO-K1-IL-7-CTPON-IRES-CD20表達(dá)抗G418的細(xì)胞使用PBS清洗2遍，清洗后用BD公司FITC標(biāo)記的anti-humanCD20染色。每1×107細(xì)胞在250ul培養(yǎng)液中加入5ul抗體，在室溫孵育15分鐘，間斷性的輕微晃動，再次使用PBS清洗兩遍后，去除多余的CD20抗體及粘附在細(xì)胞表面的抗體，上流式細(xì)胞儀分選。將選出的細(xì)胞在48孔板中培養(yǎng)，培養(yǎng)時前10小時不加G418，血清為15％，加入1％的PS防止污染。因?yàn)榱魇郊?xì)胞儀篩選時對細(xì)胞是有一定的損傷的，所以部分細(xì)胞會死亡。當(dāng)4～5天后細(xì)胞鋪滿48孔板，一部分繼續(xù)轉(zhuǎn)入6孔板，一部分按照有限稀釋法使細(xì)胞在96孔板中單克隆化，10～14天后，對收到的單個細(xì)胞形成的克隆，轉(zhuǎn)入24孔板中培養(yǎng)。在24孔水平使用ELISA鑒定表達(dá)量，方法按照篩選FLP-INTM-CHO-IL-7-CTP的方法，對高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行凍存和擴(kuò)大培養(yǎng)。2.3.純化條件：IL-7-CTP和IL-7-CTPON均通過以下方式純化，通過(NH4)2SO4沉淀濃縮，等電點(diǎn)沉淀、疏水層析、離子交換、BlueSepharose6FF和分子篩s-200對樣品進(jìn)行純化，得到90％純度的IL-7和IL-7-CTPON，其SDS-PAGE電泳圖如附圖2所示。2.3.1硫酸銨溶液沉淀：緩慢加入30％硫酸銨溶液，充分?jǐn)嚢瑁蜏財(cái)嚢柽^夜，離心，收集離心上清后緩慢加入硫酸銨粉末，使硫酸銨濃度達(dá)到75～85％，充分?jǐn)嚢柽^夜，離心，收集沉淀，將沉淀用20nMPB稀釋。稀釋后在20nMPB的透析，后經(jīng)超濾管濃縮。2.3.2等電點(diǎn)沉淀調(diào)節(jié)pH值為4.4后離心去沉淀，調(diào)節(jié)PH值為5.0，同樣離心去沉淀，調(diào)節(jié)PH值為6.0，同樣離心去沉淀。2.3.3疏水層析將上清pH調(diào)節(jié)至7.0～7.2，在0.05MPB中平衡，以0.05nMPB和1.5M的硫酸銨線性梯度洗脫、0.05MPB和1.0M硫酸銨洗脫、0.05MPB和0.6M硫酸銨洗脫。2.3.4離子交換將目的峰的洗脫液在50nMPB(PH7.0)充分平衡后再使用離子交換(BlueSepharose6)進(jìn)行純化，以0.5MNaCl和50nMPB(PH7.0)到2.0MNaCl和50nMPB(PH7.0)線性洗脫。2.3.5親和層析：將目的峰在0.02MPB中平衡后，使用0.15MNaCl(pH7.2)的溶液中平衡，然后上樣，使用BlueSepharose6FF純化，起始緩沖液為(0.02MPB，0.15MNaCl，pH7.2)洗脫，待回到基線后，用bufferA(0.02MPB，2MNaCl，pH7.2)洗脫至基線。接著使用bufferB(0.02MPB，2MNaCl，50％ethyleneglycol，pH7.2)清洗至基線，重新平衡清洗純化柱以備下次使用。2.3.6分子篩s-200層析：將目的峰在0.05nMPB和0.5MNaCl中平衡后，使用分子篩S-200進(jìn)行進(jìn)一步純化。流速設(shè)定為20cm/h。對目的峰采用WB和ELISA等方法鑒定，最終獲得純化產(chǎn)物。2.4純化后的蛋白樣品進(jìn)行westernblot檢測后，IL-7-CTPON發(fā)現(xiàn)至少有6種不同分子量大小的糖蛋白構(gòu)成，IL-7-CTP有4種大小不同的糖蛋白構(gòu)成，如附圖6所示；樣品送清華大學(xué)生物醫(yī)學(xué)測試中心檢測蛋白序列，鑒定目的蛋白序列正確。實(shí)施例2長效性測定Balb/c小鼠分為三組，每組6只，分別給予IL-7-RD、IL-7-CTP和IL-7-CTPON腹腔注射(40μg/kg)，在0.5h、2h、6h、26.2h，30h小時分別取血，離心后獲得血清，應(yīng)用ELISA試劑盒檢測血清中的各樣品含量。應(yīng)用藥物動力學(xué)軟件DAS3.0計(jì)算小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)參數(shù)如表4所示。表4：實(shí)施例3比活性的測定每個細(xì)胞孔中加入50ul10％FBS的1640培養(yǎng)基，向第一列孔中加入50ul40ng/ml的IL-7-CTP或IL-7-RD培養(yǎng)液，充分混勻后，取50μl加入后一孔，按照上述步驟，將IL-7倍比稀釋加入到第十一孔，從第十一孔中取出50μl拋棄。每孔中加入50ul1×106細(xì)胞，孵育36小時后加入15ulMTT，4小時后加入100ul溶解/終止反應(yīng)液，過夜等結(jié)晶紫完全溶解后在570nm波長檢測各濃度吸光值，根據(jù)吸光值大小畫出曲線，從曲線中計(jì)算ED50，1/ED50即為比活性，如附圖3所示。IL-7-RD的ED50在為0.635ng/ml，比活性為1.58×106U/mg；IL-7-CTP的ED50為0.90 ng/ml，純度為83.2％時的比活性為1.11×106U/mg，IL-7-CTP的ED50為0.70ng/ml，比活性為1.43×106U/mg。實(shí)施例4PHA-P活化后，IL-7刺激健康人PBMC增殖作用按照常規(guī)方法分離人外周血單個核細(xì)胞，使用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFSE)染色。將一份使用PHA-P5μg/ml的量活化2天，使用含3％FBS的PBS清洗兩遍，進(jìn)行CFSE染色。向圓底96孔板中加入含有不同濃度的IL-7-RD、IL-7-CTP和IL-7-CTPON的培養(yǎng)液，濃度分為0、1.25、2.5、5、10、20ng/ml共六個梯度，每個梯度2個復(fù)孔。每孔加入1×105個PBMC細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)72小時后，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖情況，如附圖4所示(柱狀圖從上倒下依次為P9、P8、P7、P6、P5、P4)。將另一份PBMC細(xì)胞使用PHA-P5μg/ml的量活化2天，使用含3％FBS的PBS清洗兩遍，進(jìn)行CFSE染色。向圓底96孔板中加入含有不同濃度的IL-7-RD、IL-7-CTP和IL-7-CTPON的培養(yǎng)液，濃度分為0、1.25、2.5、5、10、20ng/ml共六個梯度，每個梯度2個復(fù)孔。每孔加入1×105個PBMC細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)5天后，使用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞增殖情況，如附圖5所示(柱狀圖從上倒下依次為P9、P8、P7、P6、P5)。當(dāng)前第1頁1 2 3