本發(fā)明屬于親和高分子微球制備領(lǐng)域，具體涉及一種PS/cPGMA核殼型納米粒及其制備方法。

背景技術(shù)：

膠乳增強(qiáng)免疫比濁法(LETIA)，通過采用物理吸附或共價(jià)鍵合的方式將抗體(或抗原)偶聯(lián)到納米顆粒的表面，形成納米粒-抗體(抗原)復(fù)合物，此復(fù)合物與樣品中的抗原(或抗體)，通過抗體抗原反應(yīng)，形成納米粒-抗體-抗原聚集顆粒，隨著免疫反應(yīng)的不斷發(fā)生，聚集的顆粒不斷增大，從而導(dǎo)致溶液在一定波長(如600nm)的吸光值發(fā)生顯著的變化，通過測定免疫反應(yīng)前后吸光度值的變化可以計(jì)算出樣品中抗原(抗體)的濃度，從而達(dá)到檢測的目的。同其它免疫分析方法(如：放射免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法等)相比，LETIA由于具有檢測方法簡單方便、無放射性污染、可準(zhǔn)確定量、穩(wěn)定性好、同時(shí)可在全自動(dòng)生化儀上實(shí)現(xiàn)高通量樣品檢測等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)越來越多的被應(yīng)用于臨床檢測。迄今，LETIA在臨床中已經(jīng)應(yīng)用于檢測β2-微球蛋白、胱抑素C、D-二聚體、脂蛋白a、抗鏈球菌溶血素“O”、類風(fēng)濕因子、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、高敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)、α1-微球蛋白、肌鈣蛋白、肌紅蛋白、肌酸激酶同工酶、甲胎蛋白、胃蛋白酶原I、前列腺特異性抗原、糖化血紅蛋白等多種檢測項(xiàng)目，診斷領(lǐng)域已涉及腎功能、風(fēng)濕、心肌、腫瘤、糖尿病等多個(gè)領(lǐng)域，擁有廣闊的市場前景。

LETIA中通常使用聚苯乙烯(PS)材料的納米級(jí)膠乳顆粒，抗體可以通過與PS的疏水性相互作用以物理吸附的形式固定于納米粒表面，然而這種方法制備的抗體-納米粒復(fù)合物穩(wěn)定性較差。一般通過對(duì)PS納米粒進(jìn)行表面改性或共聚等方法在納米粒表面引入活性基團(tuán)，進(jìn)而采用化學(xué)鍵和的 方法進(jìn)行抗體固定化可有效提高試劑的穩(wěn)定性。

通過與丙烯酸共聚得到的羧基化PS納米粒在LETIA中最常采用，例如Kyhse-Andersen等(J.Kyhse-Anderson,C.Schmidt.G.Nordin,B.Andersson,et.al.,Serum cystatin C,determined by a rapid,automated particle-enhanced turbidimetric method,is a better marker than serum creatinine for glomerular filtration rate.Clin.Chem.,1994,40(10),1921-1926.)采用羧基化PS納米粒制備了光抑素C抗體固定化的PS納米顆粒，并建立了血漿光抑素C的LETIA檢測方法。采用化學(xué)鍵合的方法在PS納米粒表面實(shí)現(xiàn)蛋白固定化顯著提高了試劑的穩(wěn)定性，但是由于固定化基質(zhì)材料(如羧基化PS納米粒)表面仍有苯環(huán)基團(tuán)暴漏，固定在納米粒表面的蛋白質(zhì)仍將有一部分物理吸附(而非化學(xué)鍵合)在納米粒表面。例如Santos和Forcada(R.M.Santos,J.Forcada.Acetal-functionalized polymer particles useful forimmunoassays.Ⅲ:preparation of latex-protein complexes and their applications.Journal of Materials Science:Materials in Medicine.2001,12:173-180.)報(bào)道采用表面醛基修飾的PS納米粒進(jìn)行抗體固定化，其中仍有約20％的抗體以物理吸附的形式固定化。

