本發(fā)明涉及獸用二聯(lián)活疫苗，尤其涉及犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗及其制備方法，屬于獸用二聯(lián)疫苗領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病是當(dāng)前對(duì)我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)危害嚴(yán)重的2種烈性傳染病。

犬瘟熱(canine distemper，CD)是由犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的一種高度接觸性傳染病，臨床癥狀多樣，容易繼發(fā)其他細(xì)菌、病毒的混合感染和二次感染，死亡率可高達(dá)80％，患病動(dòng)物在康復(fù)后還易留有麻痹、抽搐、癲癇樣發(fā)作等后遺癥。該病自1926年被發(fā)現(xiàn)呈世界性分布，危害我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)和野生動(dòng)物保護(hù)業(yè)，引起大批犬、貂、狐等動(dòng)物發(fā)病，經(jīng)濟(jì)損失慘重。近年來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)包括大熊貓、小熊貓以及獅、虎、豹等食肉目所有8個(gè)科、偶蹄目豬科、靈長(zhǎng)目的猴屬和鰭足目海豹等多種動(dòng)物均有CD自然發(fā)病的報(bào)道。另外，人也已證實(shí)在患Pagets疾病的病人組織中檢出CDV核酸。這些表明，CDV的感染范圍在不斷地?cái)U(kuò)大，生態(tài)學(xué)內(nèi)容在不斷地豐富。

犬細(xì)小病毒病(canine parovirus，CP)是由犬細(xì)小病毒(Canine Parovirus，CPV)感染幼犬引起的一種急性傳染病，以劇烈的嘔吐、出血性腸炎、白細(xì)胞顯著減少以及心肌炎為主要特征，2～4月齡幼犬易感性最強(qiáng)。我國(guó)自1982年證實(shí)存在犬細(xì)小病毒感染以來(lái)，在東北、華東和西南等地區(qū)的軍犬、警犬、實(shí)驗(yàn)犬等犬群和狐貍等毛皮動(dòng)物中廣泛傳播。由于CPV-2不斷進(jìn)行抗原漂移，現(xiàn)已分離獲得CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c等多個(gè)抗原型流行毒株。近年來(lái)，隨著 CPV的不斷變異，CPV宿主范圍也在不斷擴(kuò)大，除感染犬、狐貍、狼等犬科動(dòng)物外，還感染貓、豹、熊、虎等其它多種動(dòng)物。該病發(fā)病急，病程短，傳染性強(qiáng)，死亡率高，其發(fā)病率達(dá)50％～100％，死亡率為10％～50％，是對(duì)我國(guó)養(yǎng)犬業(yè)和經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)危害極大的病毒性傳染病之一，可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

在1923年就誕生了首份犬瘟熱組織滅活疫苗。Puntoni將CDV感染患有腦炎的犬腦組織通過(guò)福爾馬林滅活制作成滅活組織疫苗，但CDV滅活全病毒疫苗免疫保護(hù)有限的，不能完全預(yù)防強(qiáng)毒感染，但是與對(duì)照相比能激活機(jī)體免疫反應(yīng)抑制臨床癥狀發(fā)展。1950年代CDV弱毒活病毒疫苗成功研制并迅速被廣泛使用，極大降低了CD的發(fā)病率。常規(guī)的病毒弱化是將病毒在細(xì)胞中連續(xù)傳代多次后實(shí)現(xiàn)的，如適應(yīng)雞胚內(nèi)繁殖的Lederle株和Onderstepoort株及犬腎細(xì)胞適應(yīng)株Rockborn。目前犬細(xì)小病毒疫苗主要有弱毒苗，Pfizer公司犬細(xì)小病毒病活疫苗，國(guó)內(nèi)犬狂犬病、犬瘟熱、副流感、腺病毒和細(xì)小病毒病五聯(lián)活疫苗

