本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
中愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)蛋白GaLBD-2及其相關(guān)生物材料與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系必須有一個有效的轉(zhuǎn)化篩選標記系統(tǒng)。目前轉(zhuǎn)基因研究中被廣泛應(yīng)用的轉(zhuǎn)化細胞篩選標記系統(tǒng)主要有兩類：一類是將抗性基因作為選擇標記，將非轉(zhuǎn)化細胞殺死而使轉(zhuǎn)化細胞存活的負向篩選系統(tǒng)，主要包括兩種，一種是編碼使抗生素失活的蛋白酶基因如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因nptII和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因hpt等，另一種是可使除草劑失活的基因如膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因bar和5-烯醇丙酮酰草莽酸-3-磷酸合成酶基因epsps。這兩種方法都是通過將外源的篩選標記基因轉(zhuǎn)入受體細胞中，在培養(yǎng)基中添加篩選物質(zhì)，不僅增加了培養(yǎng)成本，使用過的培養(yǎng)基增加了環(huán)境中的抗生素、除草劑等篩選物質(zhì)的殘留量。同時完成篩選作用后，這些抗性基因便失去了作用，成為轉(zhuǎn)基因植物的一種負擔(dān)。由于標記基因數(shù)量有限，這些基因的存在給轉(zhuǎn)基因植物的再次轉(zhuǎn)化帶來了困難，無法將多種優(yōu)良性狀積累到同一轉(zhuǎn)化植株內(nèi)從而得到產(chǎn)量、品質(zhì)等多種性狀同步改善的作物。另一類則是無抗生素和除草劑抗性，基因及其編碼的蛋白對生態(tài)環(huán)境和生物無毒無抗性，相對安全，被稱為區(qū)別于傳統(tǒng)抗性標記基因的新一代標記基因。安全標記基因策略不是依靠對非轉(zhuǎn)化細胞致死作用篩選出轉(zhuǎn)化細胞，而是將轉(zhuǎn)化細胞處于某種有利的環(huán)境，從而篩選出轉(zhuǎn)化細胞。這種方法的優(yōu)點在于選擇劑無毒副作用，操作簡單，在多數(shù)情況下有利于轉(zhuǎn)化植株的再生。新一代標記基因主要為編碼激素、抗逆、糖類、氨基酸、葉綠體和解毒等代謝系統(tǒng)的酶類基因。其中，愈傷組織起始發(fā)育基因通過調(diào)節(jié)植物內(nèi)源生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，使轉(zhuǎn)化細胞的生長與分化不同于非轉(zhuǎn)化細胞，從而有效篩選出轉(zhuǎn)化細胞和植株，具有不需要在培養(yǎng)基中添加任何篩選標記的優(yōu)勢。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是如何建立無抗生素和除草劑抗性的植物遺傳轉(zhuǎn)化正向篩選體系。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先提供了名稱為GaLBD-2的蛋白質(zhì)。本發(fā)明所提供的蛋白質(zhì)GaLBD-2，來源于亞洲棉(GossypiumarboreumL.)，為如下a)或b)或c)的蛋白質(zhì)：a)氨基酸序列是SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)；b)在SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)的N端或/和C端連接標簽得到的融合蛋白質(zhì)；c)將SEQIDNo.2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的與愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)的蛋白質(zhì)。其中，SEQIDNo.2由201個氨基酸組成。為了使a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。表1、標簽的序列標簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述c)中的蛋白質(zhì)GaLBD-2，所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。上述c)中的蛋白質(zhì)GaLBD-2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述c)中的蛋白質(zhì)GaLBD-2的編碼基因可通過將SEQIDNo.1所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了與所述GaLBD-2相關(guān)的生物材料。