本發(fā)明涉及從單克隆抗體中分離制備N-連接糖肽組分的提取分離制備，具體的說是從單克隆抗體中酶解分離制備得到有9個(gè)氨基酸肽段的N-連接糖肽組分，該組分中的聚糖為5－15個(gè)甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、巖藻糖或唾液酸組成，分子量在2000－4000。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)糖基化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，在真核生物，尤其是哺乳動(dòng)物中約有一半以上的蛋白質(zhì)是被糖基化的，膜蛋白則幾乎100％是以糖基化的形式而存在(Apweiler R,Hermjakob H,Sharon N,On the frequency of protein glycosylation,as deduced from analysis of the SWISS-PROT database.Biochim Biophys Acta-Gen Subj,1999,1473,4-8)。糖基化對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能有著重要影響，如蛋白質(zhì)的折疊、運(yùn)輸以及定位等。糖蛋白的糖鏈在細(xì)胞間的識別、黏附、通信聯(lián)絡(luò)以及免疫應(yīng)答等方面均起著重要作用，除此之外，蛋白質(zhì)糖基化的異常與腫瘤、發(fā)育、免疫異常以及感染等疾病的發(fā)生發(fā)展和診斷治療也有密切關(guān)系。目前，已知腫瘤、類風(fēng)濕等疾病會(huì)引起糖鏈結(jié)構(gòu)的異常改變，因此，糖鏈被認(rèn)為是一種潛在的疾病標(biāo)志物和新疫苗的靶點(diǎn)(Ohtsubo K,Marth JD,Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease.Cell 2006,126,855-867；Kim EH,Misek DE,Glycoproteomics based identification of cancer biomarkers.International journal of Proteomics,2011,2011,1-10)。由于糖肽僅占所有酶解后肽段的小部分(2-5％)，其質(zhì)譜響應(yīng)很容易被高豐度非糖肽抑制。同時(shí)，由于糖鏈的微觀不均一性，一個(gè)糖基化位點(diǎn)上的糖鏈類型可能多達(dá)幾十種，進(jìn)一步降低了糖鏈的相對量而使得它們很難被檢測到，這些使得糖蛋白糖肽的分離制備變得異常艱難。盡管糖鏈不容易得到，但是去除了蛋白質(zhì)中非糖肽、磷酸化肽及其它肽段的影響，在高純度糖肽基礎(chǔ)上，研究糖鏈的結(jié)構(gòu)信息，發(fā)現(xiàn)一些潛在的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)將會(huì)變得更加簡便、直接，更容易獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，因此對于糖肽的分離制備，迫切需求一種高效、高通量的分離制備方法。為了得到結(jié)構(gòu)單一的糖肽標(biāo)準(zhǔn)品，將糖肽混合物從酶解液中富集分離出來是首要步驟。

二維液相色譜技術(shù)是一門新興技術(shù)，是用兩根性質(zhì)相同或不同的色譜柱對復(fù)雜樣品進(jìn)行分離。作為一種分析復(fù)雜樣品的理想工具，它已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品科學(xué)、環(huán)境和農(nóng)業(yè)科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。 近年來，隨著二維液相色譜理論及應(yīng)用的發(fā)展，二維制備液相色譜也逐漸發(fā)展起來。與單維制備液相色譜相比，二維制備液相色譜不但具有更高的峰容量，而且兩維具有不同的選擇性。

酶法釋放糖蛋白糖鏈因方法簡單、條件溫和、能夠提供有關(guān)糖鏈殘基組成、排列順序和糖苷鍵的構(gòu)型等信息，目前應(yīng)用較廣，其中胰蛋白酶(Trypsin)應(yīng)用更為廣泛。到目前為止，雖然對血清中免疫球蛋白、單克隆抗體的Trypsin酶解糖鏈釋放、結(jié)構(gòu)表征的研究很多，但大多數(shù)研究仍集中在用質(zhì)譜方法檢測酶解液中的糖肽。同時(shí)，隨著對糖肽結(jié)構(gòu)的不斷認(rèn)識，對其功能的研究越來越引起人們的興趣，這使得對于糖肽樣品的獲取迫在眉睫。然而，到目前為止，從單克隆抗體酶解液中將糖肽富集分離出來，并通過二維液相色譜分離制備得到純度較高的糖肽組分，還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了深入研究糖蛋白、糖肽的結(jié)構(gòu)及功能，糖肽樣品的獲取是最基礎(chǔ)也是最重要的。但是，從蛋白質(zhì)中去除占有量為95％－98％的非糖肽，從而獲得糖肽樣品是非常困難的。到目前為止，未見采用色譜方法從單克隆抗體酶解液中將糖肽富集分離出來的報(bào)導(dǎo)。本發(fā)明提供了一種利用二維色譜分離技術(shù)，從單克隆抗體中制備N-連接糖肽組分的高效分離制備方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

