本發(fā)明涉及作為JAK抑制劑的一類新化合物，包括其藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、代謝物、同位素衍生物和溶劑合物，其可用于通過調(diào)節(jié)蛋白激酶活性來調(diào)節(jié)細(xì)胞活性如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、增殖和細(xì)胞因子分泌。此外，本發(fā)明涉及包含所述化合物的藥物組合物，可用于預(yù)防或治療Janus 激酶(JAK) 相關(guān)疾病的JAK抑制劑，并可作為Janus激酶(JAK)抑制劑應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、生理學(xué)、生化學(xué)等實(shí)驗(yàn)中。所述JAK相關(guān)疾病包括炎性疾病、自身免疫性疾病、增殖性疾病、增生性疾病等。
背景技術(shù)：
蛋白激酶(PK)是調(diào)控多種重要生物過程的一組酶，所述生物過程尤其包括細(xì)胞激酶催化蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖、核苷和其他細(xì)胞代謝物的磷酸化并在真核細(xì)胞生理學(xué)的所有方面起關(guān)鍵作用。特別地，蛋白激酶和脂質(zhì)激酶參與信號傳導(dǎo)事件，該事件控制對細(xì)胞外調(diào)節(jié)物或刺激物( 如生長因子、細(xì)胞因子或趨化因子) 響應(yīng)的細(xì)胞的激活、生長、分化和存活。
Janus激酶（Janus kinase,JAK)是一類非跨膜型非受體型蛋白酪氨酸激酶家族，在細(xì)胞因子信號傳遞過程中起重要作用。JAK激酶既能磷酸化與其相結(jié)合的細(xì)胞因子受體，又能磷酸化多個(gè)含特定Src同源2結(jié)構(gòu)域（Src homology 2 domain，SH2)的信號分子。目前有四種已知的哺乳動(dòng)物JAK 家族成員：JAK1、JAK2、JAK3和TYK2。它們在結(jié)構(gòu)上有7個(gè)JAK同源結(jié)構(gòu)域（JAK homology domain, JH），其中JH1結(jié)構(gòu)域?yàn)榧っ竻^(qū)，功能是編碼激酶蛋白； JH2結(jié)構(gòu)域是“假”激酶區(qū)，對JH1的活性起調(diào)節(jié)作用；JH3-JH7組成一個(gè)四合一結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)JAK與受體的結(jié)合。JAK3分布于骨髓和淋巴系統(tǒng)中，而JAK1、JAK2、TYK2廣泛分布于多種組織細(xì)胞中。JAK激酶參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程。
信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子（signal transducer and activator of transcription，STAT)是JAK的底物。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活（STATs)蛋白家族中包括STAT1，STAT2，STAT3，STAT4，STAT5a，STAT5b及STAT6等7個(gè)成員。JAKs與STATs之間的相互作用在細(xì)胞因子受體信號通路中起著重要作用（O'SULLIVAN LA,LIONGUE C,LEWIS RS,et al.Cytokine receptor signaling through the Jak Stat pathway in disease[J].MolImmunol,2007,44{10)：2497-2506.)。當(dāng)細(xì)胞因子與其靶細(xì)胞上的特異性受體結(jié)合后可使JAK活化，繼而催化受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化,并形成相應(yīng)的STAT與受體復(fù)合物結(jié)合的“停泊位點(diǎn)”（docking site)。最后JAK激酶催化STAT蛋白磷酸化,活化的STAT形成同源或異源二聚體后進(jìn)人細(xì)胞核內(nèi)與特定的靶基因結(jié)合，調(diào)控目的蛋白表達(dá)（LVASHKIV LB,HU XY.Signaling by STATs[J].Arthritis Res Ther,2004,6(4):159-168.）,此途徑即JAK/STAT信號通路。JAK/STAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的異?；罨c腫瘤、白血病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。
JAK/STAT信號通路是近年來新發(fā)現(xiàn)的一條與細(xì)胞因子密切相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生理學(xué)過程，對機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫細(xì)胞分化發(fā)育及炎癥反應(yīng)等有重要影響，在腫瘤、炎癥及多種自身免疫等疾病的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。JAK/STAT信號通路的異常激活與多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
JAK/STAT信號通路是一條由多種細(xì)胞因子受體刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，這些因子包括白介素類(如IL-2～7，IL-9，IL-10，IL-15，IL-21等）、干擾素類(包括IFN-α，IFN-β，IFN-γ等）、促紅細(xì)胞生成素(EPO)、粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF)、促生長素（GH)、催乳素（PRL)、促血小板生成素（TPO)、血小板衍生因子（PDGF)以及表皮細(xì)胞生長因子（EGF)等，其在參與免疫調(diào)節(jié)、免疫細(xì)胞增殖等生物學(xué)過程中起關(guān)鍵作用（GHORESCHI K，LAURENCE A,O'SHEA JJ.Janus kinases in immune cell signaling [J].Immunol Rev,2009,228(1)：273-287.）。不同受體可激活不同亞型的JAK激酶，從而表現(xiàn)差異化的生物學(xué)功能。
在小鼠模型上的JAK1基因敲除實(shí)驗(yàn)表明該酶在調(diào)節(jié)上述多種細(xì)胞因子受體的生物學(xué)效應(yīng)中起著關(guān)鍵作用（KISSELEVA T,BHATTACHARYA S，BRAUNSTEIN J，et al.Signaling through the JAK/STAT pathway,recent advances and future challenges[J].Gene,2002,285 (1-2):1-24.）。
在小鼠模型中敲除JAK2可導(dǎo)致貧血引起的動(dòng)物死亡（SCHINDLER C，LEVY DE，DECKER T.JAK-STAT signaling：from interferons to cytokines[J].J Biol Chem,2007,282(28):20059-20063.）。人體中的JAK2基因上的一個(gè)堿基突變JAK2V617F,其與骨髓增生性疾病中的真性紅細(xì)胞增多癥（PV)、特發(fā)性血小板增多癥（ET)、特發(fā)性骨髓纖維化（IMF)、慢性粒細(xì)胞白血?。–ML)等的發(fā)生密切相關(guān)（GHORESCHI K，LAURENCE A,O'SHEA JJ.Janus kinases in immune cell signaling [J].Immunol Rev,2009,228(1)：273-287.）。JAK2 抑制劑已描述適用于骨髓增殖性疾病(Santos 等人,Blood,2010,115:1131 ；Barosi G. 和Rosti V.，Curr.Opin.Hematol.,2009,16:129 ；Atallah E. 和Versotvsek S.，2009Exp.Rev.Anticancer Ther.9:663)。
JAK3缺陷首次在患有常染色體隱性重度聯(lián)合免疫缺陷(SCID) 的人中被識別(Macchi等，1995.Nature377(6544) ：65-68)。JAK3 敲除小鼠也顯示SCID 但未顯示非免疫性缺陷，表明JAK3抑制劑作為免疫抑制劑將在體內(nèi)具有相關(guān)效應(yīng)并因此成為用于免疫抑制的有前景的藥物(Papageorgiou 和Wikman2004，Trends in Pharmacological Sciences25(11) ：558-62)。酪氨酸激酶JAK3的抑制劑已被描述適用作免疫抑制劑(例如美國專利6,313,129；Borie 等人,Curr.Opin.Investigational Drugs，2003，4:1297)。
