水稻黃單胞桿菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用本申請是針對申請人于2014年04月25日申請的發(fā)明名稱為“水稻黃單胞菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用”(原申請?zhí)枮椋?014101695173)的發(fā)明專利所做的分案申請。技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，提供了水稻黃單胞桿菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，特別是提供了水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌鑒定的顯性分子標(biāo)記和共顯性分子標(biāo)記，以及應(yīng)用這些分子標(biāo)記檢測兩種病原細(xì)菌的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
水稻黃單胞桿菌是一類典型的黃色的革蘭氏陰性菌，是水稻上主要的細(xì)菌性致病菌，包括水稻白葉枯病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzae(Xoo)和水稻細(xì)菌性條斑病菌Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xoc)(Zhao,Ardalesetal.2004).Xoo能夠引起水稻的維管束病害是水稻白葉枯病，而Xoc是通過組織間隙來侵染水稻從而引起水稻細(xì)菌性條斑病。由于水稻白葉枯病(BB)受到溫度以及地域的影響成為最為嚴(yán)重的水稻細(xì)菌性病害之一，受之影響嚴(yán)重的主要是亞洲和部分非洲地區(qū)。然而高產(chǎn)的水稻品種是更易受到水稻白葉枯病(BB)的侵染，因此水稻白葉枯病(BB)常導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，減產(chǎn)量達(dá)50％。相比之下，水稻細(xì)菌性條斑病菌(BLS)引起的損失相對較小，嚴(yán)重的時候減產(chǎn)量達(dá)30％。但是，隨著雜交水稻的廣泛種植，水稻細(xì)菌性病害有逐年加重的趨勢。因此，遏制水稻細(xì)菌病害的發(fā)展對于穩(wěn)定糧食生產(chǎn)和改善人們生活水平至關(guān)重要。隨著全球貿(mào)易在農(nóng)業(yè)中的蔓延，水稻種子進(jìn)出口的檢驗工作尤為重要。而在亞洲包括中國在內(nèi)，已經(jīng)把水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌定義為水稻檢疫性病害。其種子帶菌傳播嚴(yán)重，因此，快速檢測和準(zhǔn)確的識別病原物是檢疫工作的關(guān)鍵，同時能夠有效的防治病害發(fā)生和減少病害帶來的損失。盡管水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性病菌的侵染方式不同，但是由于同屬水稻黃單胞菌的白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)和條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc)親緣關(guān)系非常近，且基因組序列相似性高達(dá)90％以上，在檢疫工作中不易被鑒定區(qū)分。傳統(tǒng)的篩選分離手段對于同種不同致病變種，形態(tài)特征極為相似菌株，區(qū)分起來耗時耗力。噬菌體技術(shù)在水稻細(xì)菌病害流行中較為常用，但噬菌體?；砸自斐傻募訇幮砸约把鍖W(xué)方法中抗血清質(zhì)量問題易產(chǎn)生的假陽性，使得這種方法的普及受到限制。在當(dāng)前的檢驗檢疫工作中，采用方便、經(jīng)濟(jì)的PCR分子標(biāo)記開展相關(guān)工作已經(jīng)成為主要方法，各種以PCR為依托的檢測方法絡(luò)繹不絕，如TaqMan實時熒光PCR方法雖然準(zhǔn)確靈敏但成本昂貴，很難應(yīng)用到日常檢驗檢疫工作中。在水稻兩種細(xì)菌性病害的檢驗檢疫中，前人利用兩種病原菌中電子轉(zhuǎn)移黃蛋白α亞基的差異和跨膜蛋白基因(AY319937、AY319941)的差異設(shè)計顯性?