1)蛋白變性：單克隆抗體樣品中加入尿素的緩沖溶液進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物中加入二硫蘇糖醇進(jìn)行反應(yīng)，產(chǎn)物中加入碘代乙酸，避光反應(yīng)得到變性蛋白溶液；

2)酶解：向步驟(1)得到的變性蛋白溶液中加入酶，進(jìn)行酶解反應(yīng)得到酶解反應(yīng)產(chǎn)物；

3)對步驟(2)得到的酶解反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行二維液相色譜分離制備，收集的組分干燥后即為N-連接糖肽組分。

步驟(1)中單克隆抗體樣品在尿素的緩沖溶液中進(jìn)行反應(yīng)的條件為20－30℃溫育，緩沖溶液pH值為7－9，反應(yīng)時(shí)間為1－5小時(shí)；加入二硫蘇糖醇后反應(yīng)條件為35－40℃溫育，反應(yīng)時(shí)間為1－5小時(shí)；加入碘代乙酸后的反應(yīng)條件為避光20－30℃溫育，反應(yīng)時(shí)間為10－60分鐘。

步驟(1)緩沖溶液中尿素的濃度為4－10M；所使用的緩沖溶液為碳酸氫銨緩沖溶液，濃度為30－80mM；緩沖溶液中加入的單克隆抗體與尿素的質(zhì)量比為1:1－1:40。

所述二硫蘇糖醇，加入后其在體系中的終濃度為30－100mM，初始單克隆抗體質(zhì)量與二硫蘇糖醇的質(zhì)量比為14:1－140:1；

所述碘代乙酸，加入后其在體系中的終濃度為30－100mM，初 始單克隆抗體質(zhì)量與碘代乙酸的質(zhì)量比為18:1－180:1。

步驟(2)酶解反應(yīng)之前，變性蛋白溶液用碳酸氫銨緩沖溶液稀釋5－10倍后再加入酶，上述碳酸氫銨緩沖溶液，濃度為30－80mM；酶解反應(yīng)pH值為7－9，溫度為35－40℃，反應(yīng)時(shí)間為10－24小時(shí)；酶解后得到的酶解液在沸水中煮5－10分鐘使酶失活得到酶解反應(yīng)產(chǎn)物。

在步驟(2)中所述酶是胰蛋白酶；酶和初始單克隆抗體的質(zhì)量比為1:10－1:50。

步驟(3)以硅膠為基質(zhì)的鍵合材料為色譜柱填料，Unitary C18或XAqua(華譜新創(chuàng)有限公司)為一維反相填料，XAmide或XIon(華譜新創(chuàng)有限公司)為二維親水填料。

步驟(3)所述的二維液相色譜分離制備中一維制備采用的硅膠基質(zhì)鍵合材料的粒度為2－20微米，一維液相色譜制備采用的流動(dòng)相為甲醇或乙腈中的一種或二種與水混合，其中甲醇或乙腈為有機(jī)相，不含或含有0.1v％甲酸，水相中不含或含有0.1v％甲酸；洗脫條件按照有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)5－30％等度或5－50分鐘有機(jī)相體積分?jǐn)?shù)由5％提高到40％梯度進(jìn)行；柱溫為25－40℃，洗脫液總流速為0.2－1.0mL/min，收集保留時(shí)間為10－30min的組分；二維制備采用的硅膠基質(zhì)鍵合材料的粒度為2－20微米，采用的流動(dòng)相為乙腈作為有機(jī)相與水作為水相混合，洗脫條件按水相體積分?jǐn)?shù)10－50％等度或經(jīng)5－30分鐘水相體積分?jǐn)?shù)由10－15％提高到30－60％梯度進(jìn)行，柱溫為25－40℃，洗脫液總流速為0.2－1.0mL/min，收集保留時(shí)間為10－30的組分。

所述一維制備，最佳流動(dòng)相為含有或不含有0.1v％甲酸的乙腈與含有或不含有0.1v％甲酸的水混合，采用等度方式，乙腈體積比例為8％－15％；二維制備最佳流動(dòng)相為含有或不含有0.1v％甲酸的乙腈與含有或不含有0.1v％甲酸的水混合，采用梯度條件，含有或不含有0.1v％甲酸的水體積濃度為15％，保持5分鐘，再經(jīng)15－20分鐘增加到35％－45％。