TYK2是JAK家族中的第1個(gè)成員，其可被IF-Ns，IL-10,IL-6，IL-12，IL-23，IL-27等多種受體激活。在小鼠中，TYK2功能缺失會引起多種細(xì)胞因子受體的信號通路發(fā)生缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致病毒感染、抗菌免疫功能下降并增加了肺部感染的可能性等（KISSELEVA T,BHATTACHARYA S,BRAUNSTEIN J,et al.Signaling through the JAK/STAT pathway,recent advances and future challenges[J].Gene,2002,285 (1-2):1-24.）。另外,Lamer AC小組的研究表明TYK2可有助于抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移（ZHANG Q,STURGILL JL,KMIECIAK M et al.The role of Tyk2 in regulation of breast cancer growth[J].J Intetferon Cytokine Res,2011,31(9)：671-677.）
綜上所述，JAK 激酶的水平上阻斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有望開發(fā)治療或預(yù)防Janus 激酶(JAK) 相關(guān)疾病，如免疫、炎癥、自身免疫、增殖性疾病如癌癥、增生性疾病、過敏病癥或疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、干眼癥等。
目前美國輝瑞（Pfizer）公司研發(fā)的JAK抑制劑Tofacitinib能選擇性抑制JAK3激酶，于2012年11月6日被FDA批準(zhǔn)用于治療成人活動(dòng)期及對甲氨蝶呤反應(yīng)不佳的中至重度類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）。Tofacitinib 的主要副作用有嚴(yán)重感染率和低密度脂蛋白水平提高，最常見的不良反應(yīng)為上呼吸道感染、頭痛、腹瀉、鼻充血、咽喉痛和鼻咽炎。除肝脂肪變性、周圍水腫外，Tofacitinib的其他大部分不良反應(yīng)，單抗類藥物也都存在。Tofacitinib作為免疫抑制劑，批準(zhǔn)說明書中的警告和注意事項(xiàng)與抗TNF 單抗藥物基本相同。由于部分抑制了Jak2活性并干擾紅細(xì)胞生成素和集落刺激因子等細(xì)胞因子發(fā)揮效應(yīng)，因而也有臨床研究報(bào)道，Tofacitinib可引起貧血和中性粒細(xì)胞減少癥等副作用。此外，臨床試驗(yàn)顯示，Tofacitinib并不會致使T淋巴細(xì)胞總數(shù)減少，但會導(dǎo)致CD8+T細(xì)胞減少及自然殺傷細(xì)胞（NK細(xì)胞）輕微減少，因此服用Tofacitinib時(shí)還存在某些不確定的風(fēng)險(xiǎn)。[用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的 JAK 抑制劑，薛鋒，劉飛，吳剛，尤啟冬，《藥學(xué)進(jìn)展》2014，38（4）：264－273]
盡管目前已公開了一系列的JAK激酶抑制劑，但這些已上市或正處于研究階段的JAK激酶抑制劑在療效和安全性方面還有改進(jìn)的空間，仍需要開發(fā)更好藥效和安全性的新化合物。本發(fā)明的化合物作為Janus激酶(JAK)抑制劑，表現(xiàn)出良好的活性和安全性。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及作為JAK抑制劑的一類新化合物，該化合物為式（I）化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、代謝物、同位素衍生物和溶劑合物，及包含所述化合物的藥物組合物，可用于預(yù)防或治療在人體患者、哺乳動(dòng)物患者中與Janus激酶(JAK)相關(guān)的疾病和病癥；及其可作為Janus激酶(JAK)抑制劑應(yīng)用在醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生物學(xué)、生理學(xué)、生化學(xué)等實(shí)驗(yàn)中。
一種式（I）的新化合物：
（I）
包括其藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、代謝物、同位素衍生物和溶劑合物，其中：
環(huán)A為C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香環(huán)基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基、C11-15三元環(huán)基，其中環(huán)A任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R、R1所取代；
R、R1是H、鹵素、苯、C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基，其中這些環(huán)上任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R5取代；C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R6取代；
B1是H、CH3、CN、NO2、CF3、鹵素；
B2是H、CH3、CN、NO2、CF3、鹵素；
X是H、CH3、CN、NO2、CF3、C(O)NH2、鹵素；
R2是H、CH3、CN、NO2、CF3、鹵素；
R3是H、CH3、CN、NO2、CF3、鹵素；
R4是H、CN、NO2、CF3、COOH、COOR7、CONR8R8’、SONR9R9’、COR10、R11OH、鹵素；苯、C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基，其中這些環(huán)上任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R5取代；C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R6取代；
R5是H、CN、NO2、CF3、COOH、COOR7、CONR8R8’、SONR9R9’、COR10、R11OH、鹵素；苯、C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基，其中這些環(huán)上任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R5取代；C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R6取代；
R6是H、CN、NO2、CF3、COOH、COOR7、CONR8R8’、SONR9R9’、COR10、R11OH、鹵素；苯、C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基，其中這些環(huán)上任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R5取代；C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R6取代；
R7是苯、C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基，其中這些環(huán)上任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R5取代；C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R6取代；
R8、R8’分別是H、CN、NO2、CF3、COOR7、CONR8R8’、COR10、R11OH、鹵素；苯、C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基，其中這些環(huán)上任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R5取代；C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R6取代；
R9、R9’分別是H、CN、NO2、CF3、COOH、COOR7、CONR8R8’、COR10、R11OH、鹵素；苯、C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基，其中這些環(huán)上任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R5取代；C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R6取代；