；砸飦磉M(jìn)行鑒定區(qū)分，取得一定的效果。由于細(xì)菌間存在一定程度的遺傳物質(zhì)的交換，單一分子標(biāo)記容易造成檢測上的誤差，而且PCR實驗在實際操作中容易形成一定的污染概率，存在一定的假陽性風(fēng)險，因此開發(fā)豐富的、保守性高的分子標(biāo)記進(jìn)行多位點檢測有利于保證檢測的準(zhǔn)確性。而伴隨著生物測序技術(shù)的發(fā)展，完成了很多全基因組測序工作。到目前為止，已經(jīng)有四個黃單胞桿菌的菌株完成了測序(其中包括KACC10331,PXO99A,MAFF311018,andBLS256),以及完成了水稻白葉枯病菌株AX01947的草圖。基于已獲得的信息，可以利用生物信息學(xué)的比較算法來研究不同小種之間的差異。如何利用這些已有研究成果來區(qū)分水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性病菌成為我們的研究前沿。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的發(fā)明人正是針對現(xiàn)有技術(shù)的研究情況基于這些已經(jīng)發(fā)布的物種序列進(jìn)行全基因組序列比對，提供了水稻黃單胞桿菌的分子標(biāo)記及其應(yīng)用，特別是提供了水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌鑒定的顯性分子標(biāo)記和共顯性分子標(biāo)記，以及應(yīng)用這些分子標(biāo)記檢測兩種病原細(xì)菌的應(yīng)用。發(fā)明人首先根據(jù)已公布的3個白葉枯病菌株MAFF311018、KACC10311、PXO99A與2個條斑病菌株BLS256的基因組序列和RS105的部分基因序列，利用生物信息學(xué)的方法對Xoo菌株全基因組內(nèi)以及與Xoc全基因組間比對分析，選定白葉枯病菌MAFF311018和條斑病菌BLS256為分析對象，根據(jù)兩菌株基因組的差異序列，設(shè)計特異性引物，通過常規(guī)PCR技術(shù)，對包含水稻白葉枯病菌和條斑病菌及其它相關(guān)菌株在內(nèi)的40個候選菌株進(jìn)行檢測區(qū)分。最終確定了可以用于區(qū)分的分子標(biāo)記如下：水稻白葉枯病菌的分子標(biāo)記，其序列如SEQIDNO.1-58所示；水稻細(xì)菌性條斑病菌的分子標(biāo)記，其序列如SEQIDNO.59-104所示；水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的共顯性分子標(biāo)記，其序列如SEQIDNO.105-126所示；利用這些分子標(biāo)記不但可以特異鑒定水稻黃單胞桿菌，還可以對水稻黃單胞桿菌的兩個致病變種水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌進(jìn)行更進(jìn)一步的細(xì)致鑒定，從而解決現(xiàn)有技術(shù)中鑒定準(zhǔn)確性差的問題，鑒定技術(shù)中不可靠的問題。通過上述確定的分子標(biāo)記，結(jié)合簡單的PCR技術(shù)以及普通的DNA檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測，為簡便，快速、準(zhǔn)確地檢測兩種病原細(xì)菌開辟了有效途徑，可以對于大量的樣本采用多標(biāo)記協(xié)同檢測，有利于提高檢測可靠性，符合檢測技術(shù)發(fā)展的方向。附圖說明圖1為本發(fā)明特異性引物設(shè)計原理示意圖；圖2為水稻白葉枯病菌?；砸矧炞C結(jié)果示意圖，圖中1-10為水稻細(xì)菌性條斑病菌，分別是RH3,JSB2-24,RS85,RS105,HNB8-47,HCA1,HCA2,HCB1,HCC1,HGA1；11-35:為水稻白葉枯病菌，分別是PXO99,PXO86,PX071,PXO61,JL691-1,PXO339a,PXO339b,PXO339c,SC-yc-a,FuJian,GD414,HeN11,YN24,YN18,YN11,YN1,T3,T2,T1,JL691-2,PXO349,PXO364,PXO347,Zhe173-1,Zhe173-3；36-40:為參照菌株，分別是Aac,Xcv,Xac,Xcc,Pst；圖3為水稻細(xì)菌性條斑病菌?