本申請(qǐng)涉及全基因組選擇育種技術(shù)。具體而言，本申請(qǐng)涉及利用全基因組選擇育種技術(shù)選育含有重組核酸片段的水稻植株，以及由此而獲得的重組核酸片段及其檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

褐飛虱，學(xué)名Nilaparvata lugens屬同翅目，飛虱科。褐飛虱是單食性害蟲(chóng)，僅取食水稻，具有喜溫、抗寒能力弱、生長(zhǎng)周期短、遠(yuǎn)距離遷飛、暴發(fā)性和猖獗性等特征。褐飛虱是典型的刺吸式害蟲(chóng)，以取食韌皮部和木質(zhì)部汁液為生，取食量大、繁殖快，一旦大爆發(fā)，可造成受害區(qū)域顆粒無(wú)收。此外，還可以傳播水稻病毒病(如：草狀叢矮病和齒葉矮縮病)，對(duì)水稻生產(chǎn)也造成嚴(yán)重危害。

自20世紀(jì)80年代以來(lái)，從野生稻和栽培稻中已經(jīng)鑒定超過(guò)30個(gè)抗褐飛虱位點(diǎn)。由于褐飛虱表型鑒定的復(fù)雜性，導(dǎo)致近幾年才克隆Bph14、Bph26和Bph3等個(gè)別基因(Du等，PNAS.2009,106(52):22163-22168；Tamura等，Sci Rep.2014,4:5872；Liu等，Nature Biotechnology.2015,33:301-305)。另外，隨著抗褐飛虱品種在生產(chǎn)中的不斷利用，褐飛虱對(duì)品種的適應(yīng)能力逐漸增強(qiáng)。一些在生產(chǎn)上廣泛利用的抗性品種正逐漸喪失對(duì)褐飛虱的抗性(Deen等，Rice Genet Newsl.2010,25:70-72)。目前，褐飛虱防治仍依靠化學(xué)農(nóng)藥，不僅增加生產(chǎn)成本，污染環(huán)境，而且促使褐飛虱抗藥性增強(qiáng)。

由此可見(jiàn)，抗褐飛虱新品種的培育需求非常迫切。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝酥亟M核酸片段，其選自：i)包含SEQ ID No.1所示序列403-454位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序 列；ii)包含SEQ ID No.1所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；iii)包含SEQ ID No.2所示序列342-605位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；或iv)包含SEQ ID No.2所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；以及以上片段的組合。在一實(shí)施方案中，所述重組核酸片段為基因組重組核酸片段。

此外，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藱z測(cè)所述重組核酸片段的引物，其選自：(I)特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列1-403位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列454-812位核苷酸的序列的反向引物；(II)以下第一組引物對(duì)與第二組引物對(duì)的組合，其包含(a)第一組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1-403位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第403-453位核苷酸的序列的反向引物；和(b)第二組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第403-453位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第454-812位核苷酸的序列的反向引物；(III)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第403-404位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第453-454位核苷酸的序列的反向引物；(IV)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第403-404位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第454-812位核苷酸的序列的反向引物；(V)特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1-403位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第453-454位核苷酸的序列的反向引物；和/或任選地，(VI)特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列1-342位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列605-881位核苷酸的序列的反向引物；(VII)以下第三組引物對(duì)與第四組引物對(duì)的組合，其包含(c)第三組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第1-342位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第343-604位核苷酸的序列的反向引物；和(d)第四組引物對(duì)：特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第343-604位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第605-881位核苷酸的序列的反向引物；(VIII)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第342-343 位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第604-605位核苷酸的序列的反向引物；(IX)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第342-343位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第605-881位核苷酸的序列的反向引物；(X)特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第1-342位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第604-605位核苷酸的序列的反向引物。

在一實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增SEQ ID NO:1所示序列的引物對(duì)為，例如，5’-CGTCGCCGTCTTCGTCTTTCTTG-3’，和5’-TCCATAGGTCTCATTTGGGTTCA-3’。用于檢測(cè)SEQ ID NO:1所示序列的測(cè)序引物為，例如，5’-CGTCGCCGTCTTCGTCTTTCTTG-3’；和5’-TCCATAGGTCTCATTTGGGTTCA-3’。