Intervet公司犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗，犬瘟熱、傳染性肝炎、細(xì)小病毒病、副流感四聯(lián)活疫苗；Merial公司犬瘟熱、腺病毒病、細(xì)小病毒病、副流感病毒2型呼吸道感染四聯(lián)活疫苗-犬鉤端螺旋體病、黃疸出血鉤端螺旋體病二聯(lián)滅活疫苗；Pfizer公司犬細(xì)小病毒病活疫苗(商品名：)，犬瘟熱、腺病毒2型、副流感和細(xì)小病毒病四聯(lián)活疫苗(5)和犬瘟熱、腺病毒2型、副流感、細(xì)小病毒病四聯(lián)活疫苗-犬鉤端螺旋體(犬型、黃疸出血型)二價(jià)活疫苗-犬冠狀病毒病(滅活)疫苗；Fort Dodge的犬瘟熱、腺病毒2型、細(xì)小病毒病、副流感四聯(lián)活疫苗-犬冠狀病毒病滅活疫苗以及國(guó)內(nèi)吉林五星和楊凌均為犬狂犬病、犬瘟熱、副流感、腺病毒和細(xì)小病毒病五聯(lián)活疫苗等9個(gè)產(chǎn)品。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病聯(lián)合感染率約為10％， 而現(xiàn)有疫苗毒株歷史久遠(yuǎn)，保護(hù)率不高，毒株的免疫原性不強(qiáng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗及其制備方法。

首先，本發(fā)明提供一種犬瘟熱病毒(canine distemper virus)弱毒疫苗株BJ/120株，其微生物保藏編號(hào)為CGMCC No.10980，其F基因序列如SEQ ID No.1所示，H基因序列如SEQ ID No.2所示。

本發(fā)明還提供一種犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus)弱毒疫苗株CPV/FJ/58株，其微生物保藏編號(hào)為CGMCC No.7408，其VP2基因序列如SEQ ID No.3所示。

本發(fā)明還一種犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗，其包含微生物保藏號(hào)CGMCC No.10980的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株以及微生物保藏號(hào)是CGMCC No.7408的犬細(xì)小病毒弱毒疫苗株。

優(yōu)選地，所述犬瘟熱病毒弱毒疫苗株病毒含量不低于10^4.0TCID₅₀/頭份，犬細(xì)小病毒弱毒疫苗株病毒含量不低于10^4.0FAID₅₀/頭份。

其中，本發(fā)明犬瘟熱弱毒疫苗株(BJ/120株)的培育：將分離的犬瘟熱毒株BJ株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代至120代，獲得犬瘟熱細(xì)胞致弱株BJ/120株，經(jīng)無(wú)菌、支原體、外源病毒檢驗(yàn)，結(jié)果驗(yàn)證BJ/120株無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)，無(wú)支原體生長(zhǎng)，純凈。

其中，本發(fā)明犬細(xì)小弱毒疫苗株(CPV/FJ/58株)的培育：將分離的犬細(xì)小毒株FJ株在DK細(xì)胞上連續(xù)傳代至58代，獲得犬細(xì)小病毒病細(xì)胞致弱株CPV/FJ/58株，經(jīng)無(wú)菌、支原體、外源病毒檢驗(yàn)，結(jié)果驗(yàn)證CPV/FJ/58株無(wú)細(xì)菌、霉菌生長(zhǎng)，無(wú)支原體生長(zhǎng)，純凈。

本發(fā)明還提供一種制備上述犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗的方法，其包括如下步驟：

1)分別培養(yǎng)所述的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株和2所述的犬細(xì)小病 毒弱毒疫苗株，得到所述的2種弱毒疫苗株的病毒液；

2)分別對(duì)各弱毒疫苗株的病毒液進(jìn)行病毒滴定，將各弱毒疫苗株進(jìn)行混合，加入凍干保護(hù)劑，凍干即得。

其中，所述犬瘟熱弱毒疫苗株的培養(yǎng)包括，選擇經(jīng)無(wú)菌、支原體、外源病毒，檢驗(yàn)合格的Vero細(xì)胞，生長(zhǎng)為單層，倒去培養(yǎng)液后，加入含1％～4％毒種的細(xì)胞維持液，置33-35℃培養(yǎng)，當(dāng)CPE達(dá)到70-80％時(shí)收獲。

