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      重組核酸片段RecCR01BC02及其檢測(cè)方法與流程

      文檔序號(hào):12167240閱讀:來(lái)源:國(guó)知局

      技術(shù)特征:

      1.重組核酸片段,其選自:

      i)包含SEQ ID NO:1所示序列775-917位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列;

      ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列;

      iii)包含SEQ ID NO:2所示序列941-1254位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列;

      iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列;以及

      以上片段的組合。

      2.檢測(cè)權(quán)利要求1所述片段的引物,其中所述引物選自:

      (I)特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列1-775位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列917-1517位核苷酸的序列的反向引物;

      (II)以下第一組引物對(duì)與第二組引物對(duì)的組合,其包含

      (a)第一組引物對(duì):特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1-775位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第776-916位核苷酸的序列的反向引物;和

      (b)第二組引物對(duì):特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第776-916位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第917-1517位核苷酸的序列的反向引物;

      (III)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第775-776位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第916-917位核苷酸的序列的反向引物;

      (IV)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第775-776位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第917-1517位核苷酸的序列的反向引物;

      (V)特異性識(shí)別SEQ ID NO:1所示序列第1-775位核苷酸的序列 的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:1所示序列第916-917位核苷酸的序列的反向引物;和/或任選地,

      (VI)特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列1-941位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列1254-2103位核苷酸的序列的反向引物;

      (VII)以下第三組引物對(duì)與第四組引物對(duì)的組合,其包含

      (c)第三組引物對(duì):特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第1-941位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第942-1253位核苷酸的序列的反向引物;和

      (d)第四組引物對(duì):特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第942-1253位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第1254-2103位核苷酸的序列的反向引物;

      (VIII)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第941-942位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第1253-1254位核苷酸的序列的反向引物;

      (IX)特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第941-942位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第1254-2103位核苷酸的序列的反向引物;

      (X)特異性識(shí)別SEQ ID NO:2所示序列第1-941位核苷酸的序列的正向引物和特異性識(shí)別包含SEQ ID NO:2所示序列第1253-1254位核苷酸的序列的反向引物。

      3.檢測(cè)權(quán)利要求1所述片段的引物,其中所述引物選自:

      (I)擴(kuò)增SEQ ID NO:1所示序列的引物對(duì)

      5’-ACCTGAGCGATGGTGGTCTTGA-3’,

      5’-CGAGTCGTTCTTGGCGTACTTGA-3’;以及

      (II)測(cè)序SEQ ID NO:1所示序列的引物

      5’-AGTTGCTGATACCGAGAGGT-3’,

      5’-GGCGCTAATCAGGGTACAGT-3’,

      5’-TGTGCCACCATGCATCTCGA-3’;和/或任選地,

      (III)擴(kuò)增SEQ ID NO:2所示序列的引物對(duì)

      5’-TCAGCTTGAAAGAGCGAAGTGGT-3’,

      5’-ACTATTTGCGTCCTACTCCCTCCG-3’;以及

      (IV)測(cè)序SEQ ID NO:2所示序列的引物

      5’-CATGTCCCTCAACGGTTAGA-3’,

      5’-CATAACACGAACGGAAACCA-3’,

      5’-GTGCATTGTTCCACAGGAGA-3’,

      5’-GAAGAGAGGGACAAAGGAGA-3’。

      4.選育含有權(quán)利要求1所述的重組核酸片段的水稻植株的方法,其包括以不含目的基因組片段的水稻受體植物親本作為輪回親本,將其與含有目的基因組片段的水稻供體植物進(jìn)行雜交,然后將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交,再將所得到的回交種進(jìn)行自交的步驟,其中利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇和背景選擇。

      5.如權(quán)利要求4所述的方法,其中用于所述前景選擇的分子標(biāo)記選自Pi31、Pi2ID02和Pi2S91中的一種或多種;和/或

      任選地,利用水稻全基因組育種芯片進(jìn)行所述背景選擇。

      6.如權(quán)利要求4或5所述的方法,其中所述重組核酸片段含有抗稻瘟病基因,并且所述方法包括以下步驟:

      1)將輪回親本與供體植物進(jìn)行雜交,將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交,獲得回交一代,利用正向選擇標(biāo)記Pi31和負(fù)向選擇標(biāo)記Pi2ID02、Pi2S91對(duì)其進(jìn)行抗稻瘟病基因組片段的單側(cè)同源重組片段篩選,并利用水稻全基因組育種芯片對(duì)其進(jìn)行背景選擇;

      2)選擇背景回復(fù)較好的重組單株與輪回親本再次進(jìn)行回交,獲得回交二代,利用正向選擇標(biāo)記Pi31對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),選擇含有抗稻瘟病基因組片段的重組單株,然后利用水稻全基因組育種芯片對(duì)其進(jìn)行背景選擇;

      3)選擇背景回復(fù)好的重組單株與輪回親本又一次進(jìn)行回交,獲得回交三代,利用正向選擇標(biāo)記Pi31和負(fù)向標(biāo)記Pi2ID02、Pi2S91對(duì)其進(jìn)行抗稻瘟病基因組片段的另一側(cè)同源重組片段篩選,并利用水稻全 基因組育種芯片對(duì)其進(jìn)行背景選擇;以及

      4)選擇導(dǎo)入片段小,且背景回復(fù)好的重組單株,將選中的重組單株自交一次,獲得自交種,利用正向選擇標(biāo)記Pi31對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),并利用水稻全基因組育種芯片對(duì)其進(jìn)行背景選擇,最終獲得含純合抗稻瘟病基因組重組核酸片段且背景回復(fù)的水稻植株。

      7.如權(quán)利要求4至6中任一項(xiàng)所述的方法,其中利用分子標(biāo)記對(duì)重組植株進(jìn)行前景選擇時(shí)采用的擴(kuò)增引物如下:

      擴(kuò)增分子標(biāo)記Pi31的引物對(duì),其包括:

      正向引物:5’-ATCCAAACCCGTTGTTGCAC-3’,

      反向引物:5’-CGGCAATTGCCACGATGATA-3’;

      擴(kuò)增分子標(biāo)記Pi2ID02的引物對(duì),其包括:

      正向引物:5’-AAGTAATAATCCCCGCTGTTGT-3’,

      反向引物:5’-TTTCAAGCGAAGGAGGATGT-3’;以及

      擴(kuò)增分子標(biāo)記Pi2S91的引物對(duì),其包括:

      正向引物:5’-AAGGTGAAGGAGATGATGGC-3’,

      反向引物:5’-GTGCACCCACTCATCAAGAC-3’。

      8.檢測(cè)權(quán)利要求1所述的重組核酸片段的方法,其包括采用權(quán)利要求2或3所述的引物,以待測(cè)基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng),并分析PCR產(chǎn)物的步驟。

      9.檢測(cè)權(quán)利要求1所述的重組核酸片段的試劑盒,其包括權(quán)利要求2或3所述的引物。

      10.篩選含有權(quán)利要求1所述的重組核酸片段的水稻植株或種子的方法,其包括檢測(cè)待測(cè)水稻植株或種子的基因組中是否含有權(quán)利要求1所述的重組核酸片段的步驟;

      優(yōu)選地,采用權(quán)利要求2或3所述的引物,或者采用權(quán)利要求8所述的方法,或者采用權(quán)利要求9所述的試劑盒來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

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