本申請涉及基因測序領域，特別是涉及一種用于測序儀運行測試的方法。
背景技術：
：基于采集光學信號的二代測序的基本原理是ATCG四種堿基用四種不同的熒光染料標記，在不同波長的激光下被激發(fā)出不同波長的光，通過一系列鏡頭、濾片和鏡片將光傳遞到CCD上，通過CCD采集熒光信號。在測序儀進行正常使用之前，通常需要對其進行運行測試。測序運行測試的內容包括，測定各個堿基對應信號的強度，所以需要整張芯片上同一個測序循環(huán)后發(fā)出的都是一種熒光。Illumina公司的專利CN101415839A中，利用切割位點的方式，通過尿嘧啶-N-糖基化酶對尿嘧啶的作用所生成的雙鏈分子上無堿基位點，使“邊合成邊測序”反應中摻入的第一個堿基總是T，反應自通過該位點處的切割形成的3’末端游離羥基起始。因此如果模板多核苷酸雙鏈體形成包含許多此類分子的成簇陣列的一部分，即所有的分子都通過這種方式被切割成測序模板，那么普通摻入整個陣列的第一個堿基將是T，這可以提供一種在測序運行測試時測定各個成簇陣列強度的序列不依賴性的測定法；也就是說，無論是什么測序樣品，都可以采用該方法測定各個陣列簇的強度，這種測試方法不依賴于任何序列。但是，這種方法僅適用于成簇陣列，并且只能保證測序反應中摻入的第一個堿基總是T，對于其它三個堿基ACG則沒有提及；也就是說，雖然每個簇的第一個堿基都是T，可以用于顯示各個簇本身的強度，但是，對其它三個堿基對應信號的強度則無法確定。技術實現(xiàn)要素：本申請的目的是提供一種測序儀運行測試的新方法。為了實現(xiàn)上述目的，本申請采用了以下技術方案：1.本申請公開了一種測序儀運行測試的方法，該方法包括采用至少四種接頭構建測序文庫，四種接頭中含有不同的索引序列，索引序列的最后一個堿基分別為A、G、C、T；采用與四種接頭對應的四種測序引物，并且測序引物與各自的接頭所構建的文庫雜交后，其3’末端雜交于接頭的索引序列的倒數(shù)第二位堿基上；運行測試，將四種接頭構建的文庫上樣到芯片流道中，加入四種測序 引物，進行第一個測序循環(huán)，測試A、G、C和T四個堿基對應信號的強度。其中，索引序列的最后一個堿基，以及索引序列的倒數(shù)第二位堿基都是DNA序列按照正常的5’-3’順序排列而言的；例如本申請的一種實現(xiàn)方式中，索引序列由十個堿基組成，則其最后一個堿基即從5’-3’數(shù)的第十位堿基，倒數(shù)第二位堿基則是從5’-3’數(shù)的第九位堿基。需要說明的是，本申請的關鍵在于將四種不同索引序列的最后一個堿基分別設計為A、G、C、T，并且設計四種測序引物，測序引物與四種接頭構建的文庫雜交時，測序引物的3’末端正好雜交到索引序列的倒數(shù)第二位堿基上；這樣在進行第一個測序循環(huán)時，四種測序文庫分別添加到不同的芯片流道中，就可以保障各芯片流道中產(chǎn)生單色的堿基A或堿基G或堿基C或堿基T對應的熒光。本申請的一種實現(xiàn)方式中，四種測序文庫添加到不同的芯片流道，同時測序引物也分別添加到含有對應的測序文庫的芯片流道中，因此，四個芯片流道分別產(chǎn)生了單色的堿基A對應的熒光、堿基G對應的熒光、堿基C對應的熒光以及堿基T對應的熒光。還需要說明的是，不同的測序平臺，或者針對不同的測序對象，其接頭序列和索引序列是固定的，相應的，其測序引物序列也是相對固定的，在這種情況下，只需要將其中的四種接頭的四個索引序列的最后一個堿基分別改為A、G、C、T，并使其測序引物雜交后3’末端正好雜交到索引序列的倒數(shù)第二位堿基上，即可達到本申請的效果；因此，不同測序平臺的接頭、索引序列以及引物序列的具體序列并不構成對本申請的限定。可以理解，除以上改進以外，其它的，例如文庫的構建、上樣、測序、熒光信號收集和熒光強度測定等，都可以參考各測序平臺各自的常規(guī)測序方法，在此不累述。優(yōu)選的，運行測試時，四種接頭構建的文庫分別上樣到四個不同的芯片流道中，然后向四個芯片流道中分別加入四種測序引物的混合液，或者，四種測序引物分別加入到含對應的接頭構建的測序文庫的芯片流道中，進行第一個測序循環(huán)。