本發(fā)明所提供的與GaLBD-2相關(guān)的生物材料，為下述A1)至A20)中的任一種：A1)編碼所述GaLBD-2的核酸分子；A2)含有A1)所述核酸分子的表達盒；A3)含有A1)所述核酸分子的重組載體；A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；A5)含有A1)所述核酸分子的重組微生物；A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；A9)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；A10)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；A11)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；A12)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物細胞系；A13)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物組織；A14)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物組織；A15)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；A16)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物組織；A17)含有A1)所述核酸分子的轉(zhuǎn)基因植物器官；A18)含有A2)所述表達盒的轉(zhuǎn)基因植物器官；A19)含有A3)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官；A20)含有A4)所述重組載體的轉(zhuǎn)基因植物器官。上述生物材料中，A1)所述核酸分子為如下a1)或a2)或a3)所示的基因：a1)其編碼序列是SEQIDNo.1的cDNA分子或DNA分子；a2)與a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼氨基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；a3)在嚴格條件下與a1)或a2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼氨基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。其中，SEQIDNo.1由606個核苷酸組成，SEQIDNo.1的核苷酸編碼SEQIDNo.2所示的氨基酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進化和點突變的方法，對本發(fā)明的編碼GaLBD-2的核苷酸序列進行突變。那些經(jīng)過人工修飾的，具有與本發(fā)明分離得到的GaLBD-2的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要編碼GaLBD-2且具有GaLBD-2功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。這里使用的術(shù)語“同一性”指與天然核酸序列的序列相似性?！巴恍浴卑ㄅc本發(fā)明的編碼SEQIDNo.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用來評價相關(guān)序列之間的同一性。上述生物材料中，所述嚴格條件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下雜交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。上述75％或75％以上同一性，可為80％、85％、90％或95％以上的同一性。上述生物材料中，A2)所述的含有編碼GaLBD-2的核酸分子的表達盒(GaLBD-2基因表達盒)，是指能夠在宿主細胞中表達GaLBD-2的DNA，該DNA不但可包括啟動GaLBD-2基因轉(zhuǎn)錄的啟動子，還可包括終止GaLBD-2基因轉(zhuǎn)錄的終止子。進一步，所述表達盒還可包括增強子序列?？捎糜诒景l(fā)明的啟動子包括但不限于：組成型啟動子，組織、器官和發(fā)育特異的啟動子，和誘導(dǎo)型啟動子。啟動子的例子包括但不限于：花椰菜花葉病毒的組成型啟動子35S：來自西紅柿的創(chuàng)傷誘導(dǎo)型啟動子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)PlantPhysiol120：979-992)；來自煙草的化學(xué)誘導(dǎo)型啟動子，發(fā)病機理相關(guān)1(PR1)(由水楊酸和BTH(苯并噻二唑-7-硫代羥酸S-甲酯)誘導(dǎo))；西紅柿蛋白酶抑制劑II啟動子(PIN2)或LAP啟動子(均可用茉莉酮酸甲酯誘導(dǎo))；熱休克啟動子(美國專利5,187,267)；四環(huán)素誘導(dǎo)型啟動子(美國專利5,057,422)；種子特異性啟動子，如谷子種子特異性啟動子pF128(CN101063139B(中國專利200710099169.7))，種子貯存蛋白質(zhì)特異的啟動子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆betaconglycin的啟動子(Beachy等人(1985)EMBOJ.4：3047-3053))。它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用。此處引用的所有參考文獻均全文引用。