R10是H、CN、NO2、CF3、COOH、COOR7、CONR8R8’、SONR9R9’、COR10、R11OH、鹵素；苯、C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基，其中這些環(huán)上任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R5取代；C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R6取代；
R11是H、苯、C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基，其中這些環(huán)上任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R5取代；C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R6取代；
Y是（CR12R13）n；
n是0或1；
R12 、R13是R5；
Z1、Z2可以分別選自C（R14）或N（R14）；
R14是H、CN、NO2、CF3、COOH、COOR7、CONR8R8’、SONR9R9’、COR10、R11OH、鹵素；苯、C3-7環(huán)烷基、C5-7芳香雜環(huán)基、C7-11芳香雙環(huán)基、C7-11芳香雜雙環(huán)基，其中這些環(huán)上任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R5取代；C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基，其中C1-8烷基、C2-8烯基、C2-8炔基任選被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的R6取代。
本發(fā)明的含義內(nèi)，如下使用術(shù)語：
“鹵素”是指F、Cl、Br、I、At。
“C3-7環(huán)烷基”是指具有3-7個(gè)碳原子的環(huán)烷基鏈，例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)己烯基、環(huán)庚基。環(huán)烷基碳的每個(gè)氫可被進(jìn)一步規(guī)定的取代基替換。
“C5-7芳香雜環(huán)基”是指具有具有5-7個(gè)碳原子的芳香雜環(huán)基，例如咪唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶等。芳香雜環(huán)基的每個(gè)氫可被進(jìn)一步規(guī)定的取代基替換。
“C7-11芳香雙環(huán)基”是指具有具有7-11個(gè)碳原子的芳香雙環(huán)基，例如萘、茚等。芳香雙環(huán)基的每個(gè)氫可被進(jìn)一步規(guī)定的取代基替換。
“C7-11芳香雜雙環(huán)基”是指具有具有7-11個(gè)碳原子的芳香雜雙環(huán)基，例如喹啉、異喹啉、苯并噻唑等。芳香雜雙環(huán)基的每個(gè)氫可被進(jìn)一步規(guī)定的取代基替換。
“Cl-8烷基”是指具有1-8個(gè)碳原子的烷基鏈，例如：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基。Cl-8烷基碳的每個(gè)氫可被進(jìn)一步規(guī)定的取代基替換。
“C2-8烯基”是指具有2-8個(gè)碳原子的烯基鏈，例如：-CH=CH，，一CH=CH-CH3，-CH2-CH=CH2，-CH=CH-CH2-CH3，-CH=CH-CH=CH2。C2-8烯基碳的每個(gè)氫可被進(jìn)一步規(guī)定的取代基替換。
“C2-8炔基”是指具有2-8個(gè)碳原子的炔基鏈，例如：-C - CH，-CH.,-C - CH，CH2-CH2-C三CH，CH2-C - C-CH3。C2-6炔基碳的每個(gè)氫可被進(jìn)一步規(guī)定的取代基替換。
Tofacitinib：
Decernotinib：
Filgotinib：
對于式(I)化合物，本發(fā)明還包括所有比例的所有互變異構(gòu)體和立體異構(gòu)體形式及其混合物，及其藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、代謝物、同位素衍生物和溶劑合物，及包含所述化合物的藥物組合物。
式(I)化合物的藥學(xué)可接受的鹽，包含一個(gè)或多個(gè)堿性或酸性基團(tuán)，本發(fā)明還包括其相應(yīng)的藥學(xué)上或毒理學(xué)上可接受的鹽，特別是其藥學(xué)上可利用的鹽。因此，包含酸性基團(tuán)的式(I)化合物能根據(jù)本發(fā)明使用，例如作為堿金屬鹽、堿土金屬鹽或作為銨鹽。這樣的鹽的更精確的實(shí)例包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽或與氨或有機(jī)胺如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸的鹽?？纱嬖诓⒖筛鶕?jù)本發(fā)明以其與無機(jī)酸或有機(jī)酸的加成鹽的形式使用包含一個(gè)或多個(gè)堿性基團(tuán)，即能被質(zhì)子化的基團(tuán)的式(I)化合物。適當(dāng)酸的實(shí)例包括鹽酸、硫酸、磷酸、硝酸、甲磺酸、乳酸、蘋果酸、馬來酸、苯甲酸、酒石酸、草酸、對甲苯磺酸等以及本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他酸。如果式(I)化合物在分子內(nèi)同時(shí)包含酸性和堿性基團(tuán)，本發(fā)明還包括除了提及的鹽形式之外的內(nèi)鹽或內(nèi)銨鹽（兩性離子）。式(I)的各個(gè)鹽能由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法獲得，例如通過使這些與有機(jī)或無機(jī)酸或堿在溶劑或分散劑中接觸獲得，或通過與其他鹽進(jìn)行陰離子交換或陽離子交換獲得。本發(fā)明還包括式(I)化合物的所有鹽，其由于低生理學(xué)相容性不直接適用于藥物，但是其可例如用作化學(xué)反應(yīng)的中間體或用于制備藥學(xué)上可接受的鹽。
在本發(fā)明中，術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指相應(yīng)的化合物、載體或分子適于給予人。優(yōu)選地，該術(shù)語是指由管理機(jī)構(gòu)例如CFDA（中國）、EMEA（歐洲）、FDA (美國)等任意國家管理機(jī)構(gòu)認(rèn)證的用于哺乳動(dòng)物優(yōu)選人。
“前藥”是指通過與酶、胃酸等在生理?xiàng)l件下在活體內(nèi)例如通過各自在酶催化下進(jìn)行的氧化、還原、水解等反應(yīng)轉(zhuǎn)化為本發(fā)明化合物的衍生物。
“代謝物”是指在細(xì)胞或有機(jī)體優(yōu)選人中源自本發(fā)明任意化合物的所有分子。
“同位素衍生物”是指與構(gòu)成化合物之一或多個(gè)原子處以非天然比例含有同位素的所述的化合物。例如氘 ( 2 H 或 D)、 碳 -13( 13 C)、 氮 -15( 15 N) 等。
“溶劑合物”是指通常通過溶劑分解反應(yīng)與溶劑物理結(jié)合的化合物形式。此物理結(jié)合包含氫鍵結(jié)合。常規(guī)溶劑包含水、乙醇、甲醇、乙酸等。式（I）化合物可以結(jié)晶形式制備且可呈溶劑合物形式（例如水合形式）。適宜溶劑合物包含藥學(xué)可接受的溶劑合物( 例如水合物)，且進(jìn)一步包含化學(xué)計(jì)量溶劑合物及非化學(xué)計(jì)量溶劑合物。在某些情形下，例如當(dāng)一個(gè)或多個(gè)溶劑分子納入結(jié)晶固體的晶格中時(shí)，溶劑合物將能夠解離。“溶劑合物”涵蓋溶液相及可解離溶劑合物。代表性溶劑合物包含水合物、乙醇合物及甲醇合物等。
式(I)化合物可以晶體或無定形形式存在。此外，式(I)化合物的某些晶體形式可以多晶型形式存在，其包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。可以使用許多常規(guī)分析技術(shù)包括但不限于X-射線粉末衍射(XRPD)圖、紅外(IR)光譜、拉曼光譜、差示掃描量熱法(DSC)、熱重分析(TGA)和固體核磁共振(ssNMR)表征來區(qū)分式(I)化合物的多晶型。
“藥物組合物”在用作藥物時(shí)，本發(fā)明式I化合物及式I化合物的鹽、同位素衍生物、代謝物、前藥、溶劑合物與具有生物活性和或不具有生物活性物質(zhì)組成的組合物作為JAK抑制劑在治療或預(yù)防免疫、自身免疫性或變應(yīng)性病癥、增生疾病或增殖性疾病、炎癥、過敏病癥、移植排斥、免疫介導(dǎo)中的應(yīng)用。
本發(fā)明的藥物組合物可以含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，可用作制成注射和非注射給藥途徑的藥物制劑和藥物劑型。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域所有的可用于制成注射和非注射給藥途徑的藥物制劑，例如稀釋劑、潤濕劑、填充劑、粘合劑、濕滑劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、阻滯劑、吸附劑、助懸劑、絮凝劑、反絮凝劑、乳化劑、常用基質(zhì)、增溶劑、助溶劑、潛溶劑、防腐劑、矯味劑、著色劑、抗氧劑、緩沖劑、抑菌劑、等滲調(diào)節(jié)劑、PH調(diào)節(jié)劑、金屬離子絡(luò)合劑、硬化劑、增稠劑、吸收促進(jìn)劑等。
