本發(fā)明涉及生物信息領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及確定供體和受體的差異SNP的方法及應(yīng)用，更具體的，本發(fā)明涉及一種確定供體和受體差異SNP的方法、一種確定受體中供體來源cfDNA比例的方法、一種監(jiān)測器官移植排斥的方法和裝置。
背景技術(shù)：
：器官移植排斥臨床常規(guī)檢測方式通常是實(shí)驗(yàn)室和免疫學(xué)檢查、影像學(xué)檢查、細(xì)胞學(xué)與組織學(xué)檢查。常規(guī)無創(chuàng)類檢查敏感性及特異性不強(qiáng)，往往無法真實(shí)反映排斥程度。有創(chuàng)活檢檢查作為心臟移植等器官移植排斥檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，但有諸多限制，比如侵入性引起并發(fā)癥及感染、不能準(zhǔn)確定量、價(jià)格昂貴等。能否有一種便捷、早期、無創(chuàng)、準(zhǔn)確移植排斥監(jiān)測技術(shù)作為臨床檢測的輔助或補(bǔ)充呢？自血漿循環(huán)細(xì)胞游離DNA(cfDNA)發(fā)現(xiàn)以來，有文獻(xiàn)指出cfDNA可能是血液中的潛在生物標(biāo)志物，使得cfDNA的檢測就如“液態(tài)組織活檢(liquidbiopsy)”。cfDNA的檢測已被廣泛應(yīng)用在孕期胎兒非整倍性染色體檢測、腫瘤標(biāo)記物檢測、未知病原檢測等領(lǐng)域。器官移植同時(shí)也是基因組移植，可通過檢測受體血漿中供體細(xì)胞游離DNA(cell-freedonor-derivedDNA，cfdDNA)，進(jìn)而判斷移植排斥的程度，這種方法為低創(chuàng)或無創(chuàng)檢測，可最大程度化降低患者的機(jī)體損害。目前基于cfdDNA用于無創(chuàng)器官移植監(jiān)測按性別區(qū)分主要有兩種，分別是依賴于性別及不依賴于性別的檢測。依賴于性別的檢測，通常只適用于男性供體女性受體的情況，使用數(shù)字PCR技術(shù)(dPCR)進(jìn)行對(duì)移植后受體尿液進(jìn)行TSPY1(testisspecificprotein,Y-linked1)基因的擴(kuò)增，通過區(qū)分男性供體Y染色體特異基因的表達(dá)情況，從而判斷排斥程度。不依賴于性別的檢測，大多是通過檢測移植后受體中的cfdDNA的含量來判斷?，F(xiàn)有的確定受體中供體細(xì)胞游離DNA(cfdDNA)含量的方法，以及器官移植排斥檢測手段，有待改進(jìn)或補(bǔ)充。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明旨在至少解決上述問題至少之一或者提供至少一種可選擇的商業(yè)手段。依據(jù)本發(fā)明的一方面，本發(fā)明提供一種確定供體和受體差異SNP的方法，包括以下步 驟：獲得第一測序數(shù)據(jù)和第二測序數(shù)據(jù)，所述第一測序數(shù)據(jù)為所述供體的核酸序列測序結(jié)果，包括多個(gè)第一讀段，所述第二測序數(shù)據(jù)為所述受體的核酸序列的測序結(jié)果，包括多個(gè)第二讀段；分別將所述第一測序數(shù)據(jù)和所述第二測序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考序列上，獲得第一比對(duì)結(jié)果和第二比對(duì)結(jié)果；分別基于所述第一比對(duì)結(jié)果和所述第二比對(duì)結(jié)果進(jìn)行SNP檢測，獲得第一分型結(jié)果和第二分型結(jié)果，所述第一分型結(jié)果包括多個(gè)所述供體的SNP的基因型，所述第二分型結(jié)果包括多個(gè)所述受體的SNP的基因型，其中包括，對(duì)于只有一類第一讀段并且有多類第二讀段比對(duì)上的位點(diǎn)、以及只有一類第二讀段并且有多類第一讀段比對(duì)上的位點(diǎn)，分別基于各類第二讀段所占的比例和各類第一讀段所占的比例進(jìn)行基因分型，所述各類第一讀段之間的區(qū)別在于其共同比對(duì)上的位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)位置上的堿基不同，所述各類第二讀段之間的區(qū)別在于其共同比對(duì)上的位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)位置上的堿基不同；比較所述第一分型結(jié)果和所述第二分型結(jié)果，確定所述差異SNP，所述差異SNP為在所述供體和所述受體中基因型不相同的位點(diǎn)。依據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供一種確定受體中供體來源cfDNA比例的方法，該方法包括：(1)獲取來自所述受體的第三核酸樣本，所述第三核酸樣本包含cfDNA；(2)對(duì)(1)中的第三核酸樣本中的至少一部分cfDNA進(jìn)行序列測定，獲得第三測序數(shù)據(jù)，所述第三測序數(shù)據(jù)包括多個(gè)第三讀段；(3)將(2)中的第三讀段與參考序列比對(duì)，獲得第三比對(duì)結(jié)果；(4)基于(3)中的第三比對(duì)結(jié)果中包含的比對(duì)到差異SNP的第三讀段的數(shù)量，確定所述供體來源cfDNA的比例，所述差異SNP利用上述本發(fā)明一方面的確定供體和受體差異SNP的方法來確定。上述本發(fā)明一方面的確定供體和受體差異SNP的方法、和/或確定移植后的受體中的cfdDNA的比例的方法的全部或部分步驟，可以利用包含可拆分的相應(yīng)單元功能模塊的裝置/系統(tǒng)來施行，或者將方法程序化存儲(chǔ)于機(jī)器可讀介質(zhì)，利用機(jī)器運(yùn)行該可讀介質(zhì)來實(shí)現(xiàn)。依據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種確定供體和受體差異SNP的裝置，該裝置用以實(shí)施本發(fā)明一方面的確定供體和受體差異SNP的方法的全部或部分步驟，該裝置包括：輸入單元，用于輸入數(shù)據(jù)；輸出單元，用于輸出數(shù)據(jù)；處理器，用以執(zhí)行可執(zhí)行程序，執(zhí)行所述可執(zhí)行程序包括完成本發(fā)明一方面的確定供體和受體的差異SNP的方法；以及存儲(chǔ)單元，與所述輸入單元、所述輸出單元和所述處理器相連，用以存儲(chǔ)數(shù)據(jù)，其中包括所述可執(zhí)行程序。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，所稱的可執(zhí)行程序可以保存在存儲(chǔ)介質(zhì)中，所稱存儲(chǔ)介質(zhì)可以包括：只讀存儲(chǔ)器、隨機(jī)存儲(chǔ)器、磁盤或光盤等。依據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種確定受體中供體來源cfDNA(cfdDNA)比例 的系統(tǒng)，該系統(tǒng)用以實(shí)施上述本發(fā)明一方面的確定受體中cfdDNA比例的方法的全部或部分步驟，該系統(tǒng)包括：樣本獲取裝置，用以獲取來自移植后受體的第三核酸樣本，所述第三核酸樣本包含cfDNA；測序裝置，與所述樣本獲取裝置相連，用以對(duì)樣本獲取裝置中的第三核酸樣本中的至少一部分cfDNA進(jìn)行序列測定，獲得第三測序數(shù)據(jù)，所述第三測序數(shù)據(jù)包括多個(gè)第三讀段；比對(duì)裝置，與所述測序裝置相連，用以將來自測序裝置的第三讀段與參考序列進(jìn)行比對(duì)，獲得第三比對(duì)結(jié)果；確定cfdDNA含量裝置，與所述比對(duì)裝置相連，用以基于來自比對(duì)裝置的第三比對(duì)結(jié)果中包含的比對(duì)到差異SNP的第三讀段的數(shù)量，確定所述供體來源cfDNA的比例，所述差異SNP利用上述本發(fā)明一方面的確定供體和受體差異SNP的方法或裝置來確定。