按照上述方法制備的N-連接糖肽其主要成分是9個(gè)氨基酸肽段的N-連接糖肽組分，其肽段序列為EEQYNSTYRN，N-連接聚糖是以兩個(gè)N-乙酰葡萄糖胺和3個(gè)甘露糖組成的五糖核心基礎(chǔ)上，再連接總數(shù)為0－10個(gè)的甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡萄糖胺、巖藻糖或唾液酸中的一種或二種以上，N-連接糖肽分子量為2000－4000。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)

1.采用二維液相色譜分離技術(shù)，通過選用合適的色譜柱和色譜分離制備條件，去除了雜質(zhì)蛋白、多肽、非糖肽，從單克隆抗體中得到了N-連接糖肽組分。

2.得到的N-連接糖肽組分純度高，可以達(dá)到80％以上。

3.本發(fā)明所涉及的從單克隆抗體中制備高純度N-連接糖肽的方法，儀器自動(dòng)化程度高，操作方便、簡單，常溫常壓下就可進(jìn)行，適合大規(guī)模制備的需要。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)例，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)例僅限于說明本發(fā)明，而非對本發(fā)明的限定。

實(shí)施例1：

稱取單克隆抗體蛋白(Sigma-Aldrich,貨號527858)1mg，加入167μL的4M尿素的30mM碳酸氫銨緩沖溶液中，20℃溫育1小時(shí)，緩沖溶液的pH為7。變性后的單克隆抗體蛋白加入15μL的30mM二硫蘇糖醇水溶液，35℃溫育1小時(shí)，還原變性后單克隆抗體蛋白的二硫鍵，然后加入10μL的30mM的碘代乙酸水溶液，避光條件下30℃溫育10分鐘，將還原后的二硫鍵進(jìn)行烷基化。

將變性后的單克隆抗體蛋白加入960μL濃度為0.1M的碳酸氫銨緩沖溶液；加入0.1mg的Trypsin，酶解緩沖溶液的pH值為7，酶解反應(yīng)溫度為35℃，酶解時(shí)間為10小時(shí)，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮3倍(程序溫度15℃)，得到酶解濃縮液。用粒徑2微米的Unitary(華譜新創(chuàng)有限公司)填料裝柱，柱徑3mm，柱長250mm，流動(dòng)相選擇乙腈為有機(jī)相，水為水相，采用5％有機(jī)相等度洗脫，柱溫25℃，流動(dòng)相流速為0.2mL/min，280nm紫外檢測，收集20－30分鐘的洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍，得到一維組分。用粒徑2微米的XAmide(華譜新創(chuàng)有限公司)填料裝柱，柱徑3mm，柱長150mm作為二維分離色譜柱，流動(dòng)相采用乙腈(含0.1v％甲酸)為有機(jī)相，水(含0.1％v甲酸)為水相，采用10％水相等度洗脫，柱溫35℃，流動(dòng)相流速為0.2mL/min，280nm紫外檢測，收集20－30分鐘洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮至干，即為含9個(gè)氨基酸的N-連接糖肽組分，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定，糖肽個(gè)數(shù)為6條，純度85％。實(shí)施例2：

稱取單克隆抗體(Sigma-Aldrich,貨號527858)10mg，加入100μL的8M尿素的50mM碳酸氫銨緩沖溶液中，30℃溫育5小時(shí)，緩沖溶液的pH為9。變性后的單克隆抗體加入15μL的30mM二硫蘇糖醇水溶液，40℃溫育5小時(shí)，還原變性后單克隆抗體的二硫鍵，然后加入6μL的50mM的碘代乙酸水溶液，避光條件下20℃溫育60分鐘，將還原后的二硫鍵進(jìn)行烷基化。

將變性后的單克隆抗體加入1210μL的碳酸氫銨緩沖溶液，濃度為0.5M，加入0.2mg的Trypsin，酶解緩沖溶液的pH值為9，酶解 反應(yīng)溫度為40℃，酶解時(shí)間為24小時(shí)，酶解之后，酶解液在沸水中煮10分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮5倍(程序溫度15℃)，得到酶解濃縮液。

用粒徑20微米的XAqua(華譜新創(chuàng)有限公司)填料裝柱，柱徑4.6mm，柱長150mm，流動(dòng)相選擇甲醇(含0.1％v甲酸)為有機(jī)相，水(含0.1％v甲酸)為水相，采用梯度洗脫方式：有機(jī)相體積濃度由5％經(jīng)50分鐘提高到40％，柱溫40℃，流動(dòng)相流速為1.0mL/min，280nm紫外檢測，收集15-20分鐘的洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍，得到一維組分。用粒徑20微米的XAmide(華譜新創(chuàng)有限公司)填料裝柱，柱徑4.6mm，柱長150mm作為二維分離色譜柱，流動(dòng)相選擇乙腈(含0.1％v甲酸)為有機(jī)相，水(含0.1％v甲酸)為水相，采用50％有機(jī)相等度洗脫，柱溫40℃，流動(dòng)相流速為0.7mL/min，280nm紫外檢測，收集10-15分鐘洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮至干，即為含9個(gè)氨基酸的N-連接糖肽組分，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定，糖肽個(gè)數(shù)為6條，純度70％。