在另一實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增SEQ ID NO:2所示序列的引物對(duì)為，例如，5’-CAGCCCGTATCAGCAACCTTCAC-3’，和5’-TTAATCATGTCGCCGATCACCAC-3’。用于檢測(cè)SEQ ID NO:2所示序列的測(cè)序引物為，例如，5’-CAGCCCGTATCAGCAACCTTCAC-3’；5’-CATATCCCAGACAACAAGG-3’；和5’-TTAATCATGTCGCCGATCACCAC-3’。

另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝诉x育含有重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以不含目的基因組片段的水稻受體植物親本作為輪回親本，將其與含有目的基因組片段的水稻供體植物進(jìn)行雜交，然后將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交，再將所得到的回交種進(jìn)行自交的步驟，其中利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇和背景選擇。例如，所述重組核酸片段如前所述。

在上述方法中，用于所述前景選擇的分子標(biāo)記選自BphC04ID06、RM6659和BphC04S08中的一種或多種；和/或利用水稻全基因組育種芯片進(jìn)行所述背景選擇。

在一實(shí)施方案中，本申請(qǐng)?zhí)峁┑倪x育含有抗褐飛虱基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以下步驟：1)將輪回親本與供體植物進(jìn)行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交，獲得回交一代，利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06和負(fù)向選擇標(biāo)記RM6659、BphC04S08對(duì)其進(jìn)行抗褐飛虱基因組片段的單側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻 全基因組育種芯片，例如RICE6K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；2)選擇背景回復(fù)較好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)75％)與輪回親本再次進(jìn)行回交，獲得回交二代，利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有抗褐飛虱基因組片段的重組單株，然后利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；3)選擇背景回復(fù)好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)87.5％)與輪回親本又一次進(jìn)行回交，獲得回交三代，利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06和負(fù)向選擇標(biāo)記RM6659、BphC04S08對(duì)其進(jìn)行抗褐飛虱基因組片段的另一側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇；以及4)選擇導(dǎo)入片段小，且背景回復(fù)好的重組單株(背景回復(fù)值超過(guò)93.75％)，將選中的重組單株自交一次，獲得自交種，利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對(duì)其進(jìn)行背景選擇，最終獲得含純合抗褐飛虱基因組重組核酸片段且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過(guò)99％)的水稻植株。

在另一實(shí)施方案中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇時(shí)采用的擴(kuò)增引物，包括：用于擴(kuò)增分子標(biāo)記BphC04ID06的引物對(duì)，其中正向引物為5’-CCTAGCCGTCAGGTTAATAGATCAT-3’，反向引物為5’-ACCAGGTCTACTAGCTTTTACGGAG-3’；用于擴(kuò)增分子標(biāo)記RM6659的引物對(duì)，其中正向引物為5’-TGTGGAGGCTTAGGAAATTCTGG-3’，反向引物為5’-TGTGAAACATGCCACGATACTGC-3’；用于擴(kuò)增分子標(biāo)記BphC04S08的引物對(duì)，其中正向引物為5’-GAGCGATCCATTAGCACGTGACT-3’，反向引物為5’-GTTTCTAGGTGTTCCCAACTCTCCC-3’。

又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藱z測(cè)重組核酸片段的方法，其包括根據(jù)如前所述的重組核酸片段設(shè)計(jì)特異性引物，以待測(cè)基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，并分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。具體地，例如，所述引物如前所述?？蛇x擇地，利用Sanger測(cè)序法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體而言，本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)重組核酸片段的方法中，用于擴(kuò)增及檢測(cè)SEQ ID No.1所示序列的引物組合如下：擴(kuò)增引物，包括正向引物：5’-CGTCGCCGTCTTCGTCTTTCTTG-3’，和反向引物：5’-TCCATAGGTCTCATTTGGGTTCA-3’；測(cè)序引物，包括正向引物： 5’-CGTCGCCGTCTTCGTCTTTCTTG-3’，和反向引物：5’-TCCATAGGTCTCATTTGGGTTCA-3’。所述方法以待測(cè)樣品基因組DNA為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用上述測(cè)序引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果與SEQ ID No.1序列一致或互補(bǔ)，則待測(cè)樣品中含有SEQ ID No.1所示同源重組片段。