依據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供一種監(jiān)測器官移植排斥的方法，該方法包括：分別于不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)受體進(jìn)行采血，獲得多個(gè)血液樣本；利用本發(fā)明一方面的確定移植后受體中cfdDNA的含量的方法確定每個(gè)所述血液樣本中供體來源cfDNA的比例；基于確定的多個(gè)所述供體來源cfDNA的比例，進(jìn)行所述監(jiān)測。依據(jù)本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供一種監(jiān)測器官移植排斥的裝置，該裝置能夠?qū)嵤┥鲜霰景l(fā)明一方面的監(jiān)測器官移植排斥的方法的全部或部分步驟，該裝置包括：樣本獲取單元，用以分別于不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)受體進(jìn)行采血，獲得多個(gè)血液樣本；供體cfDNA比例確定單元，與所述樣本獲取單元相連，用以利用上述本發(fā)明一方面提供的確定受體中cfdDNA比例的方法來確定每個(gè)所述血液樣本中供體來源cfDNA的比例；監(jiān)測單元，與所述供體cfDNA比例確定單元相連，用以基于確定的多個(gè)所述供體來源cfDNA的比例，進(jìn)行所述監(jiān)測。利用上述本發(fā)明的方法和/或裝置系統(tǒng)，能夠確定出供體和受體的差異SNP，以作為區(qū)分混合cfDNA中供體和受體來源cfDNA的標(biāo)記；而通過這些標(biāo)記位點(diǎn)得到的測序讀段的支持情況，利用本發(fā)明的方法和/或裝置，可準(zhǔn)確確定移植后的受體cfDNA樣本中的cfdDNA的含量；而將其應(yīng)用于器官移植排斥檢測，由于其為低創(chuàng)或無創(chuàng)的檢測，且具有可接受的成本、直觀的數(shù)字化結(jié)果展示，能夠作為一種便捷、早期、無創(chuàng)和準(zhǔn)確的移植排斥監(jiān)測輔助技術(shù)，為臨床判斷移植排斥程度提供建議，或者作為臨床檢測移植排斥的輔助或補(bǔ)充手段。附圖說明本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施方式的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的基于確定供體和受體差異SNP的器官移植排斥監(jiān)測實(shí)驗(yàn)的流程圖。圖2是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的基于高通量測序平臺(tái)的基因分型實(shí)驗(yàn)的流程圖。圖3是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的基于高通量測序平臺(tái)的血漿cfDNA檢測實(shí)驗(yàn)的流程圖。圖4是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的捕獲范圍模似結(jié)果的示意圖。圖5是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的校正供體cfDNA比例與真實(shí)供體cfDNA比例關(guān)系的示意圖。圖6是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中的數(shù)據(jù)分析方法的流程圖。具體實(shí)施方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。所述實(shí)施方式在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在本文中，所使用的術(shù)語“第一”、“第二”等僅用于描述目的，而不能理解為指示或暗示相對(duì)重要性、隱含指明所指示的技術(shù)特征的數(shù)量或者具有順序關(guān)系。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隱含地包括一個(gè)或者多個(gè)該特征。在本發(fā)明的描述中，除非另有說明，“多個(gè)”的含義是兩個(gè)或兩個(gè)以上。在本文中，除非另有明確的規(guī)定和限定，術(shù)語“順序連接”、“相連”、“連接”等術(shù)語應(yīng)做廣義理解，例如，可以是固定連接，也可以是可拆卸連接，或一體地連接；可以是機(jī)械連接，也可以是電連接；可以是直接相連，也可以通過中間媒介間接相連，可以是兩個(gè)元件內(nèi)部的連通。對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以根據(jù)具體情況理解上述術(shù)語在本發(fā)明中的具體含義。在本文中，所稱的供體和受體，是相對(duì)個(gè)體，是基于移植，例如器官移植時(shí)的器官供給一方和接受一方來說的。供體和受體可以是相同物種，也可以是親緣關(guān)系近的能夠或者可能能夠進(jìn)行器官或組織移植的不同物種。在本文中，所稱的差異SNP，是指供體和受體基因組上或染色體上的具有不同基因型的相同位點(diǎn)，其中包括方便基于測序數(shù)據(jù)用于確定移植后受體中cfdDNA含量、和/或監(jiān)測移植排斥的位點(diǎn)，即診斷SNP。下文的公開了不同的具體實(shí)施方式或?qū)嵤├脕韺?shí)現(xiàn)本發(fā)明的不同方法步驟或裝置結(jié)構(gòu)。為了簡化本發(fā)明的公開，下文中對(duì)特定例子的步驟和設(shè)置進(jìn)行描述。當(dāng)然，它們僅僅 為示例，并且目的不在于限制本發(fā)明。此外，本發(fā)明可以在不同例子中重復(fù)參考數(shù)字和/或參考字母，這種重復(fù)是為了簡化和清楚的目的，其本身不指示所討論各種實(shí)施方式和/或設(shè)置之間的關(guān)系。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方式提供的確定供體和受體差異SNP的方法，包括以下步驟：S10獲得第一測序數(shù)據(jù)和第二測序數(shù)據(jù)。所稱第一測序數(shù)據(jù)為供體的核酸序列測序結(jié)果，包括多個(gè)第一讀段，所述第二測序數(shù)據(jù)為移植前受體的核酸序列的測序結(jié)果，包括多個(gè)第二讀段。所稱的測序數(shù)據(jù)通過對(duì)核酸序列進(jìn)行測序得來，測序依據(jù)所選的測序平臺(tái)的不同，可選擇但不限于Illumina公司的Hisq2000/2500測序平臺(tái)、LifeTechnologies公司的IonTorrent平臺(tái)和單分子測序平臺(tái)，測序方式可以選擇單端測序，也可以選擇雙末端測序，獲得的下機(jī)數(shù)據(jù)是測讀出來的片段，稱為讀段(reads)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所稱第一或者第二測序數(shù)據(jù)中的讀段的長度不相同，測序數(shù)據(jù)利用華大基因的BGISEQ-100測序平臺(tái)或者LifeTechnologies公司的IonTorrent系列中的Proton測序平臺(tái)對(duì)基因組核酸序列進(jìn)行測序獲得。所測核酸序列通常是將來個(gè)體的基因組DNA樣本經(jīng)過打斷獲得的，接著根據(jù)所選用的測序方法或測序平臺(tái)進(jìn)行相應(yīng)的測序文庫(library)制備，進(jìn)而將測序文庫上機(jī)測序，獲得下機(jī)數(shù)據(jù)即測序數(shù)據(jù)。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，S10獲得第一測序數(shù)據(jù)和第二測序數(shù)據(jù)包括：S11獲取第一核酸樣本和第二核酸樣本，所稱第一核酸樣本和第二核酸樣本分別來自供體和移植前的受體，第一核酸樣本和第二核酸樣本均包含基因組DNA；S13分別提取第一核酸樣本和第二核酸樣本中的基因組DNA；S15分別對(duì)來自S13的基因組DNA進(jìn)行捕獲，對(duì)應(yīng)獲得第一目的片段和第二目的片段；S17對(duì)第一目的片段和第二目的片段進(jìn)行序列測定，以獲得所稱的第一測序數(shù)據(jù)和第二測序數(shù)據(jù)。