本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物及其用途。

背景技術(shù)：

胃癌是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民生命健康的消化道惡性腫瘤，胃癌患者主要死于腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移，大約20％-53.5％的患者術(shù)后3年內(nèi)出現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移。有關(guān)胃癌發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制至今未明，導(dǎo)致目前缺少相應(yīng)的診斷試劑盒和其藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)及靶向治療的藥靶。

由于缺乏有效的早期篩查手段，絕大多數(shù)胃癌就診時(shí)已達(dá)到中晚期，喪失了手術(shù)治療最佳時(shí)期。因此，化療成為中晚期胃癌、特別是無(wú)法進(jìn)行手術(shù)治療胃癌的不二選擇。國(guó)內(nèi)外胃癌的化療基本上采用程式化治療方案，即5-FU+鉑類為主的治療模式。故實(shí)際對(duì)化療的應(yīng)答率較低，只有20-40％的患者有效，而大部分患者接受了無(wú)謂的化療毒副作用。如果不改善現(xiàn)有胃癌治療模式，則很難切實(shí)提高胃癌的實(shí)際治療效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是為胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的診斷或藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)及靶向治療的藥靶提供一種解決方法。

為此，本發(fā)明公開(kāi)了一種胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物，其為GPX4-MPND融合基因，GPX4(chr19:1106458)-MPND(chr19:4345742)，該基因的融合發(fā)生在GPX4的第7外顯子與MPND的第3外顯子之間。

同時(shí)，本發(fā)明還公開(kāi)了一組胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物在制備診斷胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的檢測(cè)試劑盒中的用途，所述胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物為導(dǎo)致氨基酸改變的體細(xì)胞單核苷酸變異其為RP1L1,NCBI Gene ID:94137；和/或PRB1，NCBI Gene ID:5542；和/或HS6ST3，NCBI Gene ID:266722；和/或DCTN1，NCBI Gene ID:1639；和/或ARMC4，NCBI Gene ID:55130中之一或它們?nèi)魏谓M合的單核苷酸變異。

在一些實(shí)施例中，所述RP1L1為8p23.1的10467547位點(diǎn)發(fā)生G>A變異；PRB1為12p13.2的11506869位點(diǎn)發(fā)生C>A變異；HS6ST3為13q32.1的97484796發(fā)生G>A變異；DCTN1為2p13.1的74593112發(fā)生G>A變異；ARMC4為10p12.1的28142179位點(diǎn)發(fā)生C>T變異。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將能通過(guò)能夠檢測(cè)SNV位點(diǎn)的任何方法或技術(shù)在個(gè)體的核酸中進(jìn)行在本文所公開(kāi)的一個(gè)或幾個(gè)SNV標(biāo)記上存在的核苷酸的分析。例如，一個(gè)人能用本發(fā)明所述的方法通過(guò)進(jìn)行Taqman法、質(zhì)譜法、DNA微陣列法、測(cè)序法、微測(cè)序、雜交、限制性片段分析、寡核苷酸連接檢測(cè)、等位基因特異性PCR-HRM或聯(lián)合應(yīng)用上述方法檢測(cè)SNV生物標(biāo)記。當(dāng)然，這一列表僅是示例性的，并且絕不用于限制本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用任何合適的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)這種檢測(cè)。

另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物在制備診斷胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的檢測(cè)試劑盒中的用途，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物為SFRP4，NCBI Gene ID:6424；NOX4，NCBI Gene ID:50507；HOXA11，NCBI Gene ID:3207；NKX2-5，NCBI Gene ID:1482；CDH16，NCBI Gene ID:1014；RP1L1,NCBI Gene ID:94137；PRB1，NCBI Gene ID:5542；TUBB6，NCBI Gene ID:84617；LOC100505875，NCBI Gene ID:100505875；的表達(dá)產(chǎn)物中之一或它們?nèi)魏谓M合。

在一些實(shí)施例中，所述胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物為RP1L1,NCBI Gene ID:94137；PRB1，NCBI Gene ID:5542；TUBB6，NCBI Gene ID:84617的表達(dá)產(chǎn)物中之一或它們?nèi)魏谓M合。