優(yōu)選的，運行測試時，四種接頭構建的文庫混合一起上樣到四個芯片流道中，然后向四個芯片流道中，分別加入四種測序引物，進行第一個測序循環(huán)。需要說明的是，無論是四種接頭構建的文庫混合一起上樣，還是四種測序引物同時加入到同一個芯片流道中，根據(jù)不同的需求和試驗設計，運行測試時有以下幾種方式：第一種，四種接頭的文庫分別添加到四個芯片流道中，四種測序引物混合一起，分別向四個芯片流道中加入四種測序引物；第二種，四種接頭的文庫分別添加到四個芯片流道中，四種測序引物，對應的分別加入到四 個芯片流道中，這里所說的對應是指，向芯片流道中加入與芯片流道中的接頭文庫相對應的測序引物；第三種，四種接頭構建的文庫混合一起，做四個重復，添加到四個芯片流道中，即四個芯片流道中都分別含有四種接頭構建的文庫，然后四種測序引物分別加入到四個芯片流道中；第四種，四種接頭構建的文庫混合一起，做四個重復，添加到四個芯片流道中，四種測序引物混合一起，分別向四個芯片流道中加入四種測序引物。第一種、第二種和第三種方式都可以獲得每個芯片流道單色的熒光，第四種獲得的是A、G、C、T四色混合的熒光。優(yōu)選的，測序文庫為DNB文庫。需要說明的是，DNB即DNA納米球，是由環(huán)狀的DNA經(jīng)滾環(huán)擴增而成，即將常規(guī)的線性DNA片段環(huán)化，形成DNA環(huán)，然后采用聚合酶Phi29進行鏈置換擴增，形成以DNA環(huán)為基礎的，線性的若干個DNA環(huán)的序列重復的單鏈，由此形成的DNA納米球；需要補充說明的是，DNB只是本申請的一種優(yōu)選實施方案，本申請的方法并僅限于基于DNB的測序。優(yōu)選的，四種接頭的序列分別為SeqIDNo.1至SeqIDNo.4所示序列；四種接頭的索引序列分別為SeqIDNo.5至SeqIDNo.8所示序列。需要說明的是，接頭、索引序列的具體序列只是本申請的一種實現(xiàn)方式中的優(yōu)選方案，如前面提到的，本申請的方法并不受限于具體的接頭序列或索引序列。優(yōu)選的，四種接頭對應的測序引物序列分別為SeqIDNo.9至SeqIDNo.12所示序列。需要說明的是，測序引物序列的具體序列只是本申請的一種實現(xiàn)方式中的優(yōu)選方案，如前面提到的，本申請的方法并不受限于測序引物的具體序列。由于采用以上技術方案，本申請的有益效果在于：本申請的測序儀運行測試方法，采用四種接頭建庫，四種接頭分別含有四種索引序列，索引序列的最后一位堿基分別設計成A、G、C、T，并且設計四種測序引物，使得測序引物雜交到接頭上后，其3’末端正好雜交于索引序列最后一位堿基的前一位，因此，在運行測試時，四種測序引物分別產(chǎn)生單色的四種堿基對應的熒光，實現(xiàn)對四個堿基對應信號強度的測試。同時還能用于初期測試激光，檢測四個通道的濾片是否準確，并檢測平臺移動系統(tǒng)和自動對焦系統(tǒng)是否正常，為測序儀運行測試提供了一種簡單、有效，且全面的檢測方法。附圖說明圖1是本申請實施例中單色T堿基對應的熒光圖像；圖2是本申請實施例中單色G堿基對應的熒光圖像；圖3是本申請實施例中單色A堿基對應的熒光圖像；圖4是本申請實施例中單色C堿基對應的熒光圖像。具體實施方式本申請的測序文庫采用的是由環(huán)狀DNA擴增形成的DNB，本申請的測序儀運行測試也是以此為基礎的；因此，Illumina公司專利CN101415839A中的方法并不適合于DNB。并且，如前面提到，Illumina公司的方法僅能保障每個簇的第一個測序循環(huán)為T，無法實現(xiàn)對四個堿基熒光強度的檢測。因此，本申請創(chuàng)造性的，將四種不同索引序列的最后一個堿基分別設計為A、G、C、T，并且設計四種測序引物，使其與四種接頭雜交時，測序引物的3’末端正好雜交到索引序列的倒數(shù)第二位堿基上，這樣在采用四種測序引物進行第一個測序循環(huán)時就可以分別獲得A、G、C、T四種堿基對應的熒光信號；這不僅可以用于檢測各個堿基的熒光強度，而且可以用于初期測試激光，檢測四個通道的濾片是否準確，平臺移動系統(tǒng)和自動對焦系統(tǒng)的工作是否滿足使用需求等?？