其中，S15分別對(duì)所述基因組DNA進(jìn)行捕獲包括基因組文庫構(gòu)建以及從基因組文庫中獲得目標(biāo)文庫：S150分別對(duì)來自S13的基因組DNA進(jìn)行片段化，獲得第一DNA片段和第二DNA片段，較佳的，片段化時(shí)使獲得的第一DNA片段和第二DNA片段的大小均為150-250bp；S151分別對(duì)來自S150的第一DNA片段和第二DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，獲得第一修復(fù)片段和第二修復(fù)片段；S152分別對(duì)來自S151的第一修復(fù)片段和第二修復(fù)片段進(jìn)行測序接頭連接，獲得第一連接產(chǎn)物和第二連接產(chǎn)物；S153分別對(duì)來自S152的第一連接產(chǎn)物和所述第二連接產(chǎn)物進(jìn)行大小選擇，獲得預(yù)定大小的第一連接產(chǎn)物和預(yù)定大小的第二 連接產(chǎn)物，基于S150片段化時(shí)獲得的第一DNA片段和第二DNA片段的大小均為150-250bp以及S152所連接的測序接頭的長度一般不大于100bp，較佳的，所選擇的預(yù)定大小的第一連接產(chǎn)物和預(yù)定大小的第二連接產(chǎn)物的大小均為210-270bp；S154對(duì)來自S153的預(yù)定大小的第一連接產(chǎn)物和預(yù)定大小的第二連接產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物；以及S155分別對(duì)來自S154的第一擴(kuò)增產(chǎn)物和第二擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行捕獲。捕獲可以利用固相芯片進(jìn)行，也可以利用液相芯片進(jìn)行，本實(shí)施例對(duì)捕獲方式不作限制。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，利用液相芯片進(jìn)行所述捕獲，設(shè)計(jì)探針使能夠捕獲的區(qū)域，即目標(biāo)區(qū)域包括基因組每條染色體上每Mb的20個(gè)SNP位點(diǎn)，所稱的每Mb的20個(gè)SNP位點(diǎn)為該Mb上次等位基因頻率最接近0.5的20個(gè)SNP?；跍y序數(shù)據(jù)包含這些捕獲的SNP，足以獲得足夠數(shù)目的差異SNP來區(qū)分供受體的cfDNA。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例，為了后續(xù)能夠準(zhǔn)確確定移植后受體中的cfdDNA的含量，需確保捕獲足夠的SNP位點(diǎn)以能夠從其中確定出足夠數(shù)目的差異SNP作為區(qū)分供體和受體的cfDNA的標(biāo)記，基于此，發(fā)明人評(píng)估了差異SNP個(gè)數(shù)對(duì)計(jì)算得的移植后的受體中的cfdDNA比例的影響，發(fā)明人將從上述捕獲的SNP位點(diǎn)確定得的差異SNP個(gè)數(shù)按1至0.1的比例依次遞減0.1，發(fā)現(xiàn)計(jì)算得的cfdDNA比例基本保持不變，由此確定更節(jié)約數(shù)據(jù)、捕獲成本以及測序成本的一個(gè)較佳實(shí)施例為，使捕獲的區(qū)域包括基因組每條染色體上每Mb的2個(gè)或者至少2個(gè)SNP位點(diǎn)，所稱每Mb的2個(gè)或者至少2個(gè)SNP位點(diǎn)為該Mb上次等位基因頻率最接近0.5的SNP。由此，可以使用更小的捕獲芯片、更低的數(shù)據(jù)量，也即更低的成本來檢測cfdDNA，達(dá)到移植排斥監(jiān)測的目的。通常所說的SNP都是二態(tài)性的，基因型是指同源染色體上一對(duì)等位位點(diǎn)的類型的組合。所稱的SNP的次等位基因頻率，也叫最小等位基因頻率(minorallelefrequency，MAF)是指該SNP的頻率較低的等位基因在給定人群中的頻率。SNP的MAF可以依據(jù)數(shù)據(jù)庫公開的信息，在該實(shí)施例中，挑選的MAF符合要求的SNP是通過查找NCBI中的dbSNP數(shù)據(jù)庫信息來確定的。MAF越高，即越接近0.5，說明該SNP在群體中雜合頻率越高，最后被確定為供體和受體的差異SNP的可能性越大。S20分別將第一測序數(shù)據(jù)和第二測序數(shù)據(jù)比對(duì)到參考序列上，獲得第一比對(duì)結(jié)果和第二比對(duì)結(jié)果。將測序數(shù)據(jù)中的讀段比對(duì)到參考序列上(readsmapping或者readsalignment)，是指將測序得到的DNA片段(也就是reads)定位在基因組上。通過讀段定位，在克服測序產(chǎn)生的Reads過短導(dǎo)致的技術(shù)困難的同時(shí)，也方便利用基因組位置作為橋梁，來將測序得到的數(shù)據(jù)與前期研究產(chǎn)生的注釋結(jié)果進(jìn)行整合。讀段比對(duì)定位往往被作為測序數(shù)據(jù)分析的第一 步，其質(zhì)量的好壞以及速度的快慢，都會(huì)直接對(duì)后續(xù)的分析工作產(chǎn)生影響。在比對(duì)過程中，根據(jù)比對(duì)參數(shù)的設(shè)置，reads最多允許有n個(gè)堿基錯(cuò)配(mismatch)，n優(yōu)選為1或2，若reads中有超過n個(gè)堿基發(fā)生錯(cuò)配，則視為該對(duì)reads無法比對(duì)到參考序列。具體比對(duì)時(shí)，可使用各種比對(duì)軟件，例如SOAP(ShortOligonucleotideAnalysisPackage)，bwa，Tmap等，本實(shí)施方式對(duì)此不作限定。所說的參考序列是已知序列，可以是預(yù)先獲得的目標(biāo)個(gè)體所屬生物類別中的任意的參考模板，例如，同一生物類別的已公開的基因組組裝序列，若混合核酸樣本為來自人類，其基因組參考序列(也稱為參考基因組)可選擇NCBI數(shù)據(jù)庫提供的HG19。比對(duì)結(jié)果包含各條讀段與參考序列的比對(duì)情況，包括讀段是否能夠比對(duì)上參考序列、讀段比對(duì)到參考序列的位置、比對(duì)到參考序列的唯一位置還是多個(gè)位置、某一位點(diǎn)多少讀段比對(duì)上、比對(duì)上某位點(diǎn)的讀段的相應(yīng)位置的堿基類型等。S30分別基于第一比對(duì)結(jié)果和第二比對(duì)結(jié)果進(jìn)行SNP檢測，獲得第一分型結(jié)果和第二分型結(jié)果。所稱第一分型結(jié)果包括多個(gè)供體的SNP的基因型，第二分型結(jié)果包括多個(gè)受體的SNP的基因型，其中包括，對(duì)于只有一類第一讀段并且有多類第二讀段比對(duì)上的位點(diǎn)、以及只有一類第二讀段并且有多類第一讀段比對(duì)上的位點(diǎn)，分別基于各類第二讀段所占的比例和各類第一讀段所占的比例進(jìn)行基因分型，所稱各類或者說不同類的第一讀段之間的區(qū)別在于其共同比對(duì)上的位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)位置上的堿基不同，所稱各類或者不同類別第二讀段之間的區(qū)別在于其共同比對(duì)上的位點(diǎn)的對(duì)應(yīng)位置上的堿基不同。SNP檢測或者SNP識(shí)別可以利用各種SNP識(shí)別軟件，包括但不限于SOAPsnp、SomaticSniper、CaVEMan、SAMtools、MuTect和TVC。將比對(duì)上同一位點(diǎn)的讀段分成不同類別，是基于比對(duì)上的讀段中的對(duì)應(yīng)位置的堿基不同來進(jìn)行的，例如比對(duì)到參考序列堿基為A的位點(diǎn)的讀段中，一部分讀段的該位置上的堿基為A，另一部分讀段的該位置上的堿基為G，則比對(duì)到該位點(diǎn)的讀段分為兩類。對(duì)于與參考序列堿基一致的或者不一致的純合子位點(diǎn)，常規(guī)的SNP識(shí)別分型軟件不能對(duì)其進(jìn)行分型。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，利用TVC軟件進(jìn)行SNP識(shí)別及分型，對(duì)于與參考序列堿基一致的純合位點(diǎn)，TVC軟件沒辦法對(duì)其分型。