本發(fā)明還公開(kāi)了胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物在制備診斷胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的檢測(cè)試劑盒中的用途，胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物為L(zhǎng)IPF,NCBI Gene ID:8513；NKX6-2,NCBI Gene ID:84504；MIXL1,NCBI Gene ID:83881；CWH43,NCBI Gene ID:80157；SULT1E1,NCBI Gene ID:6783；CXCL5,NCBI Gene ID:6374；REG1A,NCBI Gene ID:5967；GHRL,NCBI Gene ID:51738；NKX2-2,NCBI Gene ID:4821；HTR1E,NCBI Gene ID:3354；HPGD,NCBI Gene ID:3248； ESRRG,NCBI Gene ID:2014；CYP2C19,NCBI Gene ID:1557；ADH1C,NCBI Gene ID:126；PNLIPRP3，NCBI Gene ID:119548；和CEACAM5，NCBI Gene ID:1048的表達(dá)產(chǎn)物中之一或它們?nèi)魏谓M合。

所述檢測(cè)試劑盒在人類受試者中進(jìn)行胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的易感性評(píng)價(jià)和/或診斷和/或預(yù)測(cè)的體外方法中使用，其中所述試劑盒包含用于進(jìn)行下列步驟的適當(dāng)?shù)墓ぞ撸?/p>

a)評(píng)價(jià)至少一種與所述的人類受試者的胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物類型和/或水平；和

b)將所述的人類受試者的在a)中評(píng)價(jià)的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)與健康的和/或患病的人的生物標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，來(lái)做出所述的人類受試者的胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)和/或診斷和/或預(yù)測(cè)。

術(shù)語(yǔ)“檢測(cè)試劑盒”和“試劑盒”是同義詞并可互換使用。

在本發(fā)明的上下文中，當(dāng)是指檢測(cè)試劑盒時(shí)，術(shù)語(yǔ)“適當(dāng)?shù)墓ぞ摺笔侵溉魏斡糜谶_(dá)到所指明的目的的任何技術(shù)手段。作為這種適當(dāng)?shù)墓ぞ叩姆窍拗菩岳樱芰信e試劑和/或材料和/或流程和/或說(shuō)明書(shū)和/或軟件等。本發(fā)明所述的所有試劑盒可包含適當(dāng)?shù)陌b和說(shuō)明書(shū)用于在本文所公開(kāi)的方法中使用。試劑盒可進(jìn)一步包含適當(dāng)?shù)木彌_液和聚合酶，如耐熱聚合酶，例如Taq聚合酶。這種試劑盒也包含對(duì)照引物和/或探針。

根據(jù)優(yōu)選的具體實(shí)施方式，本發(fā)明所述的檢測(cè)試劑盒為核酸檢測(cè)試劑盒，包括基因組DNA抽提試劑、PCR反應(yīng)體系試劑和HRM熒光染料試劑，所述PCR反應(yīng)體系包括dNTP、MgCl₂、Taq DNA聚合酶、PCR反應(yīng)緩沖液和引物。在可檢測(cè)出SNP位點(diǎn)的前提下，HRM熒光染料試劑可被Taqman法、質(zhì)譜法、DNA微陣列法、測(cè)序法、微測(cè)序等試劑替換。

另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物在制備治療胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的藥物篩選中的用途，所述胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物為SFRP4，NCBI Gene ID:6424；NOX4，NCBI Gene ID:50507；HOXA11，NCBI Gene ID:3207；NKX2-5，NCBI Gene ID:1482；CDH16，NCBI Gene ID:1014；RP1L1,NCBI Gene ID:94137；PRB1，NCBI Gene ID:5542；TUBB6，NCBI Gene ID:84617的表達(dá)產(chǎn)物中之一或它們?nèi)魏谓M合。