合適的轉(zhuǎn)錄終止子包括但不限于：農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(NOS終止子)、花椰菜花葉病毒CaMV35S終止子、tml終止子、豌豆rbcSE9終止子和胭脂氨酸和章魚氨酸合酶終止子(參見，例如：Odell等人(I985)Nature313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人GenesDev.,5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151；Ballad等人(1989)NucleicAcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)NucleicAcidRes.,15:9627)?？捎矛F(xiàn)有的表達載體構(gòu)建含有所述GaLBD-2基因表達盒的重組載體。所述植物表達載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3′端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3′端，如農(nóng)桿菌冠癭瘤誘導(dǎo)(Ti)質(zhì)?；?如胭脂堿合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3′端轉(zhuǎn)錄的非翻譯區(qū)均具有類似功能。使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉(zhuǎn)錄增強子，這些增強子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確 翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。上述生物材料中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。上述生物材料中，所述微生物可為酵母、細菌、藻或真菌，如農(nóng)桿菌。上述生物材料中，所述轉(zhuǎn)基因植物細胞系、轉(zhuǎn)基因植物組織和轉(zhuǎn)基因植物器官均不包括繁殖材料。在本發(fā)明的實施例中，所述重組表達載體中啟動所述GaLBD-2基因轉(zhuǎn)錄的啟動子具體為35S啟動子。在本發(fā)明的一個實施方式中，GaLBD-2的編碼基因(即SEQIDNo.1所示的DNA分子)通過含有GaLBD-2的編碼基因的表達盒的重組載體導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中。所述重組載體為用SEQIDNo.1所示的DNA分子替換pCAMBIA2301的KpnI和AscI識別序列間的片段(pCAMBIA2301被限制性核酸內(nèi)切酶KpnI和AscI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)得到的重組載體pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS，pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS表達GUS蛋白和SEQIDNo.2所示的GaLBD-2。所述pCAMBIA2301與pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS的差別僅在于將pCAMBIA2301的KpnI和AscI識別序列間的DNA片段(pCAMBIA2301被限制性核酸內(nèi)切酶KpnI和AscI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為SEQIDNo.1所示的DNA分子。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)、或所述生物材料在誘導(dǎo)植物愈傷組織起始中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)、或所述生物材料在作為植物轉(zhuǎn)化篩選標記中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)、或所述生物材料在培育無抗生素抗性和除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了所述蛋白質(zhì)、或所述生物材料在培育愈傷組織快速脫分化的轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用。上述應(yīng)用中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為錦葵科植物，如棉花(Gossypiumspp)。所述棉花具體可為棉花品種中棉所24。上述應(yīng)用中，所述愈傷組織起始具體可為愈傷組織脫分化并增殖。上述應(yīng)用中，所述激素可為生長素(Auxin)、赤霉素(Gibberellins,GA)、細胞分裂素(Cytokinin,CTK)、脫落酸(Abscisicacid,ABA)、乙烯(ethyne，ETH)和油菜素甾醇(Brassinosteroids，BR)中的六種、五種、四種、三種、兩種或一種。為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了培育無抗生素和除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)基因 植物的方法和培育愈傷組織快速脫分化的轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明所提供的培育無抗生素抗性和除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入所述GaLBD-2的編碼基因得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物無抗生素抗性和除草劑抗性。