為最大化位點(diǎn)分型，在本發(fā)明的實(shí)施例中，利用SNP的各類讀段的支持情況來分型。所稱的對(duì)于只有一類第一讀段并且有多類第二讀段比對(duì)上的位點(diǎn)、以及只有一類第二讀段并且有多類第一讀段比對(duì)上的位點(diǎn)，分別基于各類第二讀段所占的比例和各類第一讀段所占的比例進(jìn)行基因分型，包括進(jìn)行以 下a和/或b：a.依據(jù)所占的比例大于95％的那一類第一讀段或者那一類第二讀段，確定該位點(diǎn)的基因型；b.依據(jù)所占的比例大于等于25％且小于等于95％的多類第一段讀段或者多類第二讀段中的所占比例最大的前兩類第一讀段或者前兩類第二讀段，確定該位點(diǎn)的基因型。所稱的只有一類第一讀段并且有多類第二讀段比對(duì)上的位點(diǎn)代表該位點(diǎn)在供體中的基因型為純合子、在受體中的基因型可能為雜合子；類似的，所稱的只有一類第二讀段并且有多類第一讀段比對(duì)上的位點(diǎn)，表示該位點(diǎn)在供體中的基因型可能為雜合子、在受體中的基因型為純合子。這兩類利用常規(guī)分型軟件不能對(duì)其進(jìn)行基因分型。而對(duì)于規(guī)則a，即比對(duì)上一位點(diǎn)的讀段中的某一類讀段的比例大于95％，則認(rèn)為該位點(diǎn)為純合子，組成堿基為比例大于95％的這類比對(duì)上的讀段的相應(yīng)位置的堿基。對(duì)于規(guī)則b，即對(duì)比上一位點(diǎn)的讀段中有兩類或者多于兩類的讀段的比例介于25％到95％，則認(rèn)為該位點(diǎn)是雜合子，堿基組成為其中的比例最大，即相對(duì)最接近95％的兩類讀段相應(yīng)位置上的堿基。為使上述依據(jù)讀段的支持比例進(jìn)行分型的分型結(jié)果準(zhǔn)確，對(duì)后續(xù)分析有意義，在進(jìn)行a和/或b之前，分別對(duì)第一讀段和第二讀段進(jìn)行去重，去掉由于文庫構(gòu)建過程的擴(kuò)增帶來的重復(fù)。S40比較第一分型結(jié)果和第二分型結(jié)果，確定差異SNP。所述差異SNP為在所述供體和所述受體基因組中基因型不相同的位點(diǎn)。由于移植后的受體的血漿cfDNA樣本中，受體來源的cfDNA的比例遠(yuǎn)高于cfdDNA，為方便依據(jù)確定的差異SNP的讀段比對(duì)或支持?jǐn)?shù)目進(jìn)行移植后受體中的cfdDNA含量的確定、輔助或補(bǔ)充用于移植排斥檢測，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，將所稱差異SNP中包括的，在受體基因組中為純合子、在供體基因組中為雜合子或者為不同純合子的位點(diǎn)，定義為診斷SNP，可將診斷SNP相應(yīng)表示為AAab或者AAbb，其中，AA表示所述差異SNP在受體中的基因型，ab或bb表示相同所述差異SNP在供體中的基因型。需要說明的是，用4個(gè)字母以及用大小寫字母來表示診斷SNP的基因型，只是為方便表示以及區(qū)分其在供體或受體中的基因型，非指特定或真實(shí)堿基。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方式提供的一種確定受體中供體來源cfDNA比例的方法，該方法包括：(1)獲取來自所述受體的第三核酸樣本，所述第三核酸樣本包含cfDNA；(2)對(duì)(1)中的第三核酸樣本中的至少一部分cfDNA進(jìn)行序列測定，獲得第三測序數(shù)據(jù)，所述第三測序數(shù)據(jù)包括多個(gè)第三讀段；(3)將(2)中的第三讀段與參考序列比對(duì)，獲得第三比對(duì)結(jié)果；(4)基于(3)中的第三比對(duì)結(jié)果中包含的比對(duì)到差異SNP的第三讀段的數(shù)量，確定所述供體來源cfDNA的比例，所述差異SNP利用上述本發(fā)明一方面或者任一實(shí) 施例中的確定供體和受體差異SNP的方法來確定。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，第三核酸樣本來自移植后的受體的外周血。外周血血液或血漿中包含細(xì)胞游離DNA。移植后的受體的外周血樣本一般是混合核酸樣本，包含目前技術(shù)能夠檢測區(qū)分出或者不能檢測區(qū)分出的供體來源的cfDNA。前述對(duì)測序、讀段、比對(duì)、參考序列、比對(duì)結(jié)果以及差異SNP的定義、包含的情況、可采取的方式以及參數(shù)或設(shè)置的影響，在該方法(1)-(3)步驟中同樣適用，在此不再贅述。比對(duì)結(jié)果中，將比對(duì)上某位點(diǎn)的讀段中的相應(yīng)位置與該位點(diǎn)包含的任一堿基類型的相同的讀段稱為支持該位點(diǎn)的讀段，例如，某一雜合SNP為C/T，在DNA上本來堿基為C(參考序列上為C)，比對(duì)上該雜合位點(diǎn)的讀段中，若讀段上的該位置的堿基為C或T，則為支持該位點(diǎn)的讀段；類似的，若讀段上的該位置的堿基為C，則稱該類讀段為支持該位點(diǎn)的這一等位位點(diǎn)的讀段。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述差異SNP包括在所述受體中為純合子、在所述供體中為雜合子或者為不同純合子的位點(diǎn)，表示這些差異SNP為AAab或AAbb，其中，AA表示所述差異SNP在受體中的基因型，ab或bb表示相同所述差異SNP在供體中的基因型；(4)包括：利用以下公式計(jì)算所述供體來源cfDNA的比例，供體來源其中，N表示第三讀段的數(shù)量，NAB(B)表示支持AAab位點(diǎn)的等位位點(diǎn)b的第三讀段的數(shù)量，NBB(B)表示支持AAbb位點(diǎn)的等位位點(diǎn)b的第三讀段的數(shù)量，NAB(A)表示支持AAab位點(diǎn)的等位位點(diǎn)A或a的第三讀段的數(shù)量，NAB(A)表示支持AAbb位點(diǎn)的等位位點(diǎn)A的第三讀段的數(shù)量。為消除或減少測序文庫構(gòu)建、測序和/或比對(duì)錯(cuò)誤帶來的影響，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)較佳實(shí)施例，(4)還包括：利用比對(duì)到在所述供體和所述受體中為相同純合基因型的位點(diǎn)的第三讀段的數(shù)量，對(duì)所述供體來源cfDNA的比例進(jìn)行錯(cuò)誤校正，以獲得校正后的供體來源cfDNA的比例，表示所述相同純合基因型的位點(diǎn)為CC。利用以下公式確定所述校正后的供體來源cfDNA的比例，校正后的供體來源其中，NCC(error)表示比對(duì)到CC位點(diǎn)的該位置非C的第三讀段的數(shù)量，即比對(duì)到CC位點(diǎn)但不支持C的第三讀段的數(shù)量；NCC(C)表示比對(duì)到CC位點(diǎn)的該位置為C的第三讀段的數(shù)量，即比對(duì)到該位點(diǎn)且支持該等位位點(diǎn)的第三讀段的數(shù)量。發(fā)明人進(jìn)行試驗(yàn)?zāi)M，模擬出多個(gè)cfdDNA比例確定的cfDNA樣本，通過上述校正后的公式計(jì)算出的cfdDNA比例值，與真實(shí)的cfdDNA 比例呈高度線性相關(guān)(r>0.99)，說明利用該方法能夠準(zhǔn)確確定移植后的受體cfDNA中的cfdDNA含量。根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)實(shí)施方式提供的一種確定供體和受體差異SNP的裝置，該裝置用以實(shí)施上述本發(fā)明任一實(shí)施方式中的確定供體和受體差異SNP的方法的全部或部分步驟，該裝置包括：輸入單元，用于輸入數(shù)據(jù)；輸出單元，用于輸出數(shù)據(jù)；處理器，用以執(zhí)行可執(zhí)行程序，執(zhí)行所述可執(zhí)行程序包括完成本發(fā)明任一實(shí)施方式中的確定供體和受體的差異SNP的方法；以及存儲(chǔ)單元，與所述輸入單元、所述輸出單元和所述處理器相連，用以存儲(chǔ)數(shù)據(jù)，其中包括所述可執(zhí)行程序。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解，所稱的可執(zhí)行程序可以保存在存儲(chǔ)介質(zhì)中，所稱存儲(chǔ)介質(zhì)可以包括：只讀存儲(chǔ)器、隨機(jī)存儲(chǔ)器、磁盤或光盤等。