實(shí)施例3：

稱取單克隆抗體(Sigma-Aldrich,貨號527858)30mg，加入100μL的10M尿素的50mM碳酸氫銨緩沖溶液中，25℃溫育2小時(shí)，緩沖溶液的pH為7。變性后的單克隆抗體加入10μL的100mM二硫蘇糖醇水溶液，37℃溫育5小時(shí)，還原變性后單克隆抗體的二硫鍵，然后加入25μL的100mM的碘代乙酸水溶液，避光條件下30℃溫育20分鐘，將還原后的二硫鍵進(jìn)行烷基化。

將變性后的單克隆抗體加入1500μL的碳酸氫銨緩沖溶液，濃度為5M，加入1mg的Trypsin，酶解緩沖溶液的pH值為8，酶解反應(yīng)溫度為37℃，酶解時(shí)間為24小時(shí)，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮7倍(程序溫度15℃)，得到酶解濃縮液。

用粒徑5微米的XAqua(華譜新創(chuàng)有限公司)填料裝柱，柱徑4.6mm，柱長250mm，流動(dòng)相選擇乙腈為有機(jī)相，水為水相，采用30％有機(jī)相等度洗脫，柱溫25℃，流動(dòng)相流速為0.8mL/min，280nm紫外檢測，收集10-15分鐘的洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍，得到一維組分。用粒徑5微米的XIon(華譜新創(chuàng)有限公司)填料裝柱，柱徑4.6mm，柱長250mm作為二維分離色譜柱，流動(dòng)相選擇乙腈為有機(jī)相，水為水相，采用梯度洗脫方式：水相濃度由10％經(jīng)30分鐘提高到60％，柱溫30℃，流動(dòng)相流速為1.0mL/min，280nm紫外檢測，收集15-20分鐘洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮至干，即含9個(gè)氨基酸的N-連接糖肽組分，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定，糖肽個(gè)數(shù)為10條，純度90％。

實(shí)施例4：

稱取單克隆抗體(Sigma-Aldrich,貨號527858)10mg，加入200μL的8M尿素的50mM碳酸氫銨緩沖溶液中，25℃溫育2小時(shí)，緩沖溶液的pH為8。變性后的單克隆抗體加入40μL的400mM二硫蘇糖醇50mM碳酸氫銨緩沖溶液，35℃溫育1小時(shí)，還原變性后單克隆抗體的二硫鍵，然后加入10μL的100mM的碘代乙酸50mM碳酸氫銨緩沖溶液，避光條件下25℃溫浴10分鐘，將還原后的二硫鍵進(jìn)行烷基化。

將變性后的單克隆抗體加入9000μL的碳酸氫銨緩沖溶液，濃度為0.05M，加入0.25mg的Trypsin，酶解緩沖溶液的pH值為8，酶解反應(yīng)溫度為37℃，酶解時(shí)間為20小時(shí)，酶解之后，酶解液在沸水中煮5分鐘使酶失活。LabConco離心濃縮儀上將酶解液離心濃縮10倍(程序溫度15℃)，得到酶解濃縮液。

用粒徑5微米的Unitary(華譜新創(chuàng)有限公司)填料裝柱，柱徑3.0mm，柱長150mm，流動(dòng)相選擇乙腈(含0.1％v甲酸)為有機(jī)相，水(含0.1％v甲酸)為水相，采用10％有機(jī)相等度洗脫，柱溫30℃，流動(dòng)相流速為0.4mL/min，280nm紫外檢測，收集12-15分鐘的洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮5倍，得到一維組分。用粒徑3微米的Xion(華譜新創(chuàng)有限公司)填料裝柱，柱徑2.1mm，柱長150mm作為二維分離色譜柱，流動(dòng)相選擇乙腈(含0.1％v甲酸)為有機(jī)相，水(含0.1％v甲酸)為水相，采用梯度洗脫方式：水相濃度由15％經(jīng)30分鐘提高到40％，柱溫30℃，流動(dòng)相流速為0.2mL/min，280nm紫外檢測，收集17-24分鐘洗脫組分，按上述離心濃縮條件離心濃縮至干，即含9個(gè)氨基酸的N-連接糖肽組分，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定，糖肽個(gè)數(shù)為8條，純度95％。