；砸矧炞C結(jié)果示意圖，圖中1-10為水稻細(xì)菌性條斑病菌，分別是RH3,JSB2-24,RS85,RS105,HNB8-47,HCA1,HCA2,HCB1,HCC1,HGA1；11-35:為水稻白葉枯病菌，分別是PXO99,PXO86,PX071,PXO61,JL691-1,PXO339a,PXO339b,PXO339c,SC-yc-a,FuJian,GD414,HeN11,YN24,YN18,YN11,YN1,T3,T2,T1,JL691-2,PXO349,PXO364,PXO347,Zhe173-1,Zhe173-3；36-40:為參照菌株，分別是Aac,Xcv,Xac,Xcc,Pst；圖4為水稻白葉枯病菌和細(xì)菌性條斑病菌共顯性引物驗證結(jié)果示意圖，圖中1-10:為水稻細(xì)菌性條斑病菌，分別是RH3,JSB2-24,RS85,RS105,HNB8-47,HCA1,HCA2,HCB1,HCC1,HGA1；11-35:為水稻白葉枯病菌，分別是PXO99,PXO86,PX071,PXO61,JL691-1,PXO339a,PXO339b,PXO339c,SC-yc-a,FuJian,GD414,HeN11,YN24,YN18,YN11,YN1,T3,T2,T1,JL691-2,PXO349,PXO364,PXO347,Zhe173-1,Zhe173-3；36-40:為參照菌株，分別是Aac,Xcv,Xac,Xcc,Pst。具體實施方式以下實施例中進(jìn)一步定義本發(fā)明，根據(jù)以上的描述和這些實施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊注明外，本發(fā)明所采用的均為本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)；實施例一設(shè)計可以區(qū)分鑒定水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的分子標(biāo)記水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)的三個小種KACC10331、PXO99A、MAFF311018和水稻細(xì)菌性條斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola)的兩個小種BLS256、RS105，五個病菌的基因組序列和相關(guān)信息從NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載獲得。(表1)表1五種細(xì)菌基因組信息的數(shù)據(jù)統(tǒng)計發(fā)明人對Xoo(MAFF311018，KACC10311，PXO99A)3個小種的全基因組進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)序列相似程度較高，選取MAFF311018作為水稻白葉枯菌的模式小種。用RS105和BLS256比對，發(fā)現(xiàn)BLS256包含了RS105的全部信息，相似程度很高，因此用BLS256作為水稻細(xì)條病菌的模式小種。用BLAST對兩模式小種MAFF311018與BLS256進(jìn)行全基因組序列比對，用perl程序把結(jié)果中的match信息和mismatch(含gap)信息分開，利用非匹配信息設(shè)計特異性標(biāo)記。(表2)表2模式菌株MAFF311018和BLS256的比對結(jié)果利用MAFF3011018基因組中與BLS256不匹配的信息，截取片段長度大于200bp的片段并用eprimer3設(shè)計引物。先用ePCR在五種菌中分別檢測所設(shè)計的引物，再用Perl篩選MAFF3011018的顯性分子標(biāo)記。同理，開發(fā)出BLS256的顯性分子標(biāo)記(圖1中I)。利用Perl程序，在兩菌種不匹配區(qū)段的兩側(cè)各截取60bp的相似片段，分別設(shè)計上游和下游引物，這樣獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物包括三部分，一個完整的非匹配區(qū)段，兩部分匹配區(qū)段。