上述對(duì)本發(fā)明的任一實(shí)施方式中的確定供體和受體差異SNP的方法的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)的描述，也適用于本裝置，在此不再贅述。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式提供的一種確定受體中供體來源cfDNA(cfdDNA)比例的系統(tǒng)，該系統(tǒng)用以實(shí)施上述本發(fā)明任一實(shí)施方式中的確定受體中cfdDNA比例的方法的全部或部分步驟，該系統(tǒng)包括：樣本獲取裝置，用以獲取來自移植后受體的第三核酸樣本，所述第三核酸樣本包含cfDNA；測序裝置，與所述樣本獲取裝置相連，用以對(duì)樣本獲取裝置中的第三核酸樣本中的至少一部分cfDNA進(jìn)行序列測定，獲得第三測序數(shù)據(jù)，所述第三測序數(shù)據(jù)包括多個(gè)第三讀段；確定cfdDNA含量裝置，與所述測序裝置相連，用以基于來自測序裝置的第三測序數(shù)據(jù)中支持差異SNP的第三讀段的數(shù)量，確定所述供體來源cfDNA的比例，所述差異SNP利用上述本發(fā)明任一實(shí)施方式的確定供體和受體差異SNP的方法或裝置來確定。上述對(duì)本發(fā)明的任一實(shí)施方式中的確定受體中cfdDNA比例的方法的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)的描述，也適用于本系統(tǒng)，在此不再贅述。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，為實(shí)施上述具體實(shí)施例中的確定受體中cfdDNA比例的方法中的具體步驟，可以進(jìn)一步利用包含可拆分的相應(yīng)單元功能模塊的裝置來施行。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式提供的一種監(jiān)測器官移植排斥的方法，該方法包括：分別于不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)受體進(jìn)行采血，獲得多個(gè)血液樣本；利用上述本發(fā)明任一實(shí)施方式中的確定移植后受體中cfdDNA的含量的方法確定每個(gè)所述血液樣本中供體來源cfDNA的比例；基于確定的多個(gè)所述供體來源cfDNA的比例，進(jìn)行所述監(jiān)測。上述對(duì)本發(fā)明的任一實(shí)施方式中的確定受體中cfdDNA比例的方法的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)的描述，也適用于本方法，在此不再贅述?；跍?zhǔn)確定量多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的移植后受體cfDNA樣本中的cfdDNA含量，進(jìn)行移植排斥監(jiān)測，由于其為低創(chuàng)或無創(chuàng)的檢測，且具有可接受的成本、直觀的數(shù)字化結(jié)果展示， 能夠作為一種便捷、早期、無創(chuàng)和準(zhǔn)確的移植排斥監(jiān)測輔助手段，為臨床判斷移植排斥程度提供建議，或者作為臨床檢測移植排斥的輔助或補(bǔ)充手段。根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方式提供的一種監(jiān)測器官移植排斥的裝置，該裝置能夠?qū)嵤┥鲜霰景l(fā)明任一實(shí)施方式中的監(jiān)測器官移植排斥的方法的全部或部分步驟，該裝置包括：樣本獲取單元，用以分別于不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)受體進(jìn)行采血，獲得多個(gè)血液樣本；供體cfDNA比例確定單元，與所述樣本獲取單元相連，用以利用上述本發(fā)明一方面提供的確定受體中cfdDNA比例的方法來確定每個(gè)所述血液樣本中供體來源cfDNA的比例；監(jiān)測單元，與所述供體cfDNA比例確定單元相連，用以基于確定的多個(gè)所述供體來源cfDNA的比例，進(jìn)行所述監(jiān)測。上述對(duì)本發(fā)明的任一實(shí)施方式中的確定受體中cfdDNA比例的方法以及對(duì)任一實(shí)施方式中的監(jiān)測器官移植排斥的方法的技術(shù)特征和優(yōu)點(diǎn)的描述，也適用于本裝置，在此不再贅述。利用上述本發(fā)明的方法和/或裝置系統(tǒng)，能夠確定出供體和受體的差異SNP，作為區(qū)分混合cfDNA中供體和受體來源cfDNA的標(biāo)記；而通過這些標(biāo)記位點(diǎn)得到的測序讀段的比對(duì)或支持情況，利用本發(fā)明的方法和/或裝置，可準(zhǔn)確確定移植后的受體cfDNA樣本中的cfdDNA的含量；而將其應(yīng)用于器官移植排斥檢測，由于其為低創(chuàng)或無創(chuàng)的檢測，且具有可接受的成本、直觀的數(shù)字化結(jié)果展示，能夠作為一種便捷、早期、無創(chuàng)和準(zhǔn)確的移植排斥監(jiān)測輔助技術(shù)，為臨床判斷移植排斥程度提供建議，或者作為臨床檢測移植排斥的輔助或補(bǔ)充手段。以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法、裝置和/或系統(tǒng)進(jìn)行詳細(xì)的描述。下面示例，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。除另有交待，以下實(shí)施例中涉及的未特別交待的試劑、序列(接頭、標(biāo)簽和引物)、軟件及儀器，都是常規(guī)市售產(chǎn)品或者開源的，比如購自LifeTechnologies等。實(shí)施例一將本發(fā)明的確定差異SNP的方法和/或裝置用于器官移植免疫排斥監(jiān)測，實(shí)驗(yàn)部分的思路如圖1所示，可分為兩步：(1)對(duì)器官移植的供體和受體進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，用于基因分型，使能夠從基因?qū)用鎱^(qū)分供體和受體；(2)對(duì)各個(gè)采血點(diǎn)的血漿cfDNA進(jìn)行全基因組測序，分析評(píng)估各采血點(diǎn)血漿中供體cfDNA占總cfDNA的百分比。1、基因組目標(biāo)區(qū)域捕獲進(jìn)行SNP分型該部分實(shí)驗(yàn)流程如圖2所示，先將基因組DNA打斷成主帶為150-250bp小片段DNA，打斷后DNA片段進(jìn)行末端補(bǔ)平，加接頭后，取1ug構(gòu)建完成的文庫，通過自主設(shè)計(jì)地NimblegenSeqCapEZChoiceLibrary將目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行富集，然后通過PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物即可用于測序分析，其具體步驟如下：1.1外周血樣本基因組DNA的提取；1.2取1μg基因組DNA，超聲波打斷至主帶位于150-250bp左右為止；1.3把打斷成小片段的DNA修復(fù)成平末端；1.4加上接頭后，用瓊脂糖電泳切膠法選擇210-230bp、230bp-250bp或者250-270bp大小的DNA片段；1.5PCR擴(kuò)增目地片段，用SeqCapEZChoiceLibrary進(jìn)行SNP位點(diǎn)捕獲；1.6PCR擴(kuò)增捕獲的片段，Agilent2100檢測文庫質(zhì)量合格后，通過BGISEQ-100測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。2、各采血點(diǎn)的血漿cfDNA檢測血漿cfDNA檢測實(shí)驗(yàn)流程如圖3所示，各采血點(diǎn)血漿分離后，提取cfDNA，末端修復(fù)后加接頭，最后進(jìn)行一個(gè)PCR擴(kuò)增，具體步驟如下：2.1兩步離心法分離各采血點(diǎn)血漿，避免基因組污染，提取血漿cfDNA；2.2漿cfDNA修復(fù)成平末端；2.3加上接頭并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用Agilent2100進(jìn)行文庫質(zhì)量檢測合格后，通過BGISEQ-100測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序。