梢岳斫?，雖然本申請是在DNB的基礎上進行的研究，實施例中也是依據(jù)DNB進行的試驗；但是，采用四種不同的索引序列，將其最后一個堿基分別設計為A、G、C、T，并且設計四種測序引物，使其與四種接頭雜交時，測序引物的3’末端正好雜交到索引序列的倒數(shù)第二位堿基上，這種發(fā)明思路并不僅限于DNB；其它常規(guī)的測序文庫構建以及測試運行也可以使用本申請的方法，這都在本申請的保護范圍內。下面通過具體實施例和附圖對本申請作進一步詳細說明。以下實施例僅對本申請進行進一步說明，不應理解為對本申請的限制。實施例本例的測序文庫是由攜帶四種索引序列的接頭混合在一起形成的，四種接頭的具體序列如表1所示，四種接頭對應的索引序列如表2所示，根據(jù)四種接頭設計并合成了四種測序引物如表3所示，測序引物由nvitrogen公司合成。本例的測序芯片由CompleteGenomics提供。表1接頭序列表2索引序列編號序列(5’-3’)SeqIDNo.1TTAATTAAGG52GACTCACTGA63ATAAGGCAGT74AATATCTCTC8表3測序引物編號序列(5’-3’)SeqIDNo.1ACTGCTGACGTACTGTTAATTAAG92ACTGCTGACGTACTGGACTCACTG103ACTGCTGACGTACTGATAAGGCAG114ACTGCTGACGTACTGAATATCTCT12采用合成的表1所示序列的四種接頭進行測序文庫構建，建庫的具體流程詳見CG測序儀的雙接頭DNB建庫方式。本例中，模板庫是由切割的DNA環(huán)化形成的DNA環(huán)，DNA環(huán)化的方法參考文獻：HumanGenomeSequencingUsingUnchainedBaseReadsonSelf-AssemblingDNANanoarrays,RadojeDrmanac,etal.Science327,78(2009)；DOI:10.1126/science.1181498。具體的，將人類基因組DNA通過超聲方式打斷成主要為500bp長度的片段，片段的長度浮動區(qū)間為100bp，～400到～500bp；然后，利用聚丙烯酰胺純化柱純化獲得人類基因組DNA片段，進行DNA環(huán)化處理。DNA環(huán)化處理包括：(1)取約1微克的DNA片段以10個單位的FastAP(Fermentas,Burlington,ON,CA)處理，37攝氏度60分鐘，隨后利用AMPure(AgencourtBioscience,Beverly,MA)磁珠純化。(2)12攝氏度以40單位的T4DNA聚合酶(NewEnglandBiolabs(NEB),Ipswich,MA)孵育1小時， 利用AMPure再次純化，以上操作都依據(jù)試劑廠商的建議操作，產(chǎn)生非磷酸化的末端。(3)上述染色體DNA片段與合成的銜接頭連接，反應體系為：1.5pmol的DNA片段在50mM三羥甲基氨基甲烷，5％PEG8000，10mM氯化鎂，1mMrATP，10倍于DNA片段摩爾量的5’磷酸和3’雙脫氧法終止的銜接頭以及4000單位的T4連接酶。連接反應中，T4連接酶將銜接頭5’磷酸與染色體DNA的3’羥基形成嵌入的中間結構。連接反應結束后，通過AMPure純化，移除沒有結合銜接頭。(4)DNA在以下溶液中60攝氏度下孵育15分鐘，溶液中包括200微摩爾銜接頭的鏈聚合酶擴增反應引物，10毫摩爾三羥甲基氨基甲烷，50毫摩爾氯化鉀，1.5毫摩爾氯化鎂，1毫摩爾rATP,100微摩爾dNTPs，以便將3’端雙脫氧末端銜接頭片段換成末端為羥基的銜接頭聚合酶連擴增反應引物。反應溫度隨后減低到37攝氏度，另加50個單位的耐高溫DNA聚合酶和2000單位的T4DNA連接酶，隨后在37攝氏度孵育30分鐘。(5)約700皮摩爾AMPure純化的銜接頭連接物進行聚合酶鏈反應，反應液包括40個單位的(Stratagene,LaJolla,CA)1XPfuTurboCx，3毫摩爾硫酸鎂，300微摩爾dNTPs，5％DMSO,1摩爾三甲銨乙內酯和500納摩爾銜接頭引物進行聚合酶鏈反應；反應條件為，進行6-8個循環(huán)的：95攝氏度30秒，56攝氏度30秒，72攝氏度4分鐘。