本發(fā)明式(I)化合物和藥物組合物可制成注射或非注射給藥途徑的藥物制劑和藥物劑型。適于皮下注射、肌肉注射、靜脈注射、口服、肺部（鼻或口腔吸入）、直腸、局部、腸胃外、關(guān)節(jié)內(nèi)、眼部、鼻腔給藥等，雖然在任意給定情況下最適當(dāng)?shù)耐緩綄⒁蕾囉谝委煹募膊顟B(tài)的性質(zhì)和嚴(yán)重程度以及活性成分性質(zhì)。它們可以方便地存在于單一劑型中，并且由藥學(xué)領(lǐng)域公知的任意方法制備。
本發(fā)明中Janus激酶(JAK)相關(guān)的疾病和病癥為免疫、炎癥、自身免疫、增殖性疾病如癌癥、增生性疾病、過敏病癥或疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、干眼癥等。
自身免疫疾病為至少部分由身體對抗自身組分例如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)或DNA 的免疫反應(yīng)引發(fā)的疾病。器官特異性自身免疫病癥的實(shí)例為影響胰腺的胰島素依賴性糖尿病(I 型)、影響甲狀腺的橋本甲狀腺炎和格雷夫斯病、影響胃的惡性貧血、影響腎上腺的庫欣病和愛迪生氏病、影響肝的慢性活動(dòng)性肝炎；多囊卵巢綜合征(PCOS)、乳糜瀉、牛皮癬、炎性腸病(IBD) 和強(qiáng)直性脊柱炎。非器官特異性自身免疫病癥的實(shí)例為類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和重癥肌無力。
炎癥性腸病(IBD)是一組免疫介導(dǎo)的慢性非特異性腸道炎癥性疾病，主要包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC)和克羅恩?。–D),是胃腸道炎癥性疾病的重要類型之一?？肆_恩病最常涉及末端回腸和結(jié)腸，并且是透壁的和不連續(xù)的。相反，在潰瘍性結(jié)腸炎中，炎癥是連續(xù)的并且限于直腸和結(jié)腸粘膜層。在限定至回腸和結(jié)腸的大約10%的情況下，克羅恩病或潰瘍性結(jié)腸炎的確定分類不能被做出，并且被稱為“不確定的結(jié)腸炎”。兩種疾病都包括皮膚、眼睛或關(guān)節(jié)的腸外炎癥。中性粒細(xì)胞誘導(dǎo)的傷害可通過使用中性粒細(xì)胞遷移抑制劑而預(yù)防(Asakura 等，2007，World J Gastroenterol.13(15) ：2145-9)。
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是由T-細(xì)胞介導(dǎo)的B-細(xì)胞激活產(chǎn)生的慢性炎性疾病，其導(dǎo)致血管球性腎炎和腎衰竭。人SLE在早期的特征為持久的自身反應(yīng)性CD4+記憶細(xì)胞的擴(kuò)張(D'Cruzetal.,2007, Lancet 369 (9561):587-596)。
類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以對稱性、多關(guān)節(jié)炎為主要表現(xiàn)的慢性、全身性自身免疫疾病，病變主要累及關(guān)節(jié)的滑膜關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)外的表現(xiàn)廣泛而多變，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞、功能喪失致殘率較高。
多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)炎癥性脫髓鞘性自身免疫性疾病，髓鞘脫失與浸潤的淋巴細(xì)胞（CD4+ T)介導(dǎo)的細(xì)胞免疫有關(guān)。SOCS1能抑制JAK2誘導(dǎo)的STAT3的磷酸化,使用JAK2 抑制劑(AG490)可以模擬SOCS1對JAK2-STAT3的抑制作用。（SOCS1-JAK2-STAT3信號通路在C57BL/6小鼠實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎模型中作用機(jī)制探討，董梅等，中國免疫學(xué)雜志，2014，30（4）：459～463）。
I型糖尿病由自身反應(yīng)性T細(xì)胞對分泌胰島素的胰島β細(xì)胞的選擇性進(jìn)攻而繼發(fā)。在這種疾病中以JAK3為靶標(biāo)是基于這樣的觀察：已知通過JAK途徑傳導(dǎo)信號的多種細(xì)胞因子參與β細(xì)胞的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性損傷。事實(shí)上，JAK3 抑制劑，JANEX-1在I型糖尿病的NOD小鼠模型中顯示預(yù)防自發(fā)的自身免疫性糖尿病的發(fā)展。
本發(fā)明的另一方面為本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽用于治療或預(yù)防增生疾病尤其是癌癥的方法。癌癥包含一組特征在于異常細(xì)胞的失控生長和擴(kuò)散的疾病。通常，癌癥分類為實(shí)體瘤的癌癥 ( 如，前列腺癌、腎癌、肝癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌、宮頸癌、肺癌、頭頸部癌、甲狀腺癌、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、卡波濟(jì)氏肉瘤、卡斯特萊曼病、黑色素瘤等)，血液癌癥 ( 如，淋巴瘤、白血病，諸如急性成淋巴細(xì)胞性白血病、急性髓細(xì)胞性白血病(AML) 或多發(fā)性骨髓瘤)，皮膚癌（諸如皮膚T細(xì)胞淋巴瘤(CTCL) 和皮膚B 細(xì)胞淋巴瘤以及示例性皮膚T細(xì)胞），淋巴瘤（包括塞澤里綜合征(Sezary syndrome)和蕈樣肉芽腫?。┑取?/p>
移植排斥（同種異體移植排斥）包括但不限于例如腎、心臟、肝、肺、骨髓、皮膚和角膜的移植之后的急性和慢性同種異體排斥。已知T細(xì)胞在同種異體排斥的特異性免疫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用。超急性、急性和慢性器官移植排斥可以治療。超急性排斥發(fā)生在移植的幾分鐘內(nèi)。急性排斥通常發(fā)生在移植的六至十二個(gè)月之內(nèi)。超急性和急性排斥通常是可逆的，其中用免疫抑制劑治療。特征為器官功能的逐漸損失的慢性排斥是移植接受者持續(xù)關(guān)心的，因?yàn)槠淇稍谝浦埠蟮娜魏螘r(shí)間發(fā)生。
移植物抗宿主病(GVDH)是異源骨髓移植(BMT)的主要并發(fā)癥。GVDH由識別組織相容性復(fù)雜系統(tǒng)中的接受者差異并且對其作出反應(yīng)的供體T細(xì)胞引起，這導(dǎo)致了顯著的發(fā)病率和死亡率。JAK3在誘導(dǎo)GVHD中起關(guān)鍵作用，用JAK3押制劑JANEX-1進(jìn)行治療顯示出削弱GVHD嚴(yán)重性(綜述在Cetkovic-Cvrlje and Ucken，2004)。
干眼癥(DES，也稱為干燥性角膜結(jié)膜炎) 是眼科醫(yī)生治療的最常見問題之一。有時(shí)DES 被稱為淚液功能不全綜合征(Jackson，2009.Canadian Journal Ophthalmology44(4)，385-394)。DES影響最高達(dá)10%的年齡在20至45歲之間的人口，且百分比隨年齡增長。盡管可利用許多種類的人工淚液產(chǎn)品，但這些產(chǎn)品僅提供癥狀的暫時(shí)緩解。因此，需要治療干眼的制劑、組合物和治療方法。干眼有時(shí)也稱為干燥性角膜結(jié)膜炎，干眼癥的治療包括改善干眼癥的特定癥狀，如眼部不適、視覺障礙、淚膜不穩(wěn)定、眼淚高滲透壓和眼球表面的炎癥。
因此，本發(fā)明的另一方面為本發(fā)明的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、代謝物、同位素衍生物和溶劑合物，及包含所述化合物的藥物組合物，用于預(yù)防或治療免疫、炎癥、自身免疫、增殖性疾病如癌癥、增生性疾病、過敏病癥或疾病、移植排斥或移植物抗宿主病、干眼癥等的方法。
本發(fā)明有益的效果
通過本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)施，結(jié)果表明本發(fā)明所述的化合物（式I）具有良好的抑制JAK活性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，與Tofacitinib具有生物相似性，無細(xì)胞毒性，大鼠單次口服灌胃給藥未見明顯毒性。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1：2-(2-{5-氟-4-[(吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-亞甲基)-胺]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