上述步驟1.5中所用的SeqCapEZChoiceLibrary為華大基因自主設(shè)計(jì)，羅氏合成的SNP捕獲芯片。本液態(tài)芯片的目標(biāo)區(qū)域的確定包括：從HapMap所有三個(gè)階段以及千人基因組計(jì)劃(1kGP)里面選取雜合的位點(diǎn)為原始目標(biāo)區(qū)域；在每條染色體上每Mb長度內(nèi)選擇20個(gè)次等位基因頻率最接近0.5的SNP位點(diǎn)，確定共有56049個(gè)SNP點(diǎn)可進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，委托羅氏公司進(jìn)行捕獲探針的合成。獲得最終芯片大小5.7M，包含56049個(gè)目標(biāo)SNP位點(diǎn)，針對(duì)目標(biāo)區(qū)域7.7M，一次可以捕獲15-20個(gè)樣本。對(duì)于器官移植患者，無論哪種排斥反應(yīng)(急性、慢性)，控制不及時(shí)都可能導(dǎo)致病人死亡。因此在臨床工作中，早期發(fā)現(xiàn)和診斷排斥反應(yīng)，對(duì)于及時(shí)采取防治措施具有重要指導(dǎo)意義。目前已有的高通量測序檢測方法成本過高，難以推廣。利用本發(fā)明的方法和/或裝置能夠成功解決成本問題，而且技術(shù)上的主要有益效果還體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：一、在一定程度上縮小捕獲范圍不會(huì)引起供體比例的顯著變化；對(duì)器官移植患者的供體和受體進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，會(huì)降低測序的物理覆蓋度，為研究目標(biāo)區(qū)域捕獲測序?qū)┦荏wcfDNA含量百分比的影響，我們進(jìn)行了一個(gè)模似分析。如圖4所示，取市售的全基因組SNP芯片(180M)對(duì)移植前供受體樣本進(jìn)行基因分型，對(duì)全基因組測序所得的可用SNP數(shù)目，按梯度10％減少其數(shù)據(jù)量，計(jì)算各個(gè)梯度的供受體cfDNA百分比。從圖4中可以看出，可用SNP位點(diǎn)個(gè)數(shù)隨機(jī)去除90％后，供受體百分比從3.1％下降為2.95％，沒有發(fā)生顯著的變化。因而我們采取目標(biāo)區(qū)域捕獲測序代替芯片分型技術(shù)是可行的。二、利用目標(biāo)區(qū)域捕獲芯片，大幅降低成本。cell-freeDNA的檢測首先依賴于對(duì)供體及受體進(jìn)行基因分型，此過程涉及對(duì)上萬個(gè)SNP位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行分析,這一技術(shù)我們選擇的是高通量芯片捕獲測序平臺(tái)，從而相對(duì)于已有的基于芯片分型的技術(shù)成本大幅降低；但是目前市面上高通量芯片的設(shè)計(jì)和合成幾乎均依靠國外公司，因此在實(shí)驗(yàn)成本和實(shí)驗(yàn)周期上都帶來很大的負(fù)擔(dān)。發(fā)明人基于信息分析平臺(tái)，開發(fā)了探針芯片設(shè)計(jì)流程，能夠根據(jù)項(xiàng)目需求快速的對(duì)捕獲芯片進(jìn)行設(shè)計(jì)和調(diào)整，同時(shí)依賴于芯片合成平臺(tái)，能夠自行合成國產(chǎn)芯片。因此在降低芯片成本和縮短實(shí)驗(yàn)周期上都帶來了很大的提升。實(shí)施例二為證實(shí)實(shí)驗(yàn)方法可行，發(fā)明人設(shè)計(jì)了本實(shí)施例。設(shè)計(jì)思路如下：取2個(gè)正常人血樣(取自志愿者)，一個(gè)作為供體，另一個(gè)作為受體進(jìn)行模擬。采取的血樣分離血細(xì)胞與血漿，血細(xì)胞提取基因組DNA后，打斷DNA并進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，用于基因分型；血漿提取cfDNA后，Agelint2100測定其準(zhǔn)確濃度，供受體的cfDNA按0％、0.5％、1.5％、3.5％、5.5％、8％比例混合，然后將混合的cfDNA建庫測序，用以檢測本實(shí)驗(yàn)方法的可靠性。按照上述實(shí)驗(yàn)步驟，將該實(shí)施例步驟分為兩步，1、基因組目標(biāo)區(qū)域捕獲測序；2、各混合cfDNA建庫測序。具體如下。實(shí)施例中接頭、PCR擴(kuò)增引物由Invitrogen公司合成，所使用的C0T1DNA購買于Invitrogen公司。所用試劑信息如下表所示：1、基因組目標(biāo)區(qū)域捕獲測序1)分離血漿和血細(xì)胞①抗凝管取血(5ml)后，顛倒混勻5-6次充分混勻；②水平離心機(jī)，1600g，4℃離心10min；③將上清(約1.5ml)分裝到2ml管中，下層即為血細(xì)胞；④16000g，4℃離心10min去除殘余細(xì)胞，將上清轉(zhuǎn)放新的1.5ml管中，標(biāo)記后-80℃保存。2)基因組DNA的提取取200μl分離的血細(xì)胞進(jìn)行基因組DNA提取，具體步驟參見試劑盒說明書。3)樣品打斷(Fragmentation)①在Bioruptor儀器制冷水槽中加Milli-Q的水，水面介于MAX線與MIX線之間；②開啟制冷開關(guān)并漿制冷儀的溫度設(shè)置為4℃；③當(dāng)制冷水槽的水溫達(dá)到4℃時(shí)開啟Bioruptor儀器，制冷水槽中的水會(huì)被運(yùn)送到打斷運(yùn)行槽中，并開始循環(huán)流動(dòng)；④用Nuclease-freewater或(1×TE)將1μg的gDNA稀釋到100μL，混勻后用移液器小心的轉(zhuǎn)入打斷小管中；點(diǎn)擊“set”，按下表設(shè)置參數(shù)：ON30s，OFF30s，5個(gè)Cycle；將打斷管放入打斷轉(zhuǎn)盤裝置，并放進(jìn)打斷槽中。點(diǎn)擊“run”按鈕，蓋上儀器蓋子，樣本開始 打斷；儀器停止后將樣品取出，渦旋振蕩10s混勻瞬離后冰浴3min，重復(fù)步驟④共6次；⑤取出2μL的樣品用于電泳檢測打斷效果，主帶位于150-250bp左右視為合格。4)打斷后DNA的純化(AgencourtAMPurebeads)①使用前將磁珠置于室溫下平衡30min；②將100μL打斷后的DNA轉(zhuǎn)入1.5mL的EP管中，加入1.8倍體積的磁珠(180μL)，用移液器吹打10次混勻；③室溫下靜置10min使磁珠與DNA充分結(jié)合，然后瞬時(shí)離心3秒；④將EP管放到磁力架上至液體澄清，用移液器小心的去除上清；⑤保持EP管在磁力架上，加入500μL70％的乙醇洗滌磁珠表面，以除去鹽離子以及未吸附的DNA等，除去乙醇，重復(fù)一次；⑥瞬時(shí)離心，盡量完全去除乙醇，并將磁珠置于開蓋置于磁力架上，至磁珠表面沒有光澤(約10分鐘)；⑦加入25μLElutionBuffer，輕輕將磁珠從管壁沖洗下來并吹打10次混勻；室溫靜置10min以使DNA完全從磁珠上洗脫下來；⑧將EP管放到磁力架上至液體澄清。將25μL洗脫下來的DNA轉(zhuǎn)入一個(gè)新的EP管中。5)末端修復(fù)在1.5ml的離心管中配制末端修復(fù)反應(yīng)體系：上述100μL反應(yīng)混合物輕微振蕩混合均勻,瞬時(shí)離心，在Thermomixe或水浴鍋中20℃溫浴30min。6)末端修復(fù)產(chǎn)物的純化(AgencourtAMPurebeads)加入1.8倍體積的磁珠(180μL)純化，用22μLElutionBuffer洗脫7)Adapter的連接(AdapterLigation)在1.5ml的離心管中配制Adapter連接反應(yīng)體系，體系如下表。上述100μL反應(yīng)混合物輕微振蕩混合均勻,瞬時(shí)離心后置于Thermomixer中20℃溫浴15min。