另外，在本申請(qǐng)?zhí)峁┑臋z測(cè)重組核酸片段的方法中，用于擴(kuò)增及檢測(cè)SEQ ID No.2所示序列的引物組合如下：擴(kuò)增引物，包括正向引物：5’-CAGCCCGTATCAGCAACCTTCAC-3’，和反向引物：5’-TTAATCATGTCGCCGATCACCAC-3’；測(cè)序引物，包括正向引物：5’-CAGCCCGTATCAGCAACCTTCAC-3’，正向引物：5’-CATATCCCAGACAACAAGG-3’，和反向引物：5’-TTAATCATGTCGCCGATCACCAC-3’。所述方法以待測(cè)樣品基因組DNA為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用上述測(cè)序引物對(duì)獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，若測(cè)序結(jié)果與SEQ ID No.2序列一致或互補(bǔ)，則待測(cè)樣品中含有SEQ ID No.2所示同源重組片段。

通過(guò)檢測(cè)確定了待測(cè)樣品中含有SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測(cè)樣品中包含抗性基因重組核酸片段。

此外，本申請(qǐng)還提供了檢測(cè)重組核酸片段的試劑盒，其包括如前述的引物。

進(jìn)一步地，本申請(qǐng)還提供了篩選含有重組核酸片段的水稻植株或種子的方法，其包括檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段的步驟。在一實(shí)施方案中，采用如前所述的引物來(lái)檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在另一實(shí)施方案中，采用如前所述的檢測(cè)重組核酸片段的方法來(lái)檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在又一實(shí)施方案中，采用如前所述的試劑盒來(lái)檢測(cè)待測(cè)水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。

在又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝送ㄟ^(guò)所述方法篩選得到的含有本申請(qǐng)公開(kāi)的重組核酸片段的水稻植株或其種子。

本申請(qǐng)?zhí)峁┑幕谌蚪M選擇育種技術(shù)選育含有抗褐飛虱基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定三大特點(diǎn)。僅通過(guò)五世代轉(zhuǎn)育，即可僅將目標(biāo)基因組片段導(dǎo)入受體材料，并同時(shí)實(shí)現(xiàn)背景的回復(fù)。本申請(qǐng)改良的受體材料為光溫敏核不育系‘龍S’。利用上述方法，可以在不改變‘龍S’光溫敏核不育特性的前提下，導(dǎo)入褐飛虱抗性基因組片段。進(jìn)一步的，通過(guò)配組實(shí)現(xiàn)雜交種褐飛虱抗性的大幅度提高。本申請(qǐng)?zhí)峁┑闹亟M核酸片段與褐飛虱抗性緊密相關(guān)，可作為抗性資源應(yīng)用于其他品種的培育。

附圖說(shuō)明

圖1為本申請(qǐng)實(shí)施例1中CR023414水稻RICE60K全基因組育種芯片檢測(cè)結(jié)果；其中，橫坐標(biāo)數(shù)字所指示方框依次表示水稻12條染色體，縱坐標(biāo)數(shù)字為水稻基因組上的物理位置[以兆堿基(Mb)為單位]，灰色線條代表受體親本‘龍S’基因型，黑色線條代表供體親本‘華130B’基因型，白色線條代表兩親本基因型一致即無(wú)多態(tài)性區(qū)段。圖中第4號(hào)染色體黑色圓點(diǎn)處線條顯示區(qū)段即為導(dǎo)入的抗褐飛虱基因組重組核酸片段RecCR023414。

圖2為本申請(qǐng)實(shí)施例2中RecCR023414上游同源重組片段測(cè)序比對(duì)結(jié)果；圖中所示星號(hào)代表比對(duì)結(jié)果中相同堿基，圖中CR023414為獲得的新品系，T007為受體親本‘龍S’，R005為供體親本‘華130B’。

圖3為本申請(qǐng)實(shí)施例2中RecCR023414下游同源重組片段測(cè)序比對(duì)結(jié)果。

圖4為本申請(qǐng)實(shí)施例2中RecCR023414兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖；其中，(A)為上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖；(B)為下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖，上方堿基為供體‘華130B’的SNP或InDel標(biāo)記，下方堿基為受體‘龍S’的SNP或InDel標(biāo)記。灰色區(qū)段為來(lái)源于‘龍S’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來(lái)源于‘華130B’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段，橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，以堿基對(duì)數(shù)目(bp)為單位。

圖5為本申請(qǐng)實(shí)施例3中CR023414褐飛虱抗性室內(nèi)鑒定結(jié)果；圖中所示葉片依次為：(A)高感褐飛虱品種‘臺(tái)中在來(lái)1號(hào)’；(B)原品 種‘龍S’；(C)改良新品系CR023414；(D)供體親本‘華130B’。