其中，所述犬細(xì)小病毒弱毒疫苗株的培養(yǎng)包括，選擇經(jīng)無(wú)菌、支原體、外源病毒，檢驗(yàn)合格的DK細(xì)胞，細(xì)胞分散后加入含0.5％～4％毒種的細(xì)胞生長(zhǎng)液，37℃培養(yǎng)24～36小時(shí)，倒去培養(yǎng)液后加入細(xì)胞維持液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)當(dāng)CPE達(dá)到70-80％時(shí)收獲。

其中，所述凍干保護(hù)劑的配制方法：蔗糖8g，明膠5g，甘露醇2.5g，海藻糖2g，甘露醇0.3g，精氨酸0.5g，無(wú)離子水100ml，調(diào)整pH值為7.2～7.6。

其中，將混合的病毒液與凍干保護(hù)劑按1:1的體積比例進(jìn)行混合。

本發(fā)明采用分離自中國(guó)病犬的野毒并經(jīng)過(guò)馴化致弱的犬瘟熱病毒、犬細(xì)小病毒為研究對(duì)象，依據(jù)病毒相容性研究，得到病毒混合液方式，加入凍干保護(hù)劑，制備犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗。該二聯(lián)疫苗安全、有效、質(zhì)量可控、適宜工業(yè)化生產(chǎn)。

本發(fā)明的犬瘟熱病毒弱毒疫苗株BJ/120于2015年7月9日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為：CGMCC No.10980。

本發(fā)明的犬細(xì)小病毒(Canine Parvovirus)弱毒疫苗株CPV/FJ/58于2013年4月3日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中 國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為：CGMCC No.7408。

本發(fā)明制苗使用的毒種為國(guó)內(nèi)本土分離并致弱，具有毒種安全、免疫原性強(qiáng)等特點(diǎn)。另本發(fā)明的疫苗在2～8℃保存，有效期可達(dá)12個(gè)月。超過(guò)國(guó)內(nèi)同類產(chǎn)品水平。本發(fā)明所制備的犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗分別接種2～4月齡犬10只，免疫21日分別進(jìn)行犬瘟熱強(qiáng)毒劑量100ID₅₀/只、犬細(xì)小病毒強(qiáng)毒100ID₅₀/只，結(jié)果表明，3批疫苗對(duì)2種病的保護(hù)率均達(dá)到5/5，對(duì)照犬均5/5發(fā)病。因此，本發(fā)明犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗對(duì)預(yù)防犬瘟熱、犬細(xì)小病毒病均能達(dá)到很好的效果，必將對(duì)犬瘟熱和犬細(xì)小病毒病防控發(fā)揮重大作用。

附圖說(shuō)明

圖1犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗的生產(chǎn)工藝路線圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1 生產(chǎn)用毒種的準(zhǔn)備

犬瘟熱病毒BJ/120株生產(chǎn)毒種的制備

將犬瘟熱病毒CDV/BJ/120株以2％接種于Vero細(xì)胞單層，33℃培養(yǎng)96～120小時(shí)，細(xì)胞病變達(dá)到80％時(shí)進(jìn)行收獲，-20℃凍融3次后，抽樣進(jìn)行病毒含量測(cè)定、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)，鑒定合格后定量分裝，凍干或-40℃以下保存。

犬細(xì)小病毒CPV/FJ/58株生產(chǎn)毒種的制備

將犬細(xì)小病毒CPV/FJ/58株以2％接種于DK細(xì)胞，24～48小時(shí)細(xì)胞長(zhǎng)成單層后換成含2％牛血清的MEM營(yíng)養(yǎng)液，37℃培養(yǎng)96～120小時(shí)收獲，轉(zhuǎn)移至-20℃凍融3次后，抽樣進(jìn)行病毒含量測(cè)定、無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)和外源病毒檢驗(yàn)，鑒定合格后定量分裝，凍干或-40℃以下保存。