DNA片段孵育在10毫摩爾三(羥甲基)氨基甲烷，50毫摩爾氯化鈉，1毫摩爾乙二胺四乙酸中12小時。(6)利用T4連接酶使180納摩爾非磷酸化的橋接片段與銜接頭14攝氏度反應2小時形成單分子雙鏈DNA環(huán)。經(jīng)AMPure純化和37攝氏度孵育60分鐘，以減少殘余線形DNA。取3皮摩爾的DNA加入200單位的ssDNA連接酶，在60攝氏度形成最終所需的單鏈DNA環(huán)。獲得環(huán)狀的DNA后，測定DNA文庫濃度，本例構建的文庫濃度均控制為1.1ng/μL。獲得的環(huán)狀DNA在聚合酶Phi29的作用下，滾環(huán)復制半小時，制成DNB。制備DNB的具體方式為：100fmol/ul(100fmol/ul,170bp長度，約為7ng/ul)的單鏈DNA環(huán)在90攝氏度下與以下反應液反應10分鐘。反應液包括：50毫摩爾三(羥甲基)氨基甲烷，10毫摩爾硫酸銨，10毫摩爾氯化鎂，4毫摩爾二硫蘇糖醇和100納摩爾聚合酶鏈反應引物。以上反應液組成800微升體系，再加入800微摩爾dNTP和320單位的Phi29DNA聚合酶，在30攝氏度下孵育30分鐘，形成DNB。測定DNB濃度，將其配制成8ng/μL，在同一張測序芯片的8個芯片流道上，以20μL濃度為8ng/μL的DNB進行l(wèi)oading，具體的，SeqIDNo.1所示接頭構建的DNB測序文庫上樣到第一和第二芯片流道，SeqIDNo.2所示接頭構建的DNB測序文庫上樣到第三和第四芯片流道，SeqIDNo.3所示接頭構建的DNB 測序文庫上樣到第五和第六芯片流道，SeqIDNo.4所示接頭構建的DNB測序文庫上樣到第七和第八芯片流道。將四種測序引物分別配制成100μmol/L的工作液，在測序前，向測序芯片的各芯片流道中加入30μl測序引物，各測序引物對應的添加到含有相應測序文庫的芯片流道中，具體添加方式為，測序引物1添加到第一和第二芯片流道，測序引物2添加到第三和第四芯片流道，測序引物3添加到第五和第六芯片流道，測序引物4添加到第七和第八芯片流道。加入測序引物后，室溫雜交30分鐘，室溫約22℃即可，使測序引物結合到DNB上，然后利用CompleteGenomics公司的測序方法，完成第一個測序循環(huán)，具體測序方法參考CG測序儀的使用說明。完成第一個測序循環(huán)后，在熒光顯微鏡下用綠光激發(fā)，獲得單色的A、G、C、T四種堿基對應的熒光圖像。結果顯示，第一和第二芯片流道能且僅能檢出G堿基對應的熒光信號，且芯片的背景非常干凈，背景和亮點的亮度差異大，沒有信號干擾，背景最低值400，最高值2000，濾片準確，提供了單一熒光在單一激光下的亮度；第三和第四芯片流道能且僅能檢測A堿基對應的熒光信號，同樣的背景也很干凈，背景和亮點差異大，無信號干擾，背景最低值400，最高值2000，濾片準確；第五和第六芯片流道能且僅能檢測T堿基對應的熒光信號，同樣的背景也很干凈，背景和亮點差異大，無信號干擾，背景最低值400，最高值2000，濾片準確；第七和第八芯片流道能且僅能檢測C堿基對應的熒光信號，背景很干凈，背景和亮點差異大，無信號干擾，背景最低值400，最高值2000，濾片準確。并且，所有圖像都非常清晰，說明自動對焦系統(tǒng)和光學平臺的移動都正常。部分結果如圖1-圖4所示，圖1為第五芯片流道的圖像，即T堿基對應的熒光圖像；圖2為第二芯片流道的圖像，即G堿基對應的熒光圖像；圖3為第三芯片流道的圖像，即A堿基對應的熒光圖像；圖4是為第七芯片流道的圖像，即C堿基對應的熒光圖像。以上內容是結合具體的實施方式對本申請所作的進一步詳細說明，不能認定本申請的具體實施只局限于這些說明。對于本申請所屬
技術領域：
的普通技術人員來說，在不脫離本申請構思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本申請的保護范圍。當前第1頁1 2 3