具體實(shí)施方式

提供以下定義和方法用以更好地界定本申請(qǐng)以及在本申請(qǐng)實(shí)踐中指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)按照相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向從左向右書(shū)寫(xiě)，包括具有天然核苷酸基本性質(zhì)的已知類(lèi)似物(例如，肽核酸)，所述類(lèi)似物以與天然存在的核苷酸類(lèi)似的方式與單鏈核酸雜交。

在一些實(shí)施方案中，可以對(duì)本申請(qǐng)的核苷酸序列進(jìn)行改變，以進(jìn)行保守氨基酸替換。在某些實(shí)施方案中，可以依照單子葉密碼子偏好性對(duì)本申請(qǐng)的核苷酸序列進(jìn)行不改變氨基酸序列的替換，例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子，而不改變?cè)摵塑账嵝蛄兴幋a的氨基酸序列。

具體地，本申請(qǐng)涉及對(duì)SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2進(jìn)一步優(yōu)化所得的核苷酸序列。該方法的更多細(xì)節(jié)描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高抗褐飛虱基因組重組核酸片段在水稻中的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本申請(qǐng)還涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的變體。一般來(lái)講，特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互補(bǔ)序列。這樣的變體序列包括一個(gè)或多個(gè)核酸殘基的添加、缺失或替換，從而可以導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過(guò)本領(lǐng)域內(nèi)已知的序列比對(duì)程序包括雜交技術(shù)確定序列同一性。實(shí)施方案的核苷酸序列變體與本申請(qǐng)的序列的差異可以少至1-15個(gè)核苷酸、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)核苷酸。

本申請(qǐng)還涉及包含SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列中特定位點(diǎn)的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列，例如，包含SEQ ID No.1所示序列的403-454位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列，或者包含SEQ ID No.2所示序列的342-605位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列。根據(jù)包含上述特定位點(diǎn)的片段，能夠特異性地鑒定出相應(yīng)的SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列。進(jìn)一步地，通過(guò)鑒定出含有SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測(cè)樣品中包含抗性重組核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以與水稻育種的所有植物品種。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物原生質(zhì)體、植物可以從中再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢和植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、莖桿、根、根尖、花藥等。

在本申請(qǐng)的方法可以適用于任何需要選育的水稻品種。也就是說(shuō)，可以將任何缺少某種有利性狀的優(yōu)良品種(即綜合性狀較好，預(yù)計(jì)有發(fā)展前途的品種)用作輪回親本。用另一具有該受體所缺少的有利性狀的品種作為供體親本。在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，采用水稻‘龍S’作為輪回親本，采用具有良好的褐飛虱抗性的水稻‘華130B’作為供體。

在本申請(qǐng)所提供的重組植株的選育方法中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇。前景選擇的可靠性主要取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因組片段間連鎖的緊密程度，為提高選擇的準(zhǔn)確率，一般同時(shí)用兩側(cè)相鄰的兩個(gè)標(biāo)記對(duì)目標(biāo)基因組片段進(jìn)行跟蹤選擇。

在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，采用的前景選擇標(biāo)記包括正向選擇標(biāo)記和負(fù)向選擇標(biāo)記，其中，正向選擇標(biāo)記是在距目標(biāo)基因組片段(含抗褐飛虱基因)上、下游50kb(在水稻中其遺傳距離為0.2cM)范圍內(nèi)篩選的多型性分子標(biāo)記。負(fù)向選擇標(biāo)記是在距目標(biāo)基因組片段上、下游500kb(在水稻中其遺傳距離為2cM)范圍內(nèi)篩選的多型性分子標(biāo)記。在具體實(shí)施方案中，經(jīng)優(yōu)化篩選使用的正向選擇標(biāo)記是與目標(biāo)基因組片段緊密連鎖的標(biāo)記BphC04ID06，負(fù)向選擇標(biāo)記是距目標(biāo)片段上游約 370kb的分子標(biāo)記RM6659，以及距目標(biāo)片段下游約200kb的分子標(biāo)記BphC04S08。