實(shí)施例2 制備用病毒液制備

犬瘟熱病毒液的制備

選擇生長(zhǎng)良好的Vero細(xì)胞單層，棄去營(yíng)養(yǎng)液，將2％犬瘟熱毒種加入含2％牛血清的MEM營(yíng)養(yǎng)液中，置33℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)80％左右時(shí)收獲，-20℃凍融3次后將病毒液置于-40℃以下凍存。

犬細(xì)小病毒液的制備

選擇生長(zhǎng)良好的DK細(xì)胞，經(jīng)胰酶分散后，按2％比列將犬細(xì)小病毒毒種加入至細(xì)胞液中，24～48小時(shí)，待細(xì)胞形成單層后換成含2％牛血清的MEM營(yíng)養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至96～120小時(shí)，將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)至-20℃凍融3次后將病毒液置于-40℃以下凍存。

實(shí)施例3 犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗的制備

將實(shí)施例2所制備的犬瘟熱病毒液和犬細(xì)小病毒液按體積比1:1進(jìn)行混合，再與凍干保護(hù)劑按體積比1:1體積混合后，充分搖勻，定量分裝于疫苗瓶中，凍干程序?yàn)?40℃6～7小時(shí)，-10℃16小時(shí)，30℃6小時(shí)，壓蓋、貼簽。

所述凍干保護(hù)劑為：蔗糖8g，明膠5g，甘露醇2.5g，海藻糖2g，甘露醇0.3，精氨酸0.5g，無(wú)離子水100ml，調(diào)整pH值為7.2～7.6；116℃高壓滅菌30分鐘。

試驗(yàn)例1 犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗免疫效力試驗(yàn)

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)用疫苗

犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品，批號(hào)201001、201002、201003(實(shí)施例3制備)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2～3月齡比格犬，犬瘟熱、犬細(xì)小病毒中和抗體效價(jià)不高于1:4，無(wú)真菌和寄生蟲(chóng)感染。

1.3 攻擊用強(qiáng)毒

CDV/BJ株，CPV/QD株。

1.4 試驗(yàn)方法

每批疫苗用注射用水稀釋，肌肉接種2～3月齡比格犬10只，每只1頭份，21日后分別進(jìn)行犬瘟熱強(qiáng)毒和犬細(xì)小病毒強(qiáng)毒的攻擊，劑量100ID₅₀/只，連同對(duì)照犬隔離觀察21日。記錄各組犬的發(fā)病及死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 犬瘟熱強(qiáng)毒攻毒結(jié)果

3批疫苗接種比格犬后21日，取各組犬進(jìn)行犬瘟熱強(qiáng)毒CDV/BJ株攻毒，100ID₅₀/只，對(duì)照組5/5發(fā)病，其中1/5死亡，201001批、201002批、201003批免疫組均達(dá)5/5保護(hù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 犬瘟熱強(qiáng)毒攻毒保護(hù)結(jié)果

2.2 犬細(xì)小強(qiáng)毒攻毒結(jié)果

3批疫苗接種比格犬后21日，取各組犬進(jìn)行犬細(xì)小強(qiáng)毒CPV/QD株攻毒，100ID₅₀/只，對(duì)照組5/5發(fā)病，其中2/5死亡，201001批、201002批、201003批免疫組均達(dá)5/5保護(hù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 犬細(xì)小強(qiáng)毒攻毒保護(hù)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)論

本發(fā)明犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗接種犬后采用犬瘟熱、 犬細(xì)小病毒強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)率均達(dá)到5/5保護(hù)。

試驗(yàn)例2 犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗同類產(chǎn)品比較試驗(yàn)