為了進(jìn)一步的避免蛋白質(zhì)與膠乳納米粒的物理吸附作用，使蛋白質(zhì)完全以化學(xué)鍵合的形式固定到膠乳納米粒表面，并在此基礎(chǔ)上增加蛋白質(zhì)-納米粒復(fù)合物的穩(wěn)定性，需對(duì)納米粒的表面進(jìn)行徹底的親水性改造，即納米粒表面覆蓋一層親水性涂層使納米粒對(duì)蛋白質(zhì)無非特異性吸附作用。早在1984年Litchfield(W.J.Litchfield,A.R.Craig,W.A.Frey,C.C.Leflar,C.E.Looney,M.A.Luddy.Novel shell/core particles for automated turbidimetric immunoassays.Clinical Chemistry,1984,30:1489-1493.)等便利用種子乳液聚合法，制備了外殼親水的“核殼型”納米顆粒。該方法中采用PS納米粒為種子，甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)為外殼聚合單體，制備了以PS為種子，聚GMA(PGMA)為涂層材料的PS/PGMA“核殼型”納米粒子，并將其用于制備LETIA檢測試劑。采用類似的方法，段殷等(段殷，左鋒，柴 宏森，劉建華，王冬梅，徐亮，周晶。單分散PS/PGMA核-殼型高分子微球的制備與表征。天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，18：416-418.)也制備了PS/PGMA納米粒，并系統(tǒng)的考察了種子納米粒的粒徑、GMA的加入量、乳化劑的加入量、聚合反應(yīng)時(shí)間等因素對(duì)核-殼型納米粒制備的影響。

上述方法雖然通過制備“核殼型”納米材料實(shí)現(xiàn)了納米粒表面的親水性改造，但是具有親水性的外殼聚合物材料是以物理吸附的方式吸附在PS種子納米粒表面，這易導(dǎo)致“核殼型”納米粒子的穩(wěn)定性變差。此外，外殼涂層材料PGMA親水性較強(qiáng)，在水溶液中長期貯存易溶脹，導(dǎo)致制得的核殼型納米粒的水力學(xué)粒徑變大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，為了解決現(xiàn)有技術(shù)中核殼型PS納米粒的外殼聚合物材料是以物理吸附的方式吸附在PS納米粒表面，從而存在穩(wěn)定性差；并且在水溶液中長期貯存易溶脹，導(dǎo)致納米粒水力學(xué)粒徑變大的問題，提供一種PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法，包括步驟如下：

(1)將羧基化PS納米粒表面進(jìn)行乙烯基化修飾得到乙烯基化PS納米粒；

(2)將乙烯基化PS納米粒通過種子乳液聚合法制備PS/cPGMA核殼型納米粒。

上述PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法中，所述羧基化PS納米粒的平均粒徑為60nm-500nm，羧基密度以干球計(jì)為0.065mmol/g-0.350mmol/g。

上述PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法中，所述進(jìn)行乙烯基化修飾的方法包括以下步驟：將羧基化PS納米粒分散，經(jīng)1-(3-二甲氨基丙基)-3- 乙基碳二亞胺鹽酸鹽活化后，再加入丙烯胺進(jìn)行反應(yīng)，得到乙烯基化PS納米粒。

上述PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法中，加入的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽的物質(zhì)的量為羧基化PS納米粒上羧基的物質(zhì)的量的1-5倍。

上述PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法中，將羧基化PS納米粒分散于磷酸鹽緩沖液中，得到PS納米粒的水溶液，其中羧基化PS納米粒的質(zhì)量為磷酸鹽緩沖液質(zhì)量的2-10％；所述丙烯胺以體積濃度為10％的丙烯胺磷酸鹽緩沖液的形式加入，加入量為PS納米粒水溶液體積的0.5-1.5；所述磷酸鹽緩沖液為pH7.4、25mM的磷酸鹽緩沖液；所述活化的條件為：室溫震蕩反應(yīng)15-60分鐘；加入丙烯胺后于4-37℃震蕩，反應(yīng)的時(shí)間為3-12小時(shí)。

上述PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法中，所述種子乳液聚合法制備PS/cPGMA核殼型納米粒的方法包括：

以乙烯基化PS納米粒為種子，過硫酸鉀為引發(fā)劑，GMA為單體，碳酸鹽緩沖液為分散相，十二烷基磺酸鈉為表面活性劑，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑。

上述PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法中，所述種子乳液聚合法制備PS/cPGMA核殼型納米粒的具體方法包括：

