本發(fā)明涉及一種利用固定化氫過氧化物裂解酶將不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為天然香料的方法，屬于生物香料制備技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

本發(fā)明涉及制備多元不飽和脂肪酸降解產(chǎn)物的過程。這些降解產(chǎn)物是揮發(fā)性的天然風(fēng)味物質(zhì)，這些物質(zhì)主要包括反式-2-己烯醛、順-3-己烯醛、己醛等，是新鮮果蔬獨特綠色清新氣味的重要貢獻(xiàn)者，因此又被稱為“綠色信號”。目前為止，C6醛已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于日化工業(yè)、食品行業(yè)以及香水制品等產(chǎn)業(yè)中。

巨大的市場需求促使研究人員展開了大量針對C6醛生產(chǎn)的研究。一般而言，通過化學(xué)合成的手段獲得大量穩(wěn)定的C6醛是最簡單也是最為直接的方法。然而在食品領(lǐng)域，天然手段得到的添加劑或香精香料產(chǎn)品更容易受到消費者的青睞。就同一種產(chǎn)品而言，天然產(chǎn)品的市場銷售價格遠(yuǎn)高于化學(xué)合成品。

天然清香型香精香料的傳統(tǒng)制備方法是直接從植物原料中提取獲得，例如薄荷精油的蒸餾。但是這一方法目前也面臨著諸多問題而難以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需求，從而使得模擬植物體內(nèi)的代謝途徑，酶法催化游離不飽和脂肪酸的氧化反應(yīng)及其隨后的降解反應(yīng)以制備己醛、己烯醛等C6醛類的方法具有很強的吸引力。

近年來，人們開始嘗試通過酶法來合成醛類物質(zhì)，如中國專利AN1563310A公開了一種酶催化生產(chǎn)烯醛類香料的方法，該法以C18-C20多遠(yuǎn)不飽和脂肪酸為原料，以從天然植物組織中提取的脂肪氧合酶與氫過氧化物裂解酶組成的酶系為催化劑，在室溫15-25℃條件下，使多元不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)移地酶催化裂解成烯醛類香料。中國專利CN101225406A涉及一種利用番石榴組織中存在的酶合成天然香料的方法，該方法提供一種以亞油酸、亞麻酸和花生四烯酸等具有順順-1，4-戊二烯結(jié)構(gòu)的多元不飽和脂肪酸為底物，利用番石榴組織中存在的脂肪氧合酶和氫過氧化物裂解酶降解底物，合成具有天然風(fēng)味香料的方法。目前為止，氫過氧化物裂解酶的不穩(wěn)定性及其反應(yīng)的復(fù)雜性一直是導(dǎo)致產(chǎn)物產(chǎn)量過低(<20mg/L)并制約此生物合成途徑實現(xiàn)工業(yè)化的關(guān)鍵因素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的之一是提供一種連續(xù)化制備亞油酸脂質(zhì)代謝產(chǎn)物的方法，尤其是通過固定化氫過氧化物裂解酶的催化作用將亞油酸氫過氧化物降解產(chǎn)生天然香料物質(zhì)。

發(fā)明包括以下幾個步驟：

1、脂肪酸氫過氧化物的制備：通過LOX反應(yīng)制備脂肪酸氫過氧化物(HPOs)。0.1M游離亞油酸分散于pH 9.0的硼酸鹽緩沖液中(0.2M)，于發(fā)酵罐中4℃下攪拌均勻后加入LOX、通氧并加壓至0.3MPa進(jìn)行反應(yīng)。1.5h之后結(jié)束反應(yīng)并取一定量產(chǎn)物經(jīng)乙醇稀釋后在234nm測定其紫外吸光度，然后根據(jù)摩爾吸光系數(shù)計算反應(yīng)液中HPOs的濃度(ε＝25000cm^-1M^-1)。最后將反應(yīng)產(chǎn)物溶液置于4℃條件下冷藏待用。

2、莧菜氫過氧化物裂解酶的提?。喝サ舾颓o之后，將新鮮莧菜葉切碎并與pH 8.5的Tris-HCl緩沖液(0.1M并含有0.5％(m/v)PVP K-30)按照1:3的比例混合，均漿1min(10s×6)。四層紗布過濾之后所得濾液在4℃下18000×g離心30min。離心沉淀加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.02M，pH 6.8)，PBS中含10mM DTT以及0.5％(v/v)Triton X-100。4℃下攪拌1h之后于同樣溫度下18000×g離心30min，所得上清液經(jīng)30％硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述含有DTT以及Triton X-100的PBS中，即得游離HPL粗酶液。