本發(fā)明所提供的培育無抗生素抗性和除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入所述GaLBD-2的編碼基因和目的基因，得到含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物與所述受體植物相比無抗生素和除草劑抗性。在本發(fā)明的一個實施例中，所述目的基因可為編碼GUS蛋白的基因。上述培育無抗生素抗性和除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物的方法中，所述受體植物無抗生素和除草劑抗性。本發(fā)明所提供的培育愈傷組織快速脫分化的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入所述GaLBD-2的編碼基因得到轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的愈傷組織脫分化速度高于所述受體植物的愈傷組織脫分化速度。本發(fā)明所提供的培育愈傷組織快速脫分化的轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括向受體植物中導(dǎo)入所述GaLBD-2的編碼基因和目的基因，得到含有目的基因的轉(zhuǎn)基因植物的步驟；所述轉(zhuǎn)基因植物的愈傷組織脫分化速度高于所述受體植物的愈傷組織脫分化速度。上述方法中，所述GaLBD-2的編碼基因的編碼序列為如下a1)或a2)或a3)所示的基因：a1)其編碼序列是SEQIDNo.1的cDNA分子或DNA分子；a2)與a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且編碼氨基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子；a3)在嚴格條件下與a1)或a2)限定的核苷酸序列雜交，且編碼氨基酸序列為SEQIDNo.2的蛋白質(zhì)的cDNA分子或基因組DNA分子。其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。上述方法中，所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為錦葵科植物，如棉花(Gossypiumspp)。所述棉花具體可為棉花品種中棉所24。上述方法中，其中所述GaLBD-2基因可先進行如下修飾，再導(dǎo)入受體種子植物中，以達到更好的表達效果：1)根據(jù)實際需要進行修飾和優(yōu)化，以使基因高效表達；例如，可根據(jù)受體植物所偏愛的密碼子，在保持本發(fā)明所述GaLBD-2基因的氨基酸序列的同時改變其密碼子以符合植物偏愛性；優(yōu)化過程中，最好能使優(yōu)化后的編碼序列中保持一定的GC含量，以最好地實現(xiàn)植物中導(dǎo)入基因的高水平表達，其中GC含量可為35％、 多于45％、多于50％或多于約60％；2)修飾鄰近起始甲硫氨酸的基因序列，以使翻譯有效起始；例如，利用在植物中已知的有效的序列進行修飾；3)與各種植物表達的啟動子連接，以利于其在植物中的表達；所述啟動子可包括組成型、誘導(dǎo)型、時序調(diào)節(jié)、發(fā)育調(diào)節(jié)、化學(xué)調(diào)節(jié)、組織優(yōu)選和組織特異性啟動子；啟動子的選擇將隨著表達時間和空間需要而變化，而且也取決于靶物種；例如組織或器官的特異性表達啟動子，根據(jù)需要受體在發(fā)育的什么時期而定；盡管證明了來源于雙子葉植物的許多啟動子在單子葉植物中是可起作用的，反之亦然，但是理想地，選擇雙子葉植物啟動子用于雙子葉植物中的表達，單子葉植物的啟動子用于單子葉植物中的表達；4)與適合的轉(zhuǎn)錄終止子連接，也可以提高本發(fā)明基因的表達效率；例如來源于CaMV的tml，來源于rbcS的E9；任何已知在植物中起作用的可得到的終止子都可以與本發(fā)明基因進行連接；5)引入增強子序列，如內(nèi)含子序列(例如來源于Adhl和bronzel)和病毒前導(dǎo)序列(例如來源于TMV,MCMV和AMV)。所述GaLBD-2基因重組表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒，植物病毒載體，直接DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細胞(Weissbach,1998，MethodforPlantMolecularBiologyVIII,AcademyPress,NewYork,pp.411-463；GeisersonandCorey,1998,PlantMolecularBiology(2ndEdition).)。上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物理解為不僅包含將所述GaLBD-2基因轉(zhuǎn)化目的植物得到的第一代轉(zhuǎn)基因植物，也包括其子代。對于轉(zhuǎn)基因植物，可以在該物種中繁殖該基因，也可用常規(guī)育種技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)移進入相同物種的其它品種，特別包括商業(yè)品種中。