8)AgencourtAMPurebeads純化連接產(chǎn)物加入1.5倍體積的磁珠(150μL)純化，用32μLElutionBuffer洗脫9)片段選擇①每個(gè)樣品稱取1.3g的瓊脂糖于65ml的1×TAE中；②點(diǎn)樣之前加入1μl上樣緩沖液再次檢查膠孔是否漏液；③使用NEB50bpDNALadder，須取出1μl與2μl上樣緩沖液充分混勻后點(diǎn)樣；④將來自步驟5.8的樣品分別至少與10μl上樣緩沖液充分混合；⑤先130使樣品跑入膠中，再100V電壓下電泳120min；⑥100ml的電泳緩沖液1×TAE，加入10μl核酸染料EB充分混勻待用；⑦電泳結(jié)束后取出凝膠，放到染膠盤中染色10min；⑧在凝膠系統(tǒng)中拍照存檔；⑨以Marker為參照，切230bp-250bp回收，再分別切210bp-230bp和250bp-270bp作為備份；⑩完成切膠后將剩下的膠塊放在保鮮膜或PE手套上，用凝膠成像系統(tǒng)中拍照并存檔。確認(rèn)一切沒有問題后可將所剩凝膠丟棄至垃圾桶中；10)片段凝膠回收(QIAquickGelExtractionKit)①往需回收的凝膠中加入6倍體積(600μl)緩沖液QG。②50℃孵育10min，期間顛倒混勻3～5次，以幫助凝膠溶解。③往步驟5.10.2的溶液中加入1倍體積(100μl)預(yù)冷的異丙醇，充分混勻。④將步驟5.10.3的溶液加入到核酸吸附柱(MinEluteSpinColumn)中，室溫靜置2min，17900g離心1min。⑤將步驟5.10.4的濾液重新加入到吸附柱中，室溫靜置2min，17900g離心1min，棄濾液。⑥往吸附柱中加入500μl緩沖液QG，17900g離心1min，棄濾液。⑦往吸附柱中加入750μl緩沖液PE，室溫靜置2～5min，17900g離心1min，棄濾液，重新17900g離心1min。⑧將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管中，環(huán)吸后室溫靜置數(shù)分鐘以晾干吸附柱中殘留的液體。⑨往核酸吸附柱的膜中間懸空加入35μl緩沖液EB，室溫靜置4min，17900g離心1.5min。11)片段濃度測定(Qubit)12)Non-Captured樣品LM-PCR在0.2mL管中配制PCR反應(yīng)體系：置于PCR儀中按照下列程序反應(yīng)：72℃20min，95℃5min，8個(gè)循環(huán)的95℃30s/58℃30s/70℃1min/72℃5min，4℃Hold。13)PCR產(chǎn)物的純化加入1.5倍體積的AgencourtAMPurebeads(150μL)純化，用32μLElutionBuffer洗脫。14)Pooling將各文庫等比例Pooling成1μg。15)雜交雜交前準(zhǔn)備①將heatblock調(diào)到95℃②將分裝好的4.5μLExomeLibrary從-20℃冰箱中拿出，放在冰上化凍。樣品的雜交①在一個(gè)1.5mL的PE管中加入：②蓋好管蓋，用干凈的50ml注射器針在分裝的EP管蓋上戳一個(gè)孔，將上述樣品文庫和block的混合物置于濃縮儀中蒸干，溫度設(shè)置為60℃；③使用新的離心管管蓋替換戳孔的管蓋，標(biāo)記，并分別加入以下兩種試劑：④將樣品震蕩混勻后置于離心機(jī)上全速離心10秒。將離心后樣品轉(zhuǎn)移至95℃heatblock中10分鐘使DNA變性；⑤將樣品取出，震蕩混勻后室溫條件下全速離心10秒；⑥將上述雜交混合物轉(zhuǎn)入分裝好的4.5μLExomeLibrary中；⑦震蕩混勻后置于離心機(jī)上全速離心10秒；⑧放在PCR儀上57℃雜交64h，PCR儀熱蓋應(yīng)設(shè)置保持在105℃；16)捕獲序列的洗滌和洗脫準(zhǔn)備鏈霉素磁珠①提前從冰箱中拿出鏈霉素磁珠，vortex磁珠1min，使其充分混勻；②在1.5mL的EP管中加入100μL磁珠(1個(gè)樣品)；③將EP管置于磁力架上至液體澄清，用移液器小心的去除上清；④保持EP管在磁力架上，加入200μL(2倍體積)的StreptavidinDynabeadBindingandWashBuffer；⑤從磁力架上取下EP管，vortex10s混勻，將EP管重新放回磁力架至液體澄清，用移液器小心的去除上清，用移液器小心的去除上清，重復(fù)洗兩次；⑥用100μL的StreptavidinDynabeadBindingandWashBuffer懸浮磁珠，并將其轉(zhuǎn)入0.2mL的小管中；⑦用磁力架結(jié)合磁珠，直到液體澄清，用移液器小心的去除上清，現(xiàn)在磁珠可以用來結(jié)合捕獲的DNA了。將捕獲到的DNA結(jié)合到鏈霉素磁珠上；①將雜交混合物吸出來(記錄雜交后剩余體積)加到5.2準(zhǔn)備好的磁珠中；②用移液器吹打10次混勻。③將小管放在PCR儀上57℃孵育45min(PCR儀熱蓋應(yīng)設(shè)置保持在105℃,每隔10min拿出來vortex3s以防止磁珠沉淀。結(jié)合了捕獲DNA的鏈霉素磁珠的洗滌①孵育45min后，將混合物從0.2mL的小管中轉(zhuǎn)入1.5mL的EP管中，將EP管置于磁力架上至液體澄清，用移液器小心的去除上清。②加100μL預(yù)熱到57℃的1XWashBufferI，vortex10s混勻，將EP管置于磁力架上至液體澄清，用移液器小心的去除上清。③從磁力架上取下EP管，加入200μL預(yù)熱到47℃的1XStringentWashBuffer，用移液器吹打10次混勻。57℃孵育5min，將EP管置于磁力架上至液體澄清，用移液器小心的去除上清。重復(fù)本次操作兩次，即總共用1XStringentWashBuffer洗三次；④加200μL室溫下放置的1XWashBufferI(不用47℃預(yù)熱的)，vortex2min混勻，如果液體濺到管蓋上，用手指輕彈EP管使其集中到管低。將EP管置于磁力架上至液體澄清，用移液器小心的去除上清；⑤加200μL室溫下放置的1XWashBufferII，vortex1min混勻。將EP管置于磁力架上至液體澄清，用移液器小心的去除上清。⑥加200μL室溫下放置的1XWashBufferIII，vortex30s混勻。將EP管置于磁力架上至液體澄清，用移液器小心的去除上清。⑦從磁力架上取下EP管，加入30μLUltraPureWater。17)Captured樣品LM-PCRLM-PCR在1.5mL管中為每個(gè)樣品按下表配制PCR反應(yīng)體系：置于PCR儀中按照下列程序反應(yīng)。95℃5min、12個(gè)循環(huán)的95℃15s/58℃15s/70℃1min、72℃2min、4℃Hold。PCR產(chǎn)物的純化(AgencourtAMPurebeads)①將PCR混合物(100μL)轉(zhuǎn)入1個(gè)1.5mL的EP管中，將EP管放到磁力架上至液體澄清，將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的EP管中，棄鏈霉素磁珠。②上清中加入1.5倍體積的磁珠(150μL)進(jìn)行純化，用52μLElutionBuffer洗脫；PCR產(chǎn)物的再次純化(AgencourtAMPurebeads)加入1.5倍體積的磁珠(75μL)進(jìn)行純化，用32μLElutionBuffer洗脫；18)文庫檢測使用Agilent2100Bioanalyzer檢測文庫產(chǎn)量。2、各混合cfDNA建庫測序1)cfDNA提取取200μl血漿到2ml的離心管中，加緩沖液GA到100μl終體積。②加入20μlProteinaseK溶液，渦旋混勻。③加入200μl的緩沖液GB，輕輕顛倒混勻，56℃孵育10min，并不時(shí)搖動(dòng)樣品。簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。④加入200μl的無水乙醇。如果室溫超過25℃，請(qǐng)將乙醇置冰上預(yù)冷。輕輕顛倒混勻樣品，室溫放置5min，簡短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴。⑤將上一步所得溶液添加到一個(gè)吸附柱CR2中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CR2放回收集管中。⑥向吸附柱CR2中加入500μl緩沖液GD，12,000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CR2放回收集管中。⑦向吸附柱CR2中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CR2放回收集管中。⑧重復(fù)操作步驟⑦。