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)用疫苗

犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗實(shí)驗(yàn)室產(chǎn)品，批號(hào)201001、201002、201003；犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗，購(gòu)自Intervet公司；狂犬病、犬瘟熱、犬副流感、犬傳染性肝炎、犬細(xì)小病毒病五聯(lián)疫苗，購(gòu)自吉林省五星動(dòng)物保健藥廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2月齡比格犬，犬瘟熱、犬細(xì)小病毒中和抗體效價(jià)不高于1:4，無(wú)真菌和寄生蟲(chóng)感染。

1.3 攻擊用強(qiáng)毒

CDV/BJ株，CPV/QD株。

1.4 試驗(yàn)方法

5批疫苗用注射用水或包裝稀釋液稀釋，肌肉接種2月齡比格犬10只，每只1頭份，分別于7日、14日和21日采血測(cè)定犬瘟熱和犬細(xì)小病毒中和抗體效價(jià)，并于21日后分別進(jìn)行犬瘟熱強(qiáng)毒和犬細(xì)小病毒強(qiáng)毒的攻擊，劑量100ID₅₀/只，連同對(duì)照犬隔離觀察21日。記錄各組犬的發(fā)病及死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 免疫產(chǎn)生期試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)犬分別于接種疫苗后7日、14日、21日測(cè)定犬瘟熱和犬細(xì)小病毒中和抗體效價(jià)，結(jié)果見(jiàn)表3和表4。

表3 實(shí)驗(yàn)犬在接種疫苗后7日、14日、21日犬瘟熱病毒中和抗體幾何平均滴度(GMT)

表4 實(shí)驗(yàn)犬在接種疫苗后7日、14日、21日犬細(xì)小病毒中和抗體幾何平均滴度(GMT)

從表3和表4可以看出，對(duì)照犬在監(jiān)測(cè)期內(nèi)犬瘟熱和犬細(xì)小病毒中和抗體GMT均不高于1:4。5組疫苗接種犬7日測(cè)定犬瘟熱和犬細(xì)小病毒中和抗體效價(jià)，統(tǒng)計(jì)分析GMT，結(jié)果3批本品的抗體效價(jià)均高于intervet小犬二聯(lián)疫苗和犬五聯(lián)疫苗(p值＜0.05)，并且在接種后14日能達(dá)到保護(hù)性抗體水平，而其他2種疫苗均在21日才能達(dá)到。

2.2 本動(dòng)物攻毒試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 犬瘟熱強(qiáng)毒攻毒結(jié)果

5批疫苗接種比格犬后21日，取各組犬進(jìn)行犬瘟熱強(qiáng)毒CDV/BJ株攻毒，100ID₅₀/只，對(duì)照組5/5發(fā)病，201001批、201002批、201003批、intervet小犬二聯(lián)、吉林五星犬五聯(lián)免疫組均達(dá)5/5保護(hù)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 同類產(chǎn)品比較犬瘟熱強(qiáng)毒攻毒保護(hù)結(jié)果

2.2.2 犬細(xì)小強(qiáng)毒攻毒結(jié)果

5批疫苗接種比格犬后21日，取各組犬進(jìn)行犬細(xì)小強(qiáng)毒CPV/QD株攻毒，100ID₅₀/只，對(duì)照組5/5發(fā)病，其中1/5死亡，201001批、201002批、201003批、intervet小犬二聯(lián)、吉林五星犬五聯(lián)免疫組均達(dá)5/5保護(hù)，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 同類產(chǎn)品比較犬細(xì)小強(qiáng)毒攻毒保護(hù)結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)論

本發(fā)明犬瘟熱、細(xì)小病毒病二聯(lián)活疫苗以及同類產(chǎn)品intervet小犬二聯(lián)、吉林五星犬五聯(lián)接種犬后，通過(guò)7日、14日、21日血清監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，本發(fā)明產(chǎn)品免疫產(chǎn)生期為14日，優(yōu)于intervet和吉林五星產(chǎn)品，另采用犬瘟熱、犬細(xì)小病毒強(qiáng)毒攻擊，保護(hù)率均達(dá)到5/5保護(hù)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。