所述轉(zhuǎn)基因植物包括種子、愈傷組織、完整植株和細胞。實驗證明，本發(fā)明提供的愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)蛋白GaLBD-2及其編碼基因能促進植物愈傷組織的起始：在不添加外源生長素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)的轉(zhuǎn)GaLBD-2基因的下胚軸組織和轉(zhuǎn)空載體的下胚軸組織產(chǎn)生的愈傷組織的質(zhì)地和大小均不一樣：轉(zhuǎn)GaLBD-2基因的下胚軸組織很容易喚醒愈傷組織的增殖進程，其兩端愈傷組織起始程度大，產(chǎn)生的愈傷組織顏色較淺，質(zhì)地疏松，而轉(zhuǎn)空載體的下胚軸組織很難或幾乎不能脫分化從而產(chǎn)生愈傷組織，仍然停留在下胚軸切斷的狀態(tài)。以本發(fā)明提供的愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)蛋白GaLBD-2作為篩選標記建立的正向篩選體系能夠起到與使用大量抗生素或除草劑的負向篩選體系同樣的篩選效果。結(jié)果表明，愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)蛋白GaLBD-2可替代抗生素和/或除草劑作為植物轉(zhuǎn)基因的篩選標記，與目的基因共轉(zhuǎn)化，然后根據(jù)愈傷組織起始程度篩選并獲得含有目的基因的 無抗生素和除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。附圖說明圖1為植物表達載體pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S：GUS的T-DNA區(qū)示意圖。圖2為轉(zhuǎn)GaLBD-2基因愈傷組織及轉(zhuǎn)空載體愈傷組織在誘導(dǎo)30天的表型。其中圖2中左上為轉(zhuǎn)空載體愈傷組織，圖2中右上、左下和右下為轉(zhuǎn)GaLBD-2基因愈傷組織。圖3為轉(zhuǎn)GaLBD-2基因的三種類型的愈傷組織表型。其中，S為大塊愈傷組織(strongtype)，I為中塊愈傷組織(intermediatetype)，W為小塊愈傷組織(weaktype)。圖4為轉(zhuǎn)GaLBD-2基因的棉花愈傷組織的GUS(β-葡萄糖醛酸糖苷酶)染色結(jié)果。其中A為愈傷組織起始較快的棉花愈傷組織；B為愈傷組織起始較慢的棉花愈傷組織。具體實施方式下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。下述實施例中的植物表達載體pCambia2301為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為MCV037，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。下述實施例中的根癌農(nóng)桿菌LBA4404為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為MCC026，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。下述實施例中的2,4-D為sigma公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為D7299。下述實施例中的棉花品種陸地棉(GossypiumhirsutumL.)品種中棉所24來源于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所種質(zhì)庫，記載在如下文獻中：ZhangC,YuS,FanS,etal.Inheritanceofsomaticembryogenesisusingleafpetiolesasexplantsinuplandcotton[J].Euphytica,2011,181(1):55-63.，在下文中簡稱中棉所24。下述實施例中所用的培養(yǎng)基如下：基本培養(yǎng)基MSB：溶質(zhì)及其濃度為：NH4NO31650mg/L，KNO31900mg/L，KH2PO4170mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，F(xiàn)eSO4·7H2O27.85mg/L，Na2EDTA37.25mg/L，MnSO4·4H2O22.3mg/L，ZnSO4·7H2O8.6mg/L， H3BO36.2mg/L，KI0.83mg/L，Na2MOO4·2H2O0.25mg/L，CuSO4·5H2O0.025mg/L，COCl2·6H2O0.025mg/L，肌醇100mg/L，VB110mg/L，VB61.0mg/L，煙酸1.0mg/L，28g/L蔗糖，5.6g/L瓊脂；溶劑為蒸餾水；pH5.8。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB1：向基本培養(yǎng)基MSB加入2,4-D和KT，使2,4-D和KT含量均為0.5mol/L得到的培養(yǎng)基。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB2：向基本培養(yǎng)基MSB加入KT至其含量為0.5mol/L得到的培養(yǎng)基。