在本申請(qǐng)的實(shí)施方案中，利用上述前景選擇標(biāo)記進(jìn)行同源重組的檢測(cè)時(shí)，一側(cè)或單側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是BphC04ID06檢出與‘華130B’相同帶型，且RM6659或BphC04S08檢出與‘龍S’相同帶型；兩側(cè)或雙側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是BphC04ID06檢出與‘華130B’相同帶型，且RM6659和BphC04S08檢出與‘龍S’相同帶型。

在本申請(qǐng)中，可以使用任何一種可利用的芯片進(jìn)行本申請(qǐng)所提供的育種方法中的背景選擇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以采用本申請(qǐng)人在中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)CN102747138A中公開(kāi)的水稻全基因組育種芯片RICE6K，或者在PCT國(guó)際申請(qǐng)WO/2014/121419中公開(kāi)的水稻全基因組育種芯片RICE60K。這兩份申請(qǐng)文件中的全部?jī)?nèi)容整體并入本文作為參考。

以下實(shí)施例僅用于說(shuō)明而非限制本申請(qǐng)范圍的目的。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。

本申請(qǐng)中所使用的水稻植株材料信息均可參見(jiàn)中國(guó)水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申請(qǐng)中所提到的水稻基因組物理位置均參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

本申請(qǐng)所提到的公開(kāi)SSR分子標(biāo)記可參見(jiàn)網(wǎng)站http://www.gramene.org/。

實(shí)施例1選育導(dǎo)入抗褐飛虱基因組片段的重組植株

本實(shí)施例中使用的材料為水稻‘龍S’及水稻‘華130B’。

水稻‘華130B’具有良好的褐飛虱抗性，推測(cè)可能是第4號(hào)染色體的Bph3(Liu等，Nature Biotechnology.2015,33:301-305)、QBph4(Hu等，Molecular Breeding.2015,35:3)和Bph15(Yang等，Theoretical and Applied Genetics.2004,110:182-191)所在的基因簇區(qū) 域?qū)υ摬牧系暮诛w虱抗性起了關(guān)鍵作用。

在重組植株的選育過(guò)程中，利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇，對(duì)所采用的前景選擇分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選。所使用的分子標(biāo)記部分來(lái)源于網(wǎng)站http://www.gramene.org/，部分自行設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)方法為，參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版，下載前述區(qū)段DNA序列。使用SSRLocator軟件對(duì)上述序列中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行掃描。利用Primer Premier 3.0軟件對(duì)尋找出的SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)引物106對(duì)。通過(guò)PCR的方法，篩選上述引物對(duì)在‘華130B’及‘龍S’中的多態(tài)性，最終挑選出在兩份材料中具有多態(tài)性、擴(kuò)增效率高的前景選擇分子標(biāo)記，分別是正向選擇標(biāo)記BphC04ID06和負(fù)向選擇標(biāo)記RM6659、BphC04S08。用于PCR擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的具體引物信息見(jiàn)表1。

表1前景選擇分子標(biāo)記引物信息

將‘華130B’中前述基因簇所在的基因組片段導(dǎo)入到‘龍S’中，具體過(guò)程如下：

以‘龍S’為輪回親本，‘華130B’為供體親本進(jìn)行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本‘龍S’進(jìn)行回交，獲得BC₁F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06和負(fù)向選擇標(biāo)記RM6659、BphC04S08進(jìn)行重組單株選擇，篩選出10個(gè)在目標(biāo)基因組片段一側(cè)同源重組的單株，即BphC04ID06檢出與‘華130B’相同帶型，且RM6659或BphC04S08檢出與‘龍S’相同帶型，并利用水稻全基因組育種芯片RICE6K(CN102747138A)對(duì)其進(jìn)行背景選擇(Yu等,Plant Biotechnology Journal.2014,12:28-37)。

在篩選出的10個(gè)單側(cè)同源重組單株中比較芯片結(jié)果，選擇背景回 復(fù)最好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)75％)，使其與輪回親本‘龍S’再次進(jìn)行回交，獲得BC₂F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)基因組片段的重組單株，BphC04ID06檢出與‘華130B’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE6K對(duì)其進(jìn)行背景選擇。

選擇背景回復(fù)較好的單株(此世代背景回復(fù)值超過(guò)87.5％)，使其與輪回親本‘龍S’又一次進(jìn)行回交，獲得BC₃F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06和負(fù)向標(biāo)記RM6659、BphC04S08對(duì)收獲的種子進(jìn)行目標(biāo)基因組片段另一側(cè)同源重組片段的篩選，獲得2個(gè)在目標(biāo)片段兩側(cè)重組的單株，BphC04ID06檢出與‘華130B’相同帶型，且RM6659和BphC04S08檢出與‘龍S’相同帶型。