另一方面，本發(fā)明還公開(kāi)了胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物在制備治療胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的藥物篩選中的用途，所述胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物為L(zhǎng)IPF,NCBI Gene ID:8513；NKX6-2,NCBI Gene ID:84504；MIXL1,NCBI Gene ID:83881；CWH43,NCBI Gene ID:80157；SULT1E1,NCBI Gene ID:6783；CXCL5,NCBI Gene ID:6374；REG1A,NCBI Gene ID:5967；GHRL,NCBI Gene ID:51738；NKX2-2,NCBI Gene ID:4821；HTR1E,NCBI Gene ID:3354；HPGD,NCBI Gene ID:3248；ESRRG,NCBI Gene ID:2014；CYP2C19,NCBI Gene ID:1557；ADH1C,NCBI Gene ID:126；PNLIPRP3，NCBI Gene ID:119548；和CEACAM5，NCBI Gene ID:1048的表達(dá)產(chǎn)物中之一或它們?nèi)魏谓M合。

篩選治療胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的藥物(例如腫瘤治療藥物)的方法，所述方法包括：

(a)提供表達(dá)本發(fā)明所述胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng)物；

(b)將候選藥物與步驟(a)中提供的腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng)物接觸，作為給藥組；

(c)檢測(cè)比較給藥組與未給予候選藥物的對(duì)照腫瘤細(xì)胞系、腫瘤培養(yǎng)物或荷瘤動(dòng)物的藥物活性進(jìn)行比較；如果檢測(cè)結(jié)果顯示，給藥組的治療效果顯著高于對(duì)照組，則表明該候選藥物是治療胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的藥物。

本發(fā)明的方法可用于從化合物庫(kù)中篩選出針對(duì)治療胃癌或胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的藥物，可作為化合物篩選評(píng)估的一個(gè)重要指標(biāo)。本發(fā)明的方法也可用于臨床中對(duì)腫瘤患者的個(gè)性化治療的預(yù)測(cè)和診斷中，篩選出針對(duì)個(gè)體具有最佳腫瘤治療效果的抗腫瘤藥物。

本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)一系列的胃癌腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物，為研制相應(yīng)的診斷試劑盒，對(duì)我國(guó)胃癌腹膜轉(zhuǎn)移診斷現(xiàn)狀必將是一次有力的推動(dòng)，也為其藥物篩選、藥效評(píng)價(jià)及靶向治療開(kāi)辟了新的途徑。

附圖說(shuō)明

圖1樣本的體細(xì)胞突變與基因表達(dá)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖2 GPX4-MPND融合基因示意圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語(yǔ)與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

材料與方法

一、材料來(lái)源

經(jīng)瑞金醫(yī)院倫理委員會(huì)討論通過(guò)、患者簽署知情同意書(shū)后，收集患者非癌胃黏膜、胃癌原發(fā)灶、腹膜轉(zhuǎn)移灶、外周血白細(xì)胞等材料，其中一患者，胃竇部腫瘤伴有幽門(mén)梗阻入院；影像學(xué)(CT)示胃竇部腫瘤，橫結(jié)腸系膜疑有轉(zhuǎn)移；手術(shù)方式：全胃切除術(shù)+腹膜轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)；隨訪：術(shù)后2月死亡。此例患者術(shù)前腹部CT以及手術(shù)中均發(fā)現(xiàn)為胃癌伴有腹膜轉(zhuǎn)移，身體其他器官未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶。術(shù)前未接受過(guò)放療或者化療，對(duì)患者給予全胃切除術(shù)及腹膜轉(zhuǎn)移灶切除術(shù)。手術(shù)標(biāo)本肉眼檢查見(jiàn)腫瘤位于胃竇部，直徑約7cm，浸潤(rùn)潰瘍型。顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞呈彌漫性散布于胃壁呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，腫瘤向胃壁深部浸潤(rùn)穿透胃壁漿膜層。原發(fā)灶與腹膜轉(zhuǎn)移灶腫瘤細(xì)胞均呈印戒型組織學(xué)外觀，而非癌區(qū)胃黏膜呈現(xiàn)明顯慢性胃炎伴有腸上皮化生的組織病理學(xué)改變。病理診斷：低分化胃癌，彌漫型，伴有腹膜轉(zhuǎn)移。胃周圍淋巴結(jié)(18/28)伴有轉(zhuǎn)移。TNM分期Ⅳ期，患者術(shù)后2個(gè)月死亡。