無菌苗培養(yǎng)基：溶質(zhì)及其濃度為：NH4NO31650mg/L，KNO31900mg/L，KH2PO4170mg/L，MgSO4·7H2O370mg/L，CaCl2·2H2O440mg/L，25g/L蔗糖，2g/L植物凝膠；溶劑為蒸餾水；pH5.8。實施例1、愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)蛋白GaLBD-2編碼基因的克隆及其載體構(gòu)建1、愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)蛋白GaLBD-2編碼基因的克隆本發(fā)明的發(fā)明人從亞洲棉(GossypiumarboreumL.)石系亞1號(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所)中分離克隆出愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)蛋白GaLBD-2基因。具體克隆方法如下：采用Trizol法(TianGen)提取的棉花品種亞洲棉(GossypiumarboreumL.)石系亞1號的葉片總RNA，用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)合成第一鏈cDNA為模板，以GaLBD-2-F：5'-GGCGCGCCATGGCATCCTCT-3’(下劃線為酶切位點AscI)和GaLBD-2-R：5'-GGTACCTCAGTTCCTCATCATTC-3’(下劃線為酶切位點KpnI)為引物，進行PCR擴增，擴增得到核苷酸序列為SEQIDNo.1所示的DNA分子，該DNA分子編碼SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)，將SEQIDNo.2所示的蛋白質(zhì)命名為GaLBD-2。2、重組載體和重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建將植物表達載體pCambia2301的限制性核酸內(nèi)切酶AscI識別序列和限制性核酸內(nèi)切酶KpnI識別序列間的DNA(植物表達載體pCambia2301被限制性核酸內(nèi)切酶AscI和KpnI切成一個大片段和一個小片段，該DNA為該小片段)替換為核苷酸序列是SEQIDNo.1的DNA分子，保持植物表達載體pCambia2301的其它序列不變得到GaLBD-2基因表達載體，其名稱為pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS，載體構(gòu)建示意圖見圖1。pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS表達SEQIDNo.2所示的GaLBD-2蛋白。將重組載體pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404中，得到含有重組載體pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS的重組農(nóng)桿菌1。將空載體質(zhì)粒pCambia2301轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌LBA4404，得到含有質(zhì)粒pCambia2301的重組農(nóng)桿菌2。實施例2、轉(zhuǎn)GaLBD-2基因棉花愈傷組織在不同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上的表型1、將實施例1的重組農(nóng)桿菌1接種到含卡那霉素50mg/l的LB液體培養(yǎng)基，28℃，150rpm振蕩培養(yǎng)，得到OD600＝0.3-0.5的重組農(nóng)桿菌1菌液。將實施例1的重組農(nóng)桿菌2接種到含卡那霉素50mg/l的LB液體培養(yǎng)基，28℃，150rpm振蕩培養(yǎng)，得到OD600＝0.3-0.5的重組農(nóng)桿菌2菌液。2、以棉花品種中棉所24為實驗材料，剝?nèi)ッ拮训耐鈿ず螅奕视?.1％的升汞浸泡消毒5min，然后用無菌水沖洗3-5次，播于無菌苗培養(yǎng)基上使其萌發(fā)并長成無菌苗。在無菌工作臺上，用經(jīng)過酒精燈火焰消毒的手術(shù)刀片將生長至7天的無菌苗的下胚軸切成0.5厘米的小段。3、采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法用步驟1中的重組農(nóng)桿菌1轉(zhuǎn)化步驟2得到的下胚軸組織，共培養(yǎng)兩天后分別平放于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB1、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB2上，30天后觀察轉(zhuǎn)GaLBD-2基因愈傷組織的表型。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法用步驟1中的重組農(nóng)桿菌2轉(zhuǎn)化步驟2得到的下胚軸組織，共培養(yǎng)兩天后分別平放于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB1、愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB2上，30天后觀察轉(zhuǎn)空載體愈傷組織的表型，作為空載體對照。培養(yǎng)條件：28±2℃，人工光照強度2000Lx，光照周期14h/10h。