進(jìn)而用ePCR篩選在兩菌種中其擴(kuò)增長度不一致的引物，即為可以在兩種菌中有多態(tài)性的共顯性分子標(biāo)記(圖1中II)。其中設(shè)計的相關(guān)引物的信息如表3所示。表3設(shè)計的引物相關(guān)信息本發(fā)明所檢測的菌株供40株，具體信息如表4所示表4實驗所用的水稻白葉枯病菌、水稻細(xì)菌性條斑病菌以及其他相關(guān)菌株實施例二對水稻白葉枯病菌?；娘@性分子標(biāo)記篩選及驗證我們根據(jù)所設(shè)計的對水稻白葉枯病菌?；奶禺愋砸锏膃PCR篩選結(jié)果，選取了40對引物對25株水稻白葉枯病菌和10株水稻細(xì)菌性條斑病菌及其它相關(guān)菌株進(jìn)行驗證。將供試菌株劃線于TSA固體培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)2d后，挑取單菌落，置于TSA液體培養(yǎng)基，在180r·min-1，28℃搖床培養(yǎng)兩天。吸取菌液3mL，用試劑盒提取菌株的基因組DNA。并以此為PCR反應(yīng)的模板。優(yōu)化的反應(yīng)體系為：Taq酶0.2μL(5u·μL-1)，10×PCRBuffer(Mg2+Free)2μL，25mMMgCl21.2μL，2.5mMdNTPMixture1.5μL，取菌液為模板1μL，引物F(10μM)0.6μL，引物R(10μM)0.6μL，用滅菌雙蒸水補充至20μL體系。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min；94℃變性15s,58℃退火15s，72℃延伸30s，30個反應(yīng)循環(huán)；最后72℃延伸7min。用2％的TBE瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。經(jīng)檢測，我們獲得了29對特異性引物可以將25株水稻白葉枯病菌在所有供試菌株中準(zhǔn)確的鑒定出來，所擴(kuò)增的DNA片段均與預(yù)期目的片段大小相近(片段大小見表5)。此類特異性分子標(biāo)記均不能在水稻細(xì)菌性條斑病菌以及其他參照菌株中擴(kuò)增出條帶(如圖2所示)。表5此類分子標(biāo)記在序列表中的序列號、所對應(yīng)的分子標(biāo)記的名稱及所擴(kuò)增DNA片段的大小實施例三對水稻細(xì)菌性條斑病菌?；娘@性分子標(biāo)記篩選及驗證根據(jù)對水稻細(xì)菌性條斑病菌?；奶禺愋砸锏膃PCR篩選結(jié)果，采用已獲得的供試菌株的基因組DNA，利用與實施例2完全相同的優(yōu)化的PCR反應(yīng)體系以及2％的TBE瓊脂糖凝膠電泳檢測方法，選取了40對引物對供試菌株進(jìn)行驗證。經(jīng)過檢測，我們獲得了23對特異性引物可以將10株水稻細(xì)菌性條斑病菌在所有供試菌株中準(zhǔn)確的擴(kuò)增到與目標(biāo)大小相符合的DNA片段(片段大小見表6)。該類特異性引物均不能在水稻白葉枯病菌以及其他參照菌株中擴(kuò)增出條帶(如圖3所示)。表6此類分子標(biāo)記在序列表中的序列號及所對應(yīng)的分子標(biāo)記的名稱實施例四對水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的共顯性分子標(biāo)記進(jìn)行PCR試驗證明我們根據(jù)水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌的共顯性分子標(biāo)記引物的ePCR篩選結(jié)果，同樣，結(jié)合實施例2和3已經(jīng)建立起來的PCR檢測體系和2％的TBE瓊脂糖凝膠電泳方法，選取了40對引物對供試菌株進(jìn)行驗證。通過檢測，獲得了11對特異性引物可以準(zhǔn)確地將10株水稻細(xì)菌性條斑病菌和25株水稻白葉枯病菌區(qū)分并且擴(kuò)增到與目標(biāo)大小相符合的DNA片段(片段大小見表7)。該類特異性分子標(biāo)記在水稻白葉枯病菌和水稻細(xì)菌性條斑病菌中可以擴(kuò)增出的DNA片段有顯著差異，并且僅通過一次PCR和簡單的凝膠檢測就可以快速準(zhǔn)確的區(qū)分鑒定(如圖4所示)。表7此類分子標(biāo)記在序列表中的序列號及所對應(yīng)的分子標(biāo)記的名稱