將乙烯基化PS納米粒水溶液與碳酸鹽緩沖溶液按體積比為1：1-1：3混合；然后加入過硫酸鉀、GMA、乙二醇二甲基丙烯酸酯和十二烷基磺酸鈉攪拌反應(yīng)，攪拌轉(zhuǎn)速為120轉(zhuǎn)每分鐘，反應(yīng)溫度為70-80℃，反應(yīng)時(shí)間為6-10h，制得PS/cPGMA納米粒；所述乙烯基化PS納米粒水溶液中的水溶液為pH7.4、25mM的磷酸鹽緩沖液，乙烯基化PS納米粒的質(zhì)量為磷酸鹽緩沖液質(zhì)量的2-10％。

上述PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法中，過硫酸鉀的質(zhì)量與乙烯基化PS納米粒水溶液的體積比為0.1-0.5g/100mL，GMA的質(zhì)量與乙烯基化PS納米粒水溶液的體積比為0.2-2g/100mL，十二烷基磺酸鈉的質(zhì)量與乙烯基化PS納米粒水溶液的體積比為0.01-0.05g/100mL；乙二醇二甲基丙烯酸酯的質(zhì)量為GMA質(zhì)量的1-5％。

上述PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法制備的PS/cPGMA核殼型納米粒。

上述PS/cPGMA核殼型納米粒在膠乳增強(qiáng)免疫比濁法中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

1、本發(fā)明的PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法，對(duì)羧基化PS納米粒表面進(jìn)行乙烯基團(tuán)活化，使殼層聚合物材料以化學(xué)鍵合的方式固定在羧基化PS種子納米粒表面，提高制得納米粒的穩(wěn)定性。

2、本發(fā)明的PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法，在PGMA殼層材料的制備中，加入了交聯(lián)劑EDMA，EDMA的投料量占GMA投料量的1-5％，在保證納米粒表面的親水性的同時(shí)，從而控制殼層材料PGMA在水溶液中的溶脹，進(jìn)一步提高制得納米粒的穩(wěn)定性。

3、本發(fā)明的PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法，選擇粒徑范圍在60nm-500nm的羧基化PS納米粒為原料，通過EDC活化后易與帶有氨基的丙烯胺反應(yīng)，進(jìn)而在納米粒表面引入乙烯基團(tuán)，為后續(xù)種子乳液聚合法制備PS/cPGMA核殼型納米粒制得一定粒徑的乙烯基化PS種子納米粒。

4、本發(fā)明的PS/cPGMA核殼型納米粒的制備方法制備的PS/cPGMA核殼型納米粒外殼親水且在水溶液中穩(wěn)定性好；外殼親水可確保蛋白質(zhì)以化學(xué)鍵合的方式，而非物理吸附固定到納米粒表面，與蛋白質(zhì)非特異性吸附作用較弱，可作為LETIA試劑的生產(chǎn)原料使用，與PS納米粒制備的LETIA試劑相比穩(wěn)定性顯著提高。

附圖說明

下面將通過附圖和具體實(shí)例進(jìn)一步說明本申請(qǐng)。

圖1為PS/cPGMA納米粒制備過程示意圖。

圖2為PS/cPGMA納米粒的透射電鏡照片。

圖3為光抑素C檢測試劑穩(wěn)定性測試結(jié)果對(duì)比；其中，圖(A)為PS/cPGMA納米粒制備的試劑；圖(B)為PS納米粒制備的試劑。

圖4為本發(fā)明制備的PS/cPGMA核殼型納米粒與PS/PGMA納米粒的穩(wěn)定性結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明的所有實(shí)施例中的原料、試劑如無特殊說明均為市售商品。下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施進(jìn)一步進(jìn)行說明，但是本發(fā)明的實(shí)施不僅限于此。

實(shí)施例1

根據(jù)圖1所示的制備過程示意圖，制備平均粒徑約為120nm的PS/cPGMA納米粒；

將羧基化PS納米粒(瑞安市伊普西隆生物科技有限公司)分散于PBS(25mM，pH7.4)中，制備5％(w/w)的PS納米粒水溶液100mL。羧基化PS納米粒平均粒徑為109.6nm，羧基密度為0.157mM/g(干球)，加入150.5mg EDC，室溫震蕩反應(yīng)15分鐘后，繼續(xù)加入100mL含10％(v/v)丙烯胺的PBS(25mM，pH7.4)溶液。25℃震蕩反應(yīng)8小時(shí)后，用去離子水透析除去未反應(yīng)的丙烯胺，制得乙烯基化PS納米粒。用截留分子量為300KD的超濾膜將制得的乙烯基化PS納米粒濃縮至100mL，5％(w/w)的水溶液。