3、殼聚糖復(fù)合水凝膠的制備方法如下：

a.將殼聚糖和γ-卡拉膠加入到的乙酸溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液。

b.使用注射器將步驟a所得混合溶液逐滴滴入NaOH溶液中并攪拌形成直徑為1–2mm的水凝膠微球。

c.在步驟b所得水凝膠微球中加入過量戊二醛，得到醛基活化水凝膠微球。

d.在步驟c所得醛基活化水凝膠微球中加入1，6-己二胺。

e.過濾得到表面連接著1，6-己二胺的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球。

步驟a所述混合溶液中含有殼聚糖2.5wt％～7.5wt％；γ-卡拉膠2.5wt％～7.5wt％；乙酸溶液5％～25％v/v。

步驟b所述NaOH溶液的濃度為0.5M～2.5M，混合溶液與NaOH溶液的體積比1:5～10；所述攪拌過程：攪拌轉(zhuǎn)速為10～50rpm，攪拌時間為1～5天。

步驟d所述1，6-己二胺的添加量為1，6-己二胺：殼聚糖中-NH₂摩爾比＝0.5～1.0:1。

4、殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶：

(一)將殼聚糖復(fù)合水凝膠微球浸入EDC水溶液中，然后加入含有HPL的PBS溶液，之后于4～10℃下震蕩10～30min，過濾，得到殼聚糖復(fù)合水 凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶。

(二)用PBS及去離子水清洗殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶。清洗的目的是將其他的雜質(zhì)洗去，因此清洗次數(shù)可以根據(jù)需要調(diào)整，通常清洗兩次即可。

(三)清洗過后的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。

步驟(1)所述復(fù)合液中殼聚糖復(fù)合水凝膠微球與EDC的摩爾比為1:1～10；HPL與殼聚糖復(fù)合水凝膠微球的摩爾比為1:1。

5、己醛的連續(xù)化制備：用于己醛連續(xù)化制備的填充床柱式反應(yīng)器如圖1所示。4～20U的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶被填充于長200～500mm，直徑10.5～20mm的玻璃柱中。反應(yīng)器的溫度通過外部的循環(huán)水浴夾套控制為30～40℃。將濃度為10～50mM的13-HPOD溶液(0.02～0.2M PBS，pH 4.0～6.5含有1～3mM DTT)通過蠕動泵連續(xù)地加入到反應(yīng)柱中。當(dāng)體系達(dá)到穩(wěn)定的時候開始收集流出液并測定其中C6醛的產(chǎn)量。

產(chǎn)物定量分析：使用頂空氣相色譜法(HS-GC)測定生成的醛類物質(zhì)。具體的檢測步驟如下：與分光光度檢測法相同的反應(yīng)溶液經(jīng)2min的保溫之后迅速將酶滅活。反應(yīng)產(chǎn)物使用氣相色譜儀進(jìn)行測定，即待測樣品迅速轉(zhuǎn)移至氣相頂空進(jìn)樣器，70℃下保溫平衡30min并自動進(jìn)樣。空白為只含游離 粗酶液或固定化酶的PBS。反應(yīng)生成的己醛濃度通過以下公式進(jìn)行計算：

C_s＝A_s/A₀×C₀

其中，A_s為反應(yīng)樣品峰面積；A₀為標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積；C_s為反應(yīng)樣品濃度；C₀為標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度。

本發(fā)明目的之二是提供了一種填充床柱式反應(yīng)器，將殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶用于芳香性風(fēng)味成分C6醛的連續(xù)化制備，該裝置由柱式原料容器(1)、導(dǎo)管(2)、蠕動泵(3)、循環(huán)水浴夾套裝置(4)、反應(yīng)器(5)和產(chǎn)品收集容器(6)組成。

原料容器(1)頂部通過導(dǎo)管(2)與蠕動泵(3)尾部相連，蠕動泵(3)頂部通過導(dǎo)管(2)與反應(yīng)器(5)的底部相連，反應(yīng)器(5)的外部夾有循環(huán)水浴夾套裝置(4)，反應(yīng)器(5)的頂部通過導(dǎo)管(2)與產(chǎn)品收集容器(6)的頂部相連。

反應(yīng)器(5)為低壓玻璃柱，其長為200～500mm，直徑為10.5～20mm。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：

1)本發(fā)明所采用的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶顯著提高了產(chǎn)物的單位體積產(chǎn)量。

2)與游離酶攪拌式批次反應(yīng)方式相比，本發(fā)明所采用的己醛連續(xù)化制備方法在提高反應(yīng)單位體積產(chǎn)量最高可使己醛單位體積產(chǎn)量達(dá)到3560±102.1 并降低了反應(yīng)過程中的需酶量。