化合物結(jié)構(gòu)：
合成路線：
合成方法：
取一定量的2,4-二氯-5-氟嘧啶放置到三口燒瓶中，加1～5倍量的二異丙基乙胺和異丙醇混合溶劑，攪拌均勻，將嘧啶并吡啶-6-甲基氨基溶于1～10倍量異丙醇的溶液，然后慢慢加入到三口燒瓶中，加完后，-10℃至30℃反應(yīng)1小時(shí)～10小時(shí)，自然升至室溫，產(chǎn)生產(chǎn)生大量沉淀，加二氯甲烷至固體全部溶解，然后以飽和食鹽水洗滌有機(jī)物。有機(jī)物用無水硫酸鎂干燥后，濾去干燥劑蒸干，柱色譜提純得白色產(chǎn)物（2-氯-5-氟嘧啶-4-基）-吡啶并[ 2,3 -d]嘧啶-6-甲基胺，產(chǎn)率50％～70％。
取一定量的（2-氯-5-氟嘧啶-4-基）-吡啶并[ 2,3-d]嘧啶-6-甲基胺，放置到三口燒瓶中，加1～5倍量的異丙醇，攪拌均勻，通過雙排管技術(shù)排空反應(yīng)體系的空氣，并充以氮?dú)猓粚?-羥乙基、2-氨基咪唑溶于1～10倍量異丙醇的溶液，加入到反應(yīng)體系中，50℃至150℃反應(yīng)5小時(shí)～24小時(shí)，冷卻后，加入乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉混合溶液，攪拌30分鐘后，分出有機(jī)相，水相用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)相和萃取相。無水硫酸鎂干燥。濾去干燥劑蒸干，柱色譜純化得白色產(chǎn)物2-(2-{5-氟-4-[(吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-亞甲基)-胺]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇，產(chǎn)率50％～80％。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ7.88(1H), δ8.75(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ8.78(1H), δ9.26(1H)
實(shí)施例2：5-氟-N2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-N4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-嘧啶-2,4-二胺
化合物結(jié)構(gòu)：
合成路線：
合成方法：
取一定量的2,4-二氯-5-氟嘧啶放置到三口燒瓶中，加1～5倍量的二異丙基乙胺和異丙醇混合溶劑，攪拌均勻，將3-（1 -甲基-1H-吡唑-4-基）芐胺溶于1～10倍量異丙醇的溶液，然后慢慢加入到三口燒瓶中，加完后，－10℃至30℃反應(yīng)1小時(shí)～10小時(shí)，自然升至室溫，產(chǎn)生產(chǎn)生大量沉淀，加二氯甲烷至固體全部溶解，然后以飽和食鹽水洗滌有機(jī)物。有機(jī)物用無水硫酸鎂干燥后，濾去干燥劑蒸干，柱色譜提純得白色產(chǎn)物(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-胺，產(chǎn)率55％～80％。
取一定量的(2-氯-5-氟-嘧啶-4-基)-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-胺，放置到三口燒瓶中，加1～5倍量的異丙醇，攪拌均勻，通過雙排管技術(shù)排空反應(yīng)體系的空氣，并充以氮?dú)猓粚?-甲基、2-氨基咪唑溶于1～10倍量異丙醇的溶液，加入到反應(yīng)體系中，50℃至150℃反應(yīng)5小時(shí)～24小時(shí)，冷卻后，加入乙酸乙酯和飽和碳酸氫鈉混合溶液，攪拌30分鐘后，分出有機(jī)相，水相用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗滌有機(jī)相和萃取相。無水硫酸鎂干燥。濾去干燥劑蒸干，柱色譜純化得白色產(chǎn)物5-氟-N2-(1-甲基-1H-咪唑-2-基)-N4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-嘧啶-2,4-二胺，產(chǎn)率50％～70％。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ7.0(1H), δ6.9(1H), δ3.63(3H), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ3.80(3H)
實(shí)施例3：2-(2-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H),δ4.0(1-NH),δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ7.02(2H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ3.8(3H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH)
實(shí)施例4：2-(2-{5-氯-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.97(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ8.20(1H), δ8.34(1H), δ3.8(3H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(92H), δ2.0(1-OH)
實(shí)施例5：2-(2-{4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-5-三氟甲基-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.52(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ8.40(1H), δ8.40(1H), δ13.7(1NH), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH)
實(shí)施例6：2-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-5-腈
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：415.19
實(shí)施例7：2-(2-{5-氟-4-[3-氟-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：426.17
實(shí)施例8：2-(2-{4-[3-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：404.21
實(shí)施例9：2-(2-{4-[(1H-苯并咪唑-5-亞甲基)-胺]-5-氟-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例1。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4.32(1H), δ7.50(1H), δ7.58(1H), δ7.06(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H) ,δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ8.08(1H), δ5.0(1NH)
實(shí)施例10：2-(2-{4-[(6,9-二氫-嘌呤-1-亞甲基)-胺]-5-氟-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例1。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ3.81(92H), δ7.50(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ7.4(1H), δ13.4(1NH)
實(shí)施例11：2-(2-{5-氟-4-[(9-羥基甲基-6,9-二氫-嘌呤-1-亞甲基)-胺]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例1。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ3.75(92H), δ7.50(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ7.2(1H), δ5.97(2H), δ2.0(1-OH)
實(shí)施例12：2-[2-(5-氟-4-{1-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-乙胺基}-嘧啶-2-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：422.20