將上述制備的100mL乙烯基化PS納米粒水溶液置于一圓底三口燒瓶中，分別加入200mL碳酸鹽緩沖液(pH9.0，25mM)，0.2g KPS，0.8g GMA，0.016g EDMA，0.02g SDS，在充氮?dú)獾臈l件下，置于75℃水浴中，120轉(zhuǎn) 每分鐘攪拌反應(yīng)8h，制得PS/cPGMA納米粒。將制得的納米粒用去離子水透析，并超濾濃縮至5％(w/w)的水溶液。

將制得的PS/cPGMA納米粒用透射電子顯微鏡觀測，結(jié)果參見圖2。由圖可知，制得的微球具有較好的球形度，粒度分布均勻(圖2A)，具有明顯的核殼型結(jié)構(gòu)(圖2B)。通過粒徑分析儀測定，制得的PS/cPGMA納米粒的平均粒徑為120.6nm，比種子納米粒的粒徑略有增加(種子納米粒即羧基化PS納米粒的平均粒徑為109.6nm)，粒徑增大的部分必然是由于納米粒殼層的存在而導(dǎo)致，這也與圖2顯微鏡觀測的結(jié)果一致。

實(shí)施例2

根據(jù)圖1所示的指標(biāo)過程示意圖，制備平均粒徑約為65nm的PS/cPGMA納米粒；

將羧基化PS納米粒(瑞安市伊普西隆生物科技有限公司)分散于PBS(25mM，pH7.4)中，制備10％(w/w)的PS微球水溶液100mL。羧基化PS納米粒平均粒徑為60.0nm，羧基密度為0.065mM/g(干球)，加入124.6mg EDC，室溫震蕩反應(yīng)15分鐘后，繼續(xù)加入50mL含10％(v/v)丙烯胺的PBS(25mM，pH7.4)溶液。4℃震蕩反應(yīng)12小時(shí)后，用去離子水透析除去未反應(yīng)的丙烯胺，制得乙烯基化PS納米粒。用截留分子量為300KD的超濾膜將制得的乙烯基化PS納米粒濃縮至100mL，10％(w/w)的水溶液。

將上述制備的100mL乙烯基化PS納米粒水溶液置于一圓底三口燒瓶中，分別加入300mL碳酸鹽緩沖液(pH9.0，25mM)，0.5g KPS，2g GMA，0.02g EDMA，0.05g SDS，在充氮?dú)獾臈l件下，置于70℃水浴中，120轉(zhuǎn)每分鐘攪拌反應(yīng)10h，制得PS/cPGMA納米粒。將制得的納米粒用去離子水透析，并超濾濃縮至5％(w/w)的水溶液。用粒徑分析儀測定制得的PS/cGMA納米粒的平均粒徑為65.0nm。

實(shí)施例3

根據(jù)圖1所示的指標(biāo)過程示意圖，制備平均粒徑約為520nm的PS/cPGMA納米粒；

將羧基化PS納米粒(瑞安市伊普西隆生物科技有限公司)分散于PBS(25mM，pH7.4)中，制備2％(w/w)的PS微球水溶液100mL。羧基化PS納米粒的平均粒徑為500nm，羧基密度為0.350mM/g(干球)，加入134.2mg EDC，室溫震蕩反應(yīng)15分鐘后，繼續(xù)加入150mL含10％(v/v)丙烯胺的PBS(25mM，pH7.4)溶液。37℃震蕩反應(yīng)3小時(shí)后，用去離子水透析除去未反應(yīng)的丙烯胺，制得乙烯基化PS微球。用截留分子量為300KD的超濾膜將制得的乙烯基化PS納米粒濃縮至100mL，2％(w/w)的水溶液。