利用水稻全基因組育種芯片RICE60K(WO/2014/121419)對(duì)上述2個(gè)雙側(cè)交換單株進(jìn)行背景和目標(biāo)片段選擇(Chen等，Molecular Plant.2014,7:541-553)，篩選到導(dǎo)入目標(biāo)片段較小，且背景回復(fù)好的目標(biāo)單株一個(gè)(此世代背景回復(fù)值超過(guò)93.75％)。

將選中的單株自交一次，獲得BC₃F₂，育苗后利用正向選擇標(biāo)記BphC04ID06對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，選擇含有目標(biāo)基因組片段的單株，BphC04ID06檢出與‘華130B’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對(duì)其進(jìn)行背景選擇。

最終獲得目標(biāo)片段純合，且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過(guò)99％)的株系一個(gè)，命名為CR023414。芯片檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

因‘龍S’為兩系不育系，在上述過(guò)程中的BC₁F₁、BC₂F₁、BC₃F₁及BC₃F₂世代入選單株均為不育單株，采取了以下辦法實(shí)現(xiàn)不育單株的育性轉(zhuǎn)化以回交或自交：當(dāng)不育單株進(jìn)入生殖期4期時(shí)，在低溫處理區(qū)(21-23℃)處理10天左右，可利用植物人工氣候箱、植物生長(zhǎng)室、冷水浸灌池等；使用碘-碘化鉀染色法對(duì)抽出穗的花粉進(jìn)行育性鑒定，判定70％以上花粉可育的穗為育性成功轉(zhuǎn)化穗，隨即開(kāi)展回交或自交。

實(shí)施例2導(dǎo)入褐飛虱抗性基因組片段后同源重組片段的確定

為了確定導(dǎo)入的抗褐飛虱基因組片段大小，對(duì)‘龍S’導(dǎo)入抗褐飛虱基因組片段的純合單株進(jìn)行了目標(biāo)基因組片段兩側(cè)同源重組片段的測(cè)序。將CR023414所含的抗褐飛虱基因組重組核酸片段命名為RecCR023414。

通過(guò)水稻全基因組育種芯片RICE60K檢測(cè)結(jié)果初步確定，RecCR023414位于兩個(gè)SNP標(biāo)記F0406623871GA和F0406992603GT之間。

同時(shí)，使用Miseq測(cè)序技術(shù)對(duì)‘龍S’、‘華130B’和CR023414三個(gè)樣本進(jìn)行全基因組測(cè)序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)試劑盒進(jìn)行文庫(kù)建立，使用Library Quantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)試劑盒進(jìn)行定量，使用MiSeq V2Reagent Kit(illumina)試劑盒進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。使用Miseq臺(tái)式測(cè)序儀(illumina)進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟及方法參見(jiàn)各試劑盒及測(cè)序儀使用說(shuō)明書(shū)。

根據(jù)前述SNP芯片及Miseq測(cè)序結(jié)果，將CR023414抗褐飛虱基因組重組片段上游同源重組片段定位在第4染色體的6628224bp到6629035bp區(qū)間，下游同源重組片段定位于6991621bp到6992485bp區(qū)間。

在此基礎(chǔ)上，參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版，下載對(duì)應(yīng)區(qū)段DNA序列。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增及測(cè)序引物，設(shè)計(jì)要求為引物長(zhǎng)22nt左右、GC含量40-60％且沒(méi)有錯(cuò)配。

以受體親本‘龍S’和供體親本‘華130B’為對(duì)照，對(duì)CR023414的上游和下游同源重組片段分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)進(jìn)行擴(kuò)增，使用兩步法或三步法尋找最佳擴(kuò)增條件，確保擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)中顯示為單一明亮條帶。其中確定的上游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃60sec，37個(gè)循環(huán)；20℃1min。下游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃60sec，37個(gè)循環(huán)；20℃1min。由此，最終篩選出兩對(duì)擴(kuò)增引物分別用于上游和下游同源重組片段的擴(kuò)增。

另外，以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，根據(jù)實(shí) 際測(cè)序效果，最終篩選出2條和3條測(cè)序引物分別用于上游和下游同源重組片段的測(cè)序。