3)本發(fā)明所設(shè)計的柱式反應(yīng)器可實現(xiàn)己醛的連續(xù)化制備，整個制備過程操作簡單，易于控制且成本較低。

附圖說明

圖1使用固定化氫過氧化物裂解酶連續(xù)化生產(chǎn)己醛的簡圖。

圖2柱式反應(yīng)器中酶用量對己醛單位體積產(chǎn)量的影響。

圖3柱式反應(yīng)器中酶用量對底物轉(zhuǎn)化率的影響。

圖4柱式反應(yīng)器中底物濃度對需酶量的影響。

圖5柱式反應(yīng)器中底物濃度對轉(zhuǎn)化率的影響。

具體實施例

下面通過具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明。應(yīng)該理解的是，本發(fā)明的實施例僅僅是用于本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對本發(fā)明制備方法的改進(jìn)或簡化都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

本發(fā)明脂肪酸氫過氧化物的制備方法為：通過LOX反應(yīng)制備脂肪酸氫過氧化物(HPOs)。0.1M游離亞油酸分散于pH 9.0的硼酸鹽緩沖液中(0.2M)，于發(fā)酵罐中4℃下攪拌均勻后加入LOX、通氧并加壓至0.3MPa進(jìn)行 反應(yīng)。1.5h之后結(jié)束反應(yīng)并取一定量產(chǎn)物經(jīng)乙醇稀釋后在234nm測定其紫外吸光度，然后根據(jù)摩爾吸光系數(shù)計算反應(yīng)液中HPOs的濃度(ε＝25000cm-1M-1)。最后將反應(yīng)產(chǎn)物溶液置于4℃條件下冷藏待用。

本發(fā)明莧菜氫過氧化物裂解酶的提取方法為：去掉根和莖之后，將新鮮莧菜葉切碎并與pH 8.5的Tris-HCl緩沖液(0.1M并含有0.5％(m/v)PVP K-30)按照1:3的比例混合，均漿1min(10s×6)。四層紗布過濾之后所得濾液在4℃下18000×g離心30min。離心沉淀加入一定量的磷酸鹽緩沖液(PBS，0.02M，pH 6.8)，PBS中含10mM DTT以及0.5％(v/v)Triton X-100。4℃下攪拌1h之后于同樣溫度下18000×g離心30min，所得上清液經(jīng)30％硫酸銨沉淀之后，所得沉淀再次溶解于上述含有DTT以及Triton X-100的PBS中，即得游離HPL粗酶液。

本發(fā)明C6醛產(chǎn)物定量分析的方法為：使用頂空氣相色譜法(HS-GC)測定生成的醛類物質(zhì)。具體的檢測步驟如下：與分光光度檢測法相同的反應(yīng)溶液經(jīng)2min的保溫之后迅速將酶滅活。反應(yīng)產(chǎn)物使用氣相色譜儀進(jìn)行測定，即待測樣品迅速轉(zhuǎn)移至氣相頂空進(jìn)樣器，70℃下保溫平衡30min并自動進(jìn)樣。空白為只含游離粗酶液或固定化酶的PBS。反應(yīng)生成的己醛濃度通過以下公式進(jìn)行計算：

C_s＝A_s/A₀×C₀

其中，A_s為反應(yīng)樣品峰面積；A₀為標(biāo)準(zhǔn)樣品峰面積；C_s為反應(yīng)樣品濃度；C₀為標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度。

實施例1

制備殼聚糖復(fù)合水凝膠：將2.5g殼聚糖和2.5gγ-卡拉膠加入到100g含有5％v/v的乙酸溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液。隨后使用注射器逐滴滴加50ml混合溶液至500ml濃度為0.5M的NaOH溶液中并緩慢攪拌(50rpm)1天，以形成直徑為1–2mm的水凝膠微球。使用過量的戊二醛活化水凝膠微球表面的氨基以引入醛基，隨后加入7.75mmol的1，6-己二胺，反應(yīng)后1，6-己二胺(HMDA)通過活性醛基被連接在殼聚糖復(fù)合水凝膠微球的表面。

氫過氧化物裂解酶的固定化：將15.5mmol表面連接著1，6-己二胺(HMDA)的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球浸入300ml含有155mmol EDC的水溶液中，然后加入100ml含有15.5mmol HPL的PBS溶液，之后于4℃震蕩30min，過濾，得到殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶；用PBS及去離子水清洗殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶兩次；清洗過后的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶的穩(wěn)定性大幅提高。

己醛的連續(xù)化制備：用于己醛連續(xù)化制備的填充床柱式反應(yīng)器如圖1所示。18U的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶被填充于長200mm，直徑10.5mm的玻璃柱中。反應(yīng)器的溫度通過外部的循環(huán)水浴夾套控制為30℃。將濃度為50mM的13-HPOD溶液(0.02M PBS，pH 6.5含有1mM DTT)通過蠕動泵連續(xù)地加入到反應(yīng)柱中。當(dāng)體系達(dá)到穩(wěn)定的時候開始收集流出液并測定其中C6醛的產(chǎn)量。