實(shí)施例13：2-(2-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯胺基]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ6.42(1H), δ7.07(1H), δ6.84(1H), δ6.68(1H), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ3.80(3H), δ4.0(1-NH)
實(shí)施例14：2-(2-{5-氟-4-[3-氟-5-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯胺基]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ6.13(1H), δ6.55(1H), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ3.80(3H), δ4.0(1-NH)
實(shí)施例15：2-(2-{4-[3-(1-乙基-1H-吡唑-4-基)-苯胺基]-5-氟-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：408.18
實(shí)施例16：2-{2-[4-(1H-苯并咪唑-5-基氨基)-5-氟-嘧啶-2-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
合成方法參照實(shí)施例1。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ6.90(1H), δ7.45(1H), δ6.46(1H), δ4.0(1-NH), δ8.08(1H), δ5.0(1-NH)
實(shí)施例17：2-{2-[5-氟-4-(吡啶并[2,3-d]嘧啶-6-基氨基)-嘧啶-2-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
合成方法參照實(shí)施例1。
MS：367.13
實(shí)施例18：2-{2-[4-(6,9-二氫-嘌呤-1-基氨基)-5-氟-嘧啶-2-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
合成方法參照實(shí)施例1。
MS：358.14
實(shí)施例19：2-{2-[5-氟-4-(9-羥基甲基-6,9-二氫-嘌呤-1-基氨基)-嘧啶-2-基氨基]-咪唑-1-基}-乙醇
合成方法參照實(shí)施例1。
MS：388.15
實(shí)施例20：2-[2-(5-氟-4-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-苯基]-胺}-嘧啶-2-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：408.18
實(shí)施例21：2-{2-[(5-氟-4-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-胺}-嘧啶-2-基)-甲基-胺]-咪唑-1-基}-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.32(2H), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1OH), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ3.80(3H), δ2.47(3H), δ2.47(3H)
實(shí)施例22：2-[2-({5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基}-甲基-胺)-咪唑-1-基]-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ3.80(3H), δ2.47(3H)
實(shí)施例23：2-[2-(5-氟-4-{甲基-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-胺}-嘧啶-2-基氨基)-咪唑-1-基]-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(91H), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ3.80(3H), δ2.47(3H)
實(shí)施例24：1-{4-[3-({5-氟-2-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-乙酮
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4,32(2H), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ7.0(1H), δ7.0(1H), δ3.92(2H), δ4.01(2H), δ2.0(1-OH), δ8.4(1H), δ8.4(1H), δ2.20(3H)
實(shí)施例25：{4-[3-({5-氟-2-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-甲基磺酰胺
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：487.16
實(shí)施例26：{4-[3-({5-氟-2-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-甲基)-苯基]-吡唑-1-基}-乙酸
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：452.17
實(shí)施例27：{4-[3-({5-氟-2-[1-(2-羥基-乙基)-1H-咪唑-2-基氨基]-嘧啶-4-基氨基}-甲基)-苯基]吡唑-1-基}-乙酸甲基酯
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：466.19
實(shí)施例28：2-(2-{5-氟-4-[3-(1-羥基甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙醇
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：424.18
實(shí)施例29：(2-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-甲基磺酰胺
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：457.14
實(shí)施例30：(2-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙酸
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：422.16
實(shí)施例31：(2-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-乙酸甲基酯
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：436.18
實(shí)施例32：(2-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-咪唑-1-基)-甲醇
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：394.17
實(shí)施例33：5-氟-N4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-N2-(4-甲基-4H-[1,2,4]三唑-3-基)-嘧啶-2,4-二胺
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：379.17
實(shí)施例34：(3-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-甲基磺酰胺
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ7.0(1H), δ6.9(1H), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ3.80(3H), δ5.85(2H), δ2.0(2-NH)
實(shí)施例35：(3-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-乙酸
合成方法參照實(shí)施例2。
1H-NMR(400MHZ,CDCl3, TMS, ppm):
δ7.44(1H), δ4.0(1-NH), δ4.0(1-NH), δ4.32(2H), δ7.02(1H), δ7.20(1H), δ7.29(1H), δ7.28(1H), δ7.0(1H), δ6.9(1H), δ8.34(1H), δ8.20(1H), δ3.80(3H), δ4.67(2H), δ11.0(1-OH)
實(shí)施例36：(3-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-乙酸甲基酯
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：437.17