具體的擴(kuò)增引物及測(cè)序引物序列見(jiàn)表2，測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖2和圖3。

RecCR023414上游同源重組片段測(cè)序長(zhǎng)度為812bp(SEQ ID No.1)。1-403bp為受體‘龍S’的基因組區(qū)段，與供體‘華130B’比較，存在3個(gè)SNP。404-453bp這一50bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。454-812bp為供體‘華130B’基因組片段，與‘龍S’比較，存在5個(gè)SNP。

RecCR023414下游同源重組片段測(cè)序長(zhǎng)度為881bp(SEQ ID No.2)。1-342bp為供體‘華130B’的基因組區(qū)段，與‘龍S’比較，存在6個(gè)SNP，1個(gè)Indel。343-604bp這一262bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。605-881bp為受體‘龍S’的基因組區(qū)段，與供體‘華130B’比較，存在4個(gè)SNP。

圖4為RecCR023414兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖。其中，(A)為上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖；(B)為下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖。上方堿基為供體‘華130B’的SNP或InDel標(biāo)記，下方堿基為受體‘龍S’的SNP或InDel標(biāo)記?；疑珔^(qū)段為來(lái)源于‘龍S’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來(lái)源于‘華130B’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段。橫坐標(biāo)為片段長(zhǎng)度，以堿基對(duì)數(shù)目(bp)為單位。

表2抗褐飛虱基因組重組核酸片段擴(kuò)增及測(cè)序引物信息

實(shí)施例3‘龍S’導(dǎo)入抗褐飛虱基因組片段后的抗性鑒定

為了鑒定選育出的含重組核酸片段植株的褐飛虱抗性，對(duì)本申請(qǐng)選育的新品系CR023414、受體親本‘龍S’、供體親本‘華130B’(作 為陽(yáng)性對(duì)照)，以及高感褐飛虱品種‘臺(tái)中在來(lái)1號(hào)’(作為陰性對(duì)照)進(jìn)行褐飛虱室內(nèi)抗性鑒定，鑒定方法如下。

將各份材料在室內(nèi)浸種、催芽，隨后播種在劃好格子線的塑料面盆中，每份材料分3行共播種45株，待兩葉一心期時(shí)，每行保留10株共30株健康長(zhǎng)勢(shì)一致的植株用于接蟲(chóng)。蟲(chóng)源來(lái)自從田間采集到的褐飛虱，并在室內(nèi)飼養(yǎng)繁殖。取2-3齡若蟲(chóng)到待鑒定的植株上，每株有5-10頭若蟲(chóng)即可。待‘臺(tái)中在來(lái)1號(hào)’死苗95％時(shí)開(kāi)始記錄各鑒定苗的抗性等級(jí)，取30株苗的抗性等級(jí)的平均值，作為該材料的抗性等級(jí)，根據(jù)抗性等級(jí)評(píng)價(jià)其抗性水平。其中，抗性等級(jí)共分10級(jí)：0或1級(jí)，葉片未受害或第一片葉葉尖發(fā)黃；2級(jí)，第一片葉1/2發(fā)黃或者葉尖皺縮；3級(jí)，第一片葉發(fā)黃或是枯萎；4級(jí)，第二片葉部分發(fā)黃或心葉葉尖發(fā)黃；5級(jí)，第二片葉發(fā)黃、皺縮或是枯萎、心葉青卷；6級(jí)，心葉卷曲，心葉葉尖枯萎；7級(jí)，心葉卷曲枯萎，植株未死亡；8級(jí)，心葉枯萎，稍微倒伏；9級(jí)，整株倒伏。根據(jù)上述抗性等級(jí)，0-0.9級(jí)判定為高抗，1.0-2.9級(jí)為抗，3.0-5.9級(jí)為中抗，6.0-6.9級(jí)為中感，7.0-7.9級(jí)為感，8.0-9.0級(jí)為高感。

褐飛虱室內(nèi)抗性鑒定結(jié)果見(jiàn)圖5，其中‘臺(tái)中在來(lái)1號(hào)’為高感，原品種‘龍S’為感，改良新品系CR023414為中抗，供體親本‘華130B’為高抗。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明及具體實(shí)施方案對(duì)本申請(qǐng)作了詳盡的描述，但在本申請(qǐng)基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本申請(qǐng)精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本申請(qǐng)要求保護(hù)的范圍。