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)侵染下胚軸組織100個。實驗結(jié)果見圖2。結(jié)果表明，在不含生長素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB2上培養(yǎng)的轉(zhuǎn)GaLBD-2基因的下胚軸組織和在含生長素的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB1上培養(yǎng)的轉(zhuǎn)空載體的下胚軸組織產(chǎn)生的愈傷組織質(zhì)地和顏色大致相同。但是與轉(zhuǎn)空載體產(chǎn)生的愈傷組織相比，轉(zhuǎn)GaLBD-2基因產(chǎn)生的愈傷組織生長速度更快：轉(zhuǎn)空載體的愈傷組織在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB2上培養(yǎng)30天時，愈傷組織的兩端剛剛呈現(xiàn)愈傷起始狀態(tài)，而轉(zhuǎn)GaLBD-2基因的愈傷組織在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB2上培養(yǎng)30天時，愈傷組織生長旺盛，質(zhì)地濕潤疏松，生長狀態(tài)良好，兩者差異顯著。轉(zhuǎn)空載體產(chǎn)生的愈傷組織培養(yǎng)15天時，轉(zhuǎn)GaLBD-2基因的愈傷組織在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB2上正常進行愈傷起始，其愈傷組織生長形態(tài)與轉(zhuǎn)空載體的愈傷組織在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB1上生長的愈傷組織的生長形態(tài)基本一致。實驗證明，GaLBD-2基因能夠代替外源生長激素使得愈傷組織正常起始。實施例3、愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)蛋白GaLBD-2作為篩選標記用于棉花的遺傳轉(zhuǎn)化本實施例以GUS基因作為目的基因，愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)基因GaLBD-2作為篩選基因。實驗重復(fù)三次，每次重復(fù)的步驟如下：1、采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法用實施例2步驟1中的重組農(nóng)桿菌1菌液轉(zhuǎn)化實施例 2步驟2得到的下胚軸組織，共培養(yǎng)兩天后平放于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基MSB2上，培養(yǎng)30天得到轉(zhuǎn)GaLBD-2基因的愈傷組織。培養(yǎng)條件為：28±2℃，人工光照強度2000Lx，光照周期14h/10h。2、將上述步驟1得到的轉(zhuǎn)GaLBD-2基因的愈傷組織依據(jù)愈傷組織起始狀況是否明顯分為三組：分別命名為S組(大塊愈傷組織)、I組(中塊愈傷組織)和W組(小塊愈傷組織)。以100塊愈傷組織為一組，重復(fù)三次。3、完成步驟2后，將S組、I組(中塊愈傷組織)和W組的愈傷組織分別進行GUS染色，重復(fù)三次，統(tǒng)計其陽性率。染色結(jié)果表明(圖4)，S組陽性率達到100％，I組陽性率也達到75.29％，W組陽性率為10％。這一結(jié)果說明非轉(zhuǎn)化愈傷組織由于不具有GaLBD-2基因，細胞脫分化及增殖非常緩慢，能夠明顯的與轉(zhuǎn)化外植體形成明顯差異表型。利用這一表型，在陽性愈傷組織再生成植株的過程中，選擇大塊愈傷組織作為陽性愈傷塊，培養(yǎng)基中不添加卡那霉素，篩選可得到陽性轉(zhuǎn)基因植株。將步驟1中S組愈傷組織進一步分化、再生培養(yǎng)后得到棉花再生植株。用CTAB法分別提取棉花再生植株的幼嫩葉片DNA，并以該DNA為模板，以35S-F:ACATCAAGTGCAAAAGAAAGAA和GaLBD-2-R:GGTACCTCAGTTCCTCATCATTC為引物，分別進行PCR擴增。PCR擴增條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃30s，56℃40s，72℃60s，30個循環(huán)；72℃延伸10min。將PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳,能得到1200bp目的條帶的棉花再生植株即為陽性轉(zhuǎn)GaLBD-2基因棉花植株；以水和未轉(zhuǎn)基因棉花植株的葉片DNA為模板進行上述鑒定實驗無目的條帶；以質(zhì)粒pCambia2301-35S:GaLBD-2/35S:GUS為模板進行上述鑒定實驗?zāi)艿玫?200bp目的條帶。經(jīng)統(tǒng)計，愈傷組織起始相關(guān)蛋白GaLBD-2作為篩選標記建立的正向篩選體系的陽性率為62.5％，與長期使用的大量抗生素和/或除草劑的負向篩選體系(陽性率60％)相比，能夠起到同樣的篩選效果。結(jié)果表明，愈傷組織起始發(fā)育相關(guān)蛋白GaLBD-2可替代抗生素和/或除草劑作為植物轉(zhuǎn)基因的篩選標記，與目的基因共轉(zhuǎn)化，然后根據(jù)愈傷組織起始程度篩選并獲得含有目的基因的無抗生素和除草劑抗性的轉(zhuǎn)基因植物。當前第1頁1 2 3