實(shí)施例37：(3-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-[1,2,4]三唑-4-基)-甲醇
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：395.16
實(shí)施例38：5-氟-N4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐]-N2-(2-甲基-2H-[1,2,4]三唑-3-基)-嘧啶-2,4-二胺
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：379.17
實(shí)施例39：(5-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-[1,2,4]三唑-1-基)-甲基磺酰胺
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：458.14
實(shí)施例40：(5-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：423.16
實(shí)施例41：(5-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-[1,2,4]三唑-1-基)-乙酸甲基酯
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：437.17
實(shí)施例42：(5-{5-氟-4-[3-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-芐基氨基]-嘧啶-2-基氨基}-[1,2,4]三唑-1-基)-甲醇
合成方法參照實(shí)施例2。
MS：395.16
實(shí)施例43：與JAK3靶標(biāo)的結(jié)合試驗(yàn)
將本發(fā)明實(shí)施例1～42所列的化合物、Tofacitinib和Decernotinib分別與JAK3進(jìn)行分子對接，觀察其與JAK3靶標(biāo)的結(jié)合情況。結(jié)果見表1。
表1 與JAK3靶標(biāo)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果
注：1.（A）80＜與JAK3靶標(biāo)的結(jié)合度＜100；
2.（B）100＜與JAK3靶標(biāo)的結(jié)合度＜120；
3.（C）120＜與JAK3靶標(biāo)的結(jié)合度＜140；
4.（D）與JAK3靶標(biāo)的結(jié)合度＞140。
實(shí)施例44：與STAT3靶標(biāo)的結(jié)合試驗(yàn)
將本發(fā)明實(shí)施例1～42所列的化合物、Tofacitinib、Filgotinib和Decernotinib分別與STAT3進(jìn)行分子對接，觀察其與STAT3靶標(biāo)的結(jié)合情況。結(jié)果見表2。
表2 與STAT3靶標(biāo)的結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果
注：1.（A）80＜與STAT3靶標(biāo)的結(jié)合度＜100；
2.（B）100＜與STAT3靶標(biāo)的結(jié)合度＜120；
3.（C）120＜與STAT3靶標(biāo)的結(jié)合度＜140；
4.（D）與STAT3靶標(biāo)的結(jié)合度＞140。
實(shí)施例45：對JAK的抑制作用
研究化合物對純化的重組JAK活性的影響,是從酶學(xué)水平研究化合物對JAK的抑制活性。其實(shí)驗(yàn)原理為采用一種發(fā)光法激酶檢測方法，用于檢測JAK與底物Poly (4:1 Glu, Tyr)肽反應(yīng)產(chǎn)生的ADP含量：ADP轉(zhuǎn)化為ATP后，ATP 即可作為Ultra-Glo熒光素酶催化反應(yīng)的底物，產(chǎn)生光信號。發(fā)光信號與ADP的量和激酶活性正相關(guān)。因此，通過觀察化合物對JAK與底物反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光信號來確定其對重組的JAK的抑制效果，用IC50表示。
實(shí)驗(yàn)方法：10個(gè)不同濃度的化合物分別在37℃與JAK1、JAK2和JAK3孵育60分鐘，然后加入底物及ATP混合，37℃反應(yīng)50分鐘后加入25μlADP-Glo?混合2分鐘，室溫反應(yīng)50分鐘。再加入50μl檢測試劑混合2分鐘，室溫孵育50分鐘，用化學(xué)發(fā)光儀檢測。結(jié)果見表3。
表3 對JAK的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果
注：1.（A）20nM 或更??；
2.（B）>20nM 至100nM；
3.（C）> 100nM
實(shí)施例46 ：對p-STAT5的抑制作用
JAK-STAT信號傳遞通路主要發(fā)生在白細(xì)胞中，因此參與免疫調(diào)節(jié)。 IL-3 激活細(xì)胞膜上的受體后導(dǎo)致JAK2發(fā)生自身磷酸化并激活。STAT蛋白結(jié)合在磷酸化的受體上并被JAK磷酸化。磷酸化的STAT與另外一個(gè)磷酸化的STAT蛋白結(jié)合形成二聚體并向細(xì)胞核轉(zhuǎn)移。在細(xì)胞核，STAT與DNA結(jié)合并促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，引起免疫反應(yīng)。因此，通過觀察化合物對IL-3介導(dǎo)的STAT5（如下表所示）的磷酸化來確定其對JAK2的抑制效果。
實(shí)驗(yàn)方法：將化合物按照11個(gè)不同濃度用DMSO稀釋，取200μl稀釋后的化合物加入24孔板；將TF-1細(xì)胞（ATCC TIB-202）用0.5%的血清饑餓過夜，然后將其調(diào)整到2×106 /ml，取200μl細(xì)胞加入到上述已經(jīng)加入化合物的24孔板中，混勻后，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育60分鐘；60分鐘后，每孔加入12ng的IL-3，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱再刺激60分鐘；刺激60分鐘后， 2%PFA室溫固定30分鐘；將固定后的細(xì)胞加入到BD流式管中，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入500μl甲醇，4℃孵育60分鐘穿膜；4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；每管加入5μl STAT5（pY694）抗體（562077），室溫避光孵育60分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm，5分鐘；每管加入300μlFACS buffer重懸，用流式細(xì)胞儀檢測，觀察化合物對p-STAT5的抑制作用，用IC50表示。結(jié)果見表4。
表4 對p-STAT5的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果
注：1.（A）200nM 或更?。?/p>
2.（B）>200nM 至2000nM；
實(shí)施例47 ：對p-STAT6的抑制作用
IL-4誘導(dǎo)STAT6的磷酸化是檢測抑制劑在JAK1-JAK3通路的細(xì)胞水平活性的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)。
實(shí)驗(yàn)方法：將化合物按照11個(gè)不同濃度用DMSO稀釋，取200μl稀釋后的化合物加入24孔板；將THP1細(xì)胞（ATCC TIB-202）調(diào)整到2×106 /ml，取200μl細(xì)胞加入到上述已經(jīng)加入化合物的24孔板中，混勻后，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育60分鐘；60分鐘后，每孔加入8ng的IL-4，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱再刺激60分鐘；刺激60分鐘后，用2%PFA室溫固定30分鐘；將固定后的細(xì)胞加入到BD流式管中，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入500μl甲醇，4℃孵育60分鐘穿膜；4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；每管加入5μlSTAT6（pY641）抗體（562078），室溫避光孵育60分鐘；加入2mlFACS buffer，4℃水平離心，1500rpm, 5分鐘；每管加入300μlFACS buffer重懸，用流式細(xì)胞儀檢測，觀察化合物對p-STAT6的抑制作用，用IC50表示。結(jié)果見表5。
表5 對p-STAT6的抑制作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果