全基因組測(cè)序樣本：

非癌胃黏膜、胃癌原發(fā)灶、腹膜轉(zhuǎn)移灶、外周血白細(xì)胞

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：

非癌胃黏膜、胃癌原發(fā)灶、腹膜轉(zhuǎn)移灶

二、DNA與RNA抽提、建庫(kù)與測(cè)序

基因組DNA文庫(kù)的構(gòu)建按照TruSeq DNA LT Sample Preparation Kit V2(Illumina) 的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。主要包括以下步驟，在使用NanoDrop測(cè)定DNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA完整性，完成DNA質(zhì)檢后，使用Covaris S220將基因組DNA打斷；片段化的DNA經(jīng)過(guò)末端補(bǔ)平和3’末端加A，然后在片段兩端各加上接頭，其中一個(gè)接頭上帶有特異性的barcode序列以區(qū)分樣本來(lái)源；使用切膠回收的方法從瓊脂糖凝膠電泳上選擇所需長(zhǎng)度的目的片段；然后運(yùn)用通用引物對(duì)(Illumina)進(jìn)行10個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化以及濃度測(cè)定后，使用IlluminaHiSeq2000系統(tǒng)，按照Illumina的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行深度測(cè)序。

分別提取各樣本的總RNA。RNA文庫(kù)構(gòu)建使用Illumina公司生產(chǎn)的TruSeq RNA Sample Preparation Kit V2試劑盒，按照廠家的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。主要步驟如下：在使用NanoDrop測(cè)定RNA濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性，以及Agilent2100 Bioanalyzer測(cè)定RNA的RIN值，完成RNA樣本的質(zhì)檢后，使用oligo-dT磁珠從總RNA里分離出帶有poly-A尾巴的RNA，即mRNA。mRNA經(jīng)過(guò)片段化后，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈和第二鏈，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的末端經(jīng)過(guò)修補(bǔ)成平末端，然后在3’末端加A。此片段的兩端分別與通用的接頭相連接，其中一個(gè)接頭帶有特異性的barcode序列，用以區(qū)分樣本的來(lái)源。連接產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化，去除連接不完整的產(chǎn)物以及空的接頭自連產(chǎn)物后，運(yùn)用與接頭序列互補(bǔ)的通用引物對(duì)之進(jìn)行15個(gè)循環(huán)的PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化以及濃度測(cè)定后，RNA文庫(kù)構(gòu)建即告完成。待測(cè)RNA文庫(kù)在cBot上完成cluster generation，然后將flowcell轉(zhuǎn)移到HiSeq2000型測(cè)序系統(tǒng)上，按照Illumina的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行二代測(cè)序及數(shù)據(jù)分析。

三、測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析

需要比較的樣本：原發(fā)癌灶與癌旁黏膜(慢性胃癌)；腹膜轉(zhuǎn)移癌灶與癌旁黏膜(慢性胃炎)；原發(fā)癌灶與腹膜轉(zhuǎn)移癌灶。需要比較的主要指標(biāo)：基因突變；小插入缺失；基因拷貝數(shù)變異；基因轉(zhuǎn)錄組變異；基因表達(dá)量改變；轉(zhuǎn)錄剪切變異；融合基因、信號(hào)通路分析等。通過(guò)生物信息分析識(shí)別到一組關(guān)鍵基因后設(shè)計(jì)相關(guān)突變分析引物、基因表達(dá)分析引物以及融合基因檢測(cè)引物，通過(guò)Sanger測(cè)序方法以及定量PCR等方法在原全基因組和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析樣本上進(jìn)行驗(yàn)證分析。

結(jié)果：

全基因組測(cè)序結(jié)果

對(duì)患者的外周血、慢性胃炎組織、胃癌原發(fā)灶組織以及腹膜轉(zhuǎn)移癌組織進(jìn)行了全基因組測(cè)序分析。測(cè)序產(chǎn)生了平均167.75Gb數(shù)據(jù)。將讀取片段匹配到人類基因組參考序列hg19，獲得了99.08％的匹配度。每份樣本測(cè)序深度平均為57X(34-80×之間)。該例全基因組測(cè)序詳細(xì)數(shù)據(jù)信息見(jiàn)表1.