由表1可知，與游離酶攪拌式批次反應(yīng)方式相比，本發(fā)明所采用的柱式連續(xù)化反應(yīng)提高了反應(yīng)過程中產(chǎn)物的單位體積產(chǎn)量以及單位酶活產(chǎn)量并降低了反應(yīng)過程中的需酶量。

表1生成1g己醛所需要的莧菜原料

實施例2

制備殼聚糖復(fù)合水凝膠：將7.5g殼聚糖和7.5gγ-卡拉膠加入到100g含有25％v/v的乙酸溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液。隨后使用注射器逐滴滴加50ml混合溶液至250ml濃度為2.5M的NaOH溶液中并緩慢 攪拌(10rpm)5天，以形成直徑為1–2mm的水凝膠微球。使用過量的戊二醛活化水凝膠微球表面的氨基以引入醛基，隨后加入46.56mmol的1，6-己二胺，反應(yīng)后1，6-己二胺(HMDA)通過活性醛基被連接在殼聚糖復(fù)合水凝膠微球的表面。

氫過氧化物裂解酶的固定化：將46.56mmol表面連接著1，6-己二胺(HMDA)的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球浸入300ml含有46.56mmol EDC的水溶液中，然后加入100ml含有46.56mmol HPL的PBS溶液，之后于10℃震蕩10min，過濾，得到殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶；用PBS及去離子水清洗殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶兩次；清洗過后的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。所得殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶的穩(wěn)定性大幅提高。

己醛的連續(xù)化制備：用于己醛連續(xù)化制備的填充床柱式反應(yīng)器如圖1所示。20U的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶被填充于長500mm，直徑20mm的低壓玻璃柱中。反應(yīng)器的溫度通過外部的循環(huán)水浴夾套控制為40℃。將濃度為10mM的13-HPOD溶液(0.2M PBS，pH 4.0含有3mM DTT)通過蠕動泵連續(xù)地加入到反應(yīng)柱中。當(dāng)體系達(dá)到穩(wěn)定的時候開始收集流出液并測定其中C6醛的產(chǎn)量。

實施例3

制備殼聚糖復(fù)合水凝膠：將3.0g殼聚糖和4.0gγ-卡拉膠加入到100g含有10％v/v的乙酸溶液中并攪拌至完全溶解，得到混合溶液。隨后使用注射器逐滴滴加50ml混合溶液至400ml濃度為1.0M的NaOH溶液中并緩慢攪拌(45rpm)1.5天，以形成直徑為1–2mm的水凝膠微球。使用過量的戊二醛活化水凝膠微球表面的氨基以引入醛基，隨后加入18.63mmol的1，6-己二胺，反應(yīng)后1，6-己二胺(HMDA)通過活性醛基被連接在殼聚糖復(fù)合水凝膠微球的表面。

氫過氧化物裂解酶的固定化：將18.63mmol表面連接著1，6-己二胺(HMDA)的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球浸入300ml含有93.15mmol EDC的水溶液中，然后加入100ml含有18.63mmol HPL的PBS溶液，之后于5℃震蕩25min，過濾，得到殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶；用PBS及去離子水清洗殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶兩次；清洗過后的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶，重新懸浮于PBS中，4℃條件下貯存待用。所得殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶的穩(wěn)定性大幅提高。

己醛的連續(xù)化制備：用于己醛連續(xù)化制備的填充床柱式反應(yīng)器如圖1所示。4U的殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶被填充于長250 mm，直徑15mm的玻璃柱中。反應(yīng)器的溫度通過外部的循環(huán)水浴夾套控制為35℃。將濃度為30mM的13-HPOD溶液(0.03M PBS，pH 6.0含有1.5mM DTT)通過蠕動泵連續(xù)地加入到反應(yīng)柱中。當(dāng)體系達(dá)到穩(wěn)定的時候開始收集流出液并測定其中C6醛的產(chǎn)量。

由圖2和圖3可知，在己醛合成反應(yīng)的初始階段，產(chǎn)物產(chǎn)量及底物轉(zhuǎn)化率隨著殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶用量的增加而迅速增大，在酶用量為16U，底物濃度為10mM時底物轉(zhuǎn)化率可達(dá)100％。

由圖4和圖5可知，該殼聚糖復(fù)合水凝膠微球固定化氫過氧化物裂解酶在本申請所述連續(xù)化生產(chǎn)過程中，底物濃度較低時連續(xù)化操作穩(wěn)定性較好。