注：1.（A）200nM 或更?。?/p>
2.（B）>200nM 至2000nM；
實(shí)施例48 ：對膠原蛋白誘發(fā)的小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的影響
在膠原蛋白誘發(fā)的小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（CIA）模型中，研究選擇的化合物的抑制活性。Ⅱ型膠原蛋白（CII）大多存在于關(guān)節(jié)軟骨中，是一種與免疫系統(tǒng)隔絕的蛋白質(zhì)，但在病理?xiàng)l件下可作為一種自身抗體呈現(xiàn)出來，50％類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）患者血清中存在抗CII的自身抗體，這表明CII可誘導(dǎo)產(chǎn)生關(guān)節(jié)炎性質(zhì)的自身免疫反應(yīng)。
用10周齡雄性DBA-1小鼠進(jìn)行二次免疫，初次免疫（在第０日）：酒精棉球消毒小鼠尾根部皮膚，于小鼠尾根部2-3cm處皮下注射乳化好的膠原蛋白100μl（CII與CFA體積比為1:1）（含CII 150μg和熱滅活的分枝桿菌50μg）；二次免疫（在第21日）：酒精棉球消毒小鼠尾根部皮膚，于小鼠尾根部2-3cm處皮下注射乳化好的膠原蛋白50μl（CII與IFA體積比為1:1）（含CII 75μg）。二次免疫后小鼠隨機(jī)分組，分為對照組(助溶劑組)和試驗(yàn)組。試驗(yàn)組將化合物懸浮于1%甲基纖維素的水懸浮液，在第23日開始給藥至第41日結(jié)束給藥，藥物劑量為30mg/kg，每次灌胃200μl，每天2次；對照組同法給予助溶劑。每日測評臨床炎癥癥狀分?jǐn)?shù)。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：無紅斑和水腫；1分：兩只足小趾關(guān)節(jié)紅斑水腫；2分：全部趾關(guān)節(jié)或前腳掌紅斑水腫；3分：踝關(guān)節(jié)以下延伸到趾關(guān)節(jié)紅斑水腫；4分：踝關(guān)節(jié)至全爪紅腫或關(guān)節(jié)畸形。每只小鼠四肢評分相加總評分為小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)，總分為16分。分別觀測對照組和試驗(yàn)組小鼠炎癥癥狀，計(jì)算臨床炎癥癥狀分值，采用雙側(cè)、非配對t-檢驗(yàn)法比較試驗(yàn)組與對照組的臨床炎癥癥狀分值，評價(jià)化合物對膠原蛋白誘發(fā)的小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的影響，用P值表示。結(jié)果見表6。
表6 對膠原蛋白誘發(fā)的小鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的影響
注：1.P＜0.05，試驗(yàn)組與對照組小鼠臨床炎癥癥狀分值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較差異有顯著性；
2.P＜0.01，試驗(yàn)組與對照組小鼠臨床炎癥癥狀分值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比較差異有極顯著性。
實(shí)施例49 ：對人腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用
取人胃癌細(xì)胞SNU-5、肝癌細(xì)胞Hep-G2、肺癌細(xì)胞EBC-1、胃癌細(xì)胞BGC-823、腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87MG、宮頸癌細(xì)胞Hela、乳腺癌細(xì)胞Bcap-37，將化合物用DMSO配制成20mM的溶液，將系列化合物和紫杉醇（儲液0.2mM）用DMSO 3倍梯度稀釋（10個(gè)濃度）；分別取5μl梯度稀釋好的化合物溶液和紫杉醇加入到495μl含有10% FBS的培養(yǎng)基中，配制成2X待測化合物。
取100μl含2X待測化合物、紫杉醇加到96孔板相應(yīng)孔中，二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)72小時(shí)。
去除培養(yǎng)基，每孔加入XTT工作液（0.3mg/ml XTT；0.00265mg/ml PMS）150μl，二氧化碳培養(yǎng)箱中放置2小時(shí)，微孔板振蕩器震蕩5分鐘，酶標(biāo)儀450nm讀取吸光值，計(jì)算化合物對人腫瘤細(xì)胞的抑制率（%），求得IC50值（μM）。結(jié)果見表7。
表7 對人腫瘤細(xì)胞體外增殖的抑制作用（IC50，μM）
實(shí)施例50 ：藥代動(dòng)力學(xué)及生物利用度試驗(yàn)
取化合物，健康小鼠單次口服灌胃給藥，劑量為30mg/kg，取小鼠血清，測定相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并與Tofacitinib比較，計(jì)算相對生物利用度F。結(jié)果見表8。
取化合物，健康小鼠單次靜脈注射給藥，劑量為5 mg/kg，取小鼠血清，測定相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并與Tofacitinib比較，計(jì)算相對生物利用度F。結(jié)果見表9。
在實(shí)施例48中試驗(yàn)結(jié)束日最后一次給藥后1小時(shí)取小鼠血清，測定相關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并與Tofacitinib比較，計(jì)算相對生物利用度F。結(jié)果見表10。
表8 健康小鼠單次口服灌胃給藥相對生物利用度測定結(jié)果
注：1.（A）與Tofacitinib比較相對生物利用度為90%～100%；
2.（B）與Tofacitinib比較相對生物利用度為100%～120%。
表9 健康小鼠單次靜脈注射給藥相對生物利用度測定結(jié)果
注：1.（A）與Tofacitinib比較相對生物利用度為90%～100%；
2.（B）與Tofacitinib比較相對生物利用度為100%～120%。
表10 膠原蛋白誘發(fā)的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠相對生物利用度測定結(jié)果
注：1.（A）與Tofacitinib比較相對生物利用度為90%～100%；
2.（B）與Tofacitinib比較相對生物利用度為100%～120%。
實(shí)施例51 ：細(xì)胞毒性試驗(yàn)
實(shí)驗(yàn)原理：CCK8中的wst-8在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色的深淺與細(xì)胞的增殖成正比，與細(xì)胞毒性成反比。使用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定OD值，間接反映活細(xì)胞的數(shù)量，用于測定化合物的細(xì)胞毒性。
實(shí)驗(yàn)方法：根據(jù)實(shí)驗(yàn)過程中流式細(xì)胞儀及顯微鏡的形態(tài)觀察，各化合物毒性非常小。為了進(jìn)一步定量確認(rèn)化合物毒性，用CCK-8的方法檢測了HELA細(xì)胞的增殖，詳細(xì)方法如下：將化合物按照10個(gè)不同濃度用DMSO稀釋，取100ml稀釋后的化合物加入96孔板；將HELA細(xì)胞調(diào)整到2×105/ml，取100ml細(xì)胞加入到上述已經(jīng)加入化合物的96孔板中，混勻后，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育24小時(shí)；向每孔加入20μl CCK溶液；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4小時(shí)；用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：各化合物均沒有濃度依賴性地改變細(xì)胞數(shù)量，表明這些化合物對HELA細(xì)胞無毒性。結(jié)果見表11。
表11 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
實(shí)施例52：大鼠急性毒性試驗(yàn)
取化合物，觀察大鼠單次口服灌胃給藥急性毒性，計(jì)算LD50。結(jié)果見表12。
表12 大鼠單次口服灌胃給藥急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
注：1.（A）LD50＜10mg/kg；
2.（B）10mg/kg＜LD50＜50mg/kg；
3.（C）50mg/kg＜LD50＜100mg/kg；
4.（D）100mg/kg＜LD50＜500mg/kg；
5.（E）500mg/kg＜LD50＜1000mg/kg；
6.（F）LD50＞1000mg/kg。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。