以患者的外周血DNA測(cè)序作為正常參考序列，檢查了每份樣本全基因組的體細(xì)胞突變情況。我們檢測(cè)到大量的單核苷酸變異(single nucleotide variants，SNVs)，這些SNVs不僅出現(xiàn)在原發(fā)癌灶、轉(zhuǎn)移癌灶，也出現(xiàn)于慢性胃炎病灶中(表2)。

總計(jì)檢測(cè)到27個(gè)導(dǎo)致氨基酸改變的體細(xì)胞單核苷酸變異，這些變異均通過(guò)Sanger測(cè)序法得到了驗(yàn)證。其中10個(gè)單核苷酸變異出現(xiàn)在慢性胃炎樣本(ATXN3,PLIN4,PDZD2,MUC4,MUC17,DMBT1,DAB1,ZNF208,FLG2和CRNN),23個(gè)單核苷酸變異出現(xiàn)在原發(fā)癌樣本(ATXN3,PLIN4,PDZD2,MUC4,MUC17,DMBT1,DAB1,TUBB6,RP1L1,PRB1,PKLR,JAM2,ITGAD,IREB2,IQUB,HS6ST3,DCTN1,CORO1B,CCDC178,CCDC121,AKAP2,ACAN和ACADL),12個(gè)單核苷酸變異出現(xiàn)在腹膜轉(zhuǎn)移癌樣本(ATXN3,PLIN4,PDZD2,MUC4,DMBT1,DAB1,CRNN,RP1L1,PRB1,HS6ST3,DCTN1和ARMC4)。值得注意的是6個(gè)單核苷酸變異在慢性胃炎樣本、胃原發(fā)癌樣本與腹膜轉(zhuǎn)移癌樣本均存在(ATXN3,PLIN4,PDZD2,MUC4,DMBT1和DAB1)，這些基因的突變貫穿于胃癌的啟動(dòng)、進(jìn)展與轉(zhuǎn)移的全程，是與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的驅(qū)動(dòng)基因。有4個(gè)基因的單核苷酸變異同時(shí)出現(xiàn)在胃癌原發(fā)灶與腹膜轉(zhuǎn)移灶當(dāng)中(RP1L1,PRB1,HS6ST3和DCTN1)，這些基因可能參與了胃癌的進(jìn)展或者說(shuō)促進(jìn)了胃癌向腹膜的轉(zhuǎn)移。我們發(fā)現(xiàn)1個(gè)基因的單核苷酸變異僅出現(xiàn)在腹膜轉(zhuǎn)移灶中(ARMC4)，表明該基因突變?cè)谖赴└鼓まD(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用(圖1A).單核苷酸變異在慢性胃炎、原發(fā)癌灶與轉(zhuǎn)移癌灶的平均出現(xiàn)頻率分別是58.8％,60.1％和57.0％。以A→G/T→C置換最常見(jiàn),其次是G→A/C→T置換和A→C/T→G的置換(圖1B)。上述堿基置換情況與TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中報(bào)告的其他癌腫的堿基置換情況無(wú)明顯不同。

圖1A.展示三份配對(duì)樣本的體細(xì)胞突變情況，藍(lán)色代表單核苷酸變異，左側(cè)柱代表每一個(gè)基因突變數(shù)字，百分比代表該基因突變占樣本的比例。圖1B.代表三份樣本與對(duì)照血樣比較的SNVs百分比。圖1C.三份樣本突變基因的 RNA-Seq測(cè)得的mRNA表達(dá)水平。

突變基因?qū)RNA表達(dá)的影響

圖1C展示了基因單核苷酸變異對(duì)mRNA表達(dá)影響的熱圖。紅色代表突變基因mRNA表達(dá)的升高，綠色代表表達(dá)下降。對(duì)于同時(shí)在胃癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶均出現(xiàn)的突變基因要特別關(guān)注，因?yàn)檫@些基因變異對(duì)基因表達(dá)的影響有助于預(yù)測(cè)將來(lái)是否容易出現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移。其中RP1L1和PRB1均屬于激活性突變，導(dǎo)致基因的mRNA表達(dá)升高，這樣的基因?yàn)槲赴└鼓まD(zhuǎn)移的特征性分子靶點(diǎn)。此外，TUBB6在胃癌原發(fā)灶存在突變，但在原發(fā)灶與腹膜轉(zhuǎn)移灶均mRNA表達(dá)明顯增高(與慢性胃炎相比倍數(shù)增加>6)，是胃藥藥物開(kāi)發(fā)中新分子靶點(diǎn)和可用于相關(guān)檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)。ARMC4是僅在腹膜轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)的突變基因，該基因突變是失活性突變，導(dǎo)致mRNA表達(dá)下降，因此需要高度關(guān)注其在腹膜轉(zhuǎn)移中的抑癌基因作用。