將上述制備的100mL乙烯基化PS納米粒水溶液置于一圓底三口燒瓶中，分別加入100mL碳酸鹽緩沖液(pH9.0，25mM)，0.1g KPS，0.2g GMA，0.01g EDMA，0.01g SDS，在充氮?dú)獾臈l件下，置于80℃水浴中，120轉(zhuǎn)每分鐘攪拌反應(yīng)6h，制得PS/cPGMA納米粒。將制得的納米粒用去離子水透析，并超濾濃縮至5％(w/w)的水溶液。用粒徑分析儀測定制得的PS/cGMA納米粒的平均粒徑為520.1nm。

實(shí)施例4

PS/cPGMA納米粒制備的光抑素C(Cys-C)檢測試劑的穩(wěn)定性考察。

取實(shí)施例1制備的PS/cPGMA微球水溶液(5％w/w)20mL，加入20mL碳酸鹽緩沖液(pH9.0，25mM)混合后，加入1.25g甘氨酸，室溫震蕩反應(yīng)17h。而后加入1g NaBH₄終止反應(yīng)，將制得的微球用去離子水透析，并超濾濃縮至5％(w/w)的水溶液。制得羧基化PS/cPGMA微球，經(jīng)電位滴定法測定羧基密度為0.150mM/g_(干球)。

分別取上述制得的羧基化PS/cPGMA微球與粒徑及羧基密度相同的羧基化PS微球各1mL，制備Cys-C LETIA檢測試劑。R1與R2的配方及制備方法如下：

R1：60mL，其中含有50mM PBS(pH7.4)，0.5％BSA,0.05％NaN3,150mM NaCl。

R2：15mL，制備方法如下：取羧基化微球溶液或羧基化PS/cPGMA微球1mL，與1mL 50mM 2-嗎啉代乙磺酸(MES)緩沖液(pH6.0)混合后，加入EDC與N-羥基硫代琥珀酰亞胺各10mg后，室溫震蕩反應(yīng)20min。加入10mg Cys-C多克隆抗體(產(chǎn)自瑞安市伊普西隆生物科技有限公司)，37℃水浴震蕩反應(yīng)3h。隨后，加入0.5g甘氨酸終止反應(yīng)。將上述反應(yīng)液用截留分子量為500kD的膜包切向流過濾除去未偶聯(lián)的抗體，所用的洗液為50mM PBS(pH7.4)，切向流過濾后收集微球溶液15mL。最后向微球溶液中加入BSA 0.3g，制得R2。

Cys-C標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性的測定：對(duì)8mg/L，4mg/L,1mg/L標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測試，采用加速試驗(yàn)的方法進(jìn)行穩(wěn)定性測試。即：將上述制備的試劑均分為14份，完全密封后放入37℃水浴中，每天取出1份對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測試，連續(xù)測試14天。測試結(jié)果參見圖3。

由圖可知，采用PS/cPGMA納米粒制備的試劑，考察期間內(nèi)，測試結(jié)果無明顯變化趨勢(shì)，標(biāo)準(zhǔn)品的信號(hào)值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于2.3％(圖3A)；采用PS納米粒制備的試劑，考察期間內(nèi)，測試結(jié)果有顯著下降趨勢(shì)，標(biāo)準(zhǔn)品的信號(hào)值相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)顯著增大(圖3A)。這充分說明PS/cPGMA制備的LETIA檢測試劑比PS納米粒制備的檢測試劑具有更好的穩(wěn)定性。

實(shí)施例5

將實(shí)施例1制備的PS/cPGMA納米粒和PS/PGMA納米粒(根據(jù)段殷等，單分散PS/PGMA核-殼型高分子微球的制備與表征。天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，18：416-418.中的方法制備)的溶脹性進(jìn)行比較。

將兩種納米粒均用50mM PBS(pH7.4，含0.05％NaN₃)溶液配制成5％(w/w)的微球水溶液，并將其密封后放置在37℃水域中，測定21天 內(nèi)的粒徑變化情況，對(duì)比結(jié)果參見圖4。

由圖4可知，PS/PGMA納米粒粒徑顯著增大(從第一天測定的120.4nm增大到第21天的167.8nm)，而PS/cGMA納米粒的粒徑并未見明顯變化(第一天測得的粒徑為120.2nm，而到第21天的為120.0nm)。這說明本專利制備的納米粒穩(wěn)定性得到了顯著提高。