新型融合基因的發(fā)現(xiàn)

采用TopHat軟件分析融合基因，首先剔除同一染色體內(nèi)兩個(gè)融合基因之間遺傳學(xué)距離小于100kb的融合事件，這種情況可能為人為假象，篩選到的基因融合事件以及相關(guān)基因mRNA的表達(dá)水平變化列于表3。圖2展示了融合基因與所在染色體位點(diǎn)，通過(guò)采用Sanger測(cè)序驗(yàn)證，證實(shí)了GPX4-MPND融合基因[GPX4(chr19:1106458)-MPND(chr19:4345742)]的存在，該基因的融合發(fā)生在GPX4的第7外顯子與MPND的第3外顯子之間。通過(guò)的RNA-seq的定量分析可知，GPX4-MPND融合導(dǎo)致GPX4基因mRNA表達(dá)升高了2.184倍，MPND的mRNA表達(dá)升高了1.3369倍。該基因融合是既往沒(méi)有報(bào)道過(guò)的人類腫瘤細(xì)胞基因融合事件。

RNA-Seq中差異表達(dá)基因的信號(hào)通路

我們將差異表達(dá)基因的FDR設(shè)定為FDR<0.1，倍數(shù)變化>1.5，分別比較了胃癌原發(fā)灶vs慢性胃炎、腹膜轉(zhuǎn)移灶vs慢性胃炎、腹膜轉(zhuǎn)移灶vs胃癌原發(fā)灶的差異基因，我們注意到有6個(gè)基因(SFRP4,NOX4,HOXA11,NKX2-5,CDH16和LOC100505875)在原發(fā)癌灶與腹膜轉(zhuǎn)移癌灶均表達(dá)升高(注意：這些基因并沒(méi)有檢測(cè)到突變，其表達(dá)變化可能受表觀遺傳學(xué)調(diào)控)，這些基因均可作為預(yù)測(cè)胃癌發(fā)生腹膜轉(zhuǎn)移標(biāo)志物，即可用于相關(guān)檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)，也可是胃藥藥物開(kāi)發(fā)中新分子靶點(diǎn)；還有16個(gè)基因(LIPF,NKX6-2,MIXL1,CWH43,SULT1E1,CXCL5,REG1A,GHRL,NKX2-2,HTR1E,HPGD,ESRRG,CYP2C19,ADH1C,PNLIPRP3和CEACAM5)在胃癌原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶均表達(dá)下降(注意：這些基因并沒(méi)有檢測(cè)到突變，其表達(dá)變化可能受表觀遺傳學(xué)調(diào)控)，這些基因可能是調(diào)控胃癌腹膜 轉(zhuǎn)移的重要抑癌基因，它們可用于相關(guān)檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)，也可是胃藥藥物開(kāi)發(fā)中新分子靶點(diǎn)。通過(guò)Gene Ontology(GO)功能注釋，我們獲得了這些原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶共有差異基因涉及的信號(hào)通路圖。這些表達(dá)明顯上調(diào)的基因主要涉及對(duì)細(xì)菌、乙醇、刺激物、化學(xué)趨化因子的反應(yīng)基因以及葡萄糖代謝相關(guān)基因；而這些表達(dá)明顯下調(diào)的基因主要涉及上皮形態(tài)發(fā)生、上皮分泌功能、肌肉發(fā)育相關(guān)基因。

本發(fā)明的范圍不受所述具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案只作為闡明本發(fā)明各個(gè)方面的單個(gè)例子，本發(fā)明范圍內(nèi)還包括功能等同的方法和組分。實(shí)際上，除了本文所述的內(nèi)容外，本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對(duì)本發(fā)明的多種改進(jìn)。所述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)。上文提及的每篇參考文獻(xiàn)皆全文列入本文作為參考。