⑨12,000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱CR2置于室溫放置2-5min，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。⑩將吸附柱CR2轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20-50μl洗脫緩沖液TB，室溫放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)離心2min，將溶液收集到離心管中。2)QubitHS測定核酸濃度(2100檢測)3)末端修復(fù)與純化①按照下列的配比準(zhǔn)備反應(yīng)混合物：在Thermomixer中20℃，反應(yīng)30min。②磁珠純化加入1.8倍體積的磁珠(90μL)進(jìn)行純化，用24μLElutionBuffer洗脫；4)DNAAdaptor連接與連接產(chǎn)物純化①按照下列的配比準(zhǔn)備反應(yīng)混合物在Thermomixer中，20℃反應(yīng)20min。④磁珠純化加入1.2倍體積的磁珠(84μL)進(jìn)行純化，用32μLElutionBuffer洗脫；⑤Qubit測定核酸濃度5)PCR反應(yīng)與純化①PCR體系和反應(yīng)條件，擴(kuò)增體系：反應(yīng)程序：72℃20min、95℃5min、15個(gè)循環(huán)的95℃30s/60℃30s/70℃30s/70℃5min、12℃∞。②PCR產(chǎn)物的磁珠純化加入1倍體積的磁珠(100μL)進(jìn)行純化，用32μLElutionBuffer洗脫。③Qubit測定核酸濃度。3、結(jié)果評(píng)價(jià)和分析發(fā)明人抽取兩個(gè)自愿者的血液樣本，一個(gè)做為供體(15ml血液)，另一個(gè)做為受體(25ml血液)，分離血漿和血細(xì)胞后，供體得到6.6ml血漿，7.5ml血細(xì)胞，受體得到11.4ml血漿，12ml血細(xì)胞。得到的樣本用于實(shí)驗(yàn)?；蚪MDNA的差異SNP位點(diǎn)確定的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1)基因組DNA提取取200μl分離的血細(xì)胞用于提取DNA，用Qubit進(jìn)行核酸濃度檢測，提取的結(jié)果如表1所示，結(jié)果顯示提取正常中，可用于下步實(shí)驗(yàn)。表1兩志愿者的基因組DNA提取結(jié)果2)打斷、加接頭及膠回收各取1μg基因組DNA超聲波打斷后，加接頭并用瓊脂糖電泳進(jìn)行DNA片段大小選擇，我們切取230-250bp和250-270bp大小的片段，其中一份作為備份，膠回收核酸濃度(Qubit檢測)如表2所示，膠回收的核酸總量達(dá)到雜交捕獲的要求，可進(jìn)行下步實(shí)驗(yàn)。表2打斷后片段選擇結(jié)果3)PCR后進(jìn)行液態(tài)芯片雜交捕獲進(jìn)行一個(gè)PCR擴(kuò)增后，各取500ng(共1μg)進(jìn)行雜交捕獲：4)出庫濃度目地序列雜交捕獲下來，洗脫，進(jìn)行PCR擴(kuò)增后即可進(jìn)行下一步的測序上機(jī)，出庫濃度如下表3所示，出庫濃度符合5.7M芯片雜交正常水平，2100結(jié)果正常，可用于測序分析。表3基因組DNA雜交出庫結(jié)果血漿cfDNA全基因組檢測結(jié)果發(fā)明人人工模擬了0％、0.5％、1.5％、3.5％、5.5％、8％供體比例的實(shí)驗(yàn)，即把兩個(gè)正常人的血漿cfDNA樣本按上述比例混合在一起，然后用高通量測序進(jìn)行檢測。1)血漿提取cfDNA的提取供體用6.6ml血漿進(jìn)行提取，受體用11.4ml血漿進(jìn)行提取，得到的結(jié)果為表4所示，正常人的血漿cfDNA濃度較低，結(jié)果顯示提取正常，總量能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。表4血漿cfDNA提取結(jié)果2)按模擬濃度比例混合cfDNA按我們?cè)O(shè)計(jì)的模擬濃度0％、0.5％、1.5％、3.5％、5.5％、8％進(jìn)行混合，具體操作如下：3)出庫濃度混合好的血漿cfDNA，末端修復(fù)后，加上不同的接頭，進(jìn)行一個(gè)PCR擴(kuò)增后，出庫濃度如表5所示，出庫結(jié)果正常，可用于下步測序分析。表5血漿建庫結(jié)果結(jié)果分析與畫圖上述的文庫用BGISEQ-100測序平臺(tái)進(jìn)行測序，得到的數(shù)據(jù)通過生物信息學(xué)分析，得了各個(gè)點(diǎn)的供受體cfDNA比值，畫成線性圖后，校正供體比例與真實(shí)供體比例關(guān)系如圖5所示，橫坐標(biāo)表示真實(shí)供體比例，縱坐標(biāo)表示校正供體比例，可以看出，其符合線性規(guī)律(R2＝0.9917)，證明我們的確定差異SNP的方法的靈敏度是足夠應(yīng)用于監(jiān)測器官移植免疫 排斥的。實(shí)施例三獲得測序數(shù)據(jù)后，數(shù)據(jù)分析方法流程如圖6所示，一般包括以下步驟：1.與參考基因組比對(duì)。對(duì)BGISEQ-100有效測序數(shù)據(jù)使用tmap工具比對(duì)到參考基因組上，得到精確的比對(duì)結(jié)果。其中tmap工具源自：https://github.com/iontorrent/TS/tree/master/Analysis/TMAP。2.比對(duì)結(jié)果去除PCR重復(fù)片段。對(duì)tmap工具比對(duì)后的結(jié)果(bam格式)使用BamDuplicates工具去除PCR重復(fù)片段。其中，BamDuplicates工具來自IonTorrentSystems公司。3.統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量控制。統(tǒng)計(jì)目標(biāo)區(qū)域數(shù)據(jù)量占總數(shù)據(jù)量的比例、目標(biāo)區(qū)域的平均測序深度、目標(biāo)區(qū)域的覆蓋率等，生成一系列質(zhì)控指標(biāo)用于判斷測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量情況。前3步對(duì)目標(biāo)區(qū)域捕獲測序及血漿樣本均適用。對(duì)于血漿樣本，在第2步去重后，還需去掉多比對(duì)的reads，只獲取唯一比對(duì)的reads。4.供受體樣本基因分型使用TVC工具(默認(rèn)參數(shù)targetseq_germline_lowstringency_p1_parameters.json文件)(參考：http://ioncommunity.lifetechnologies.com/community/products/torrent-variant-caller)分別檢測供受體的生殖系SNP(GermlineSNP)，得到部分基因分型位點(diǎn)。對(duì)TVC工具無法分型的位點(diǎn),通過頻率(讀段支持頻率)來分型，最大化基因分型位點(diǎn)。頻率分型的具體操作步驟為：(1)對(duì)供受體去重后的數(shù)據(jù)分別進(jìn)行累積排序(pileup)，可利用工具samtools進(jìn)行[LiH,HandsakerB,WysokerA.,etal.1000GenomeProjectDataProcessingSubgroup(2009)TheSequencealignment/map(SAM)formatandSAMtools.Bioinformatics,25,2078-9.[PMID:19505943]。該工具官網(wǎng)地址：http://samtools.sourceforge.net/index.shtml，對(duì)pileup結(jié)果進(jìn)行每個(gè)位點(diǎn)ACTG堿基的reads支持?jǐn)?shù)統(tǒng)計(jì)。(2)統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)的基因型。對(duì)讀段支持頻率>95％的位點(diǎn)定義為純合子，頻率在25％(包含25％)至95％(包含95％)間的位點(diǎn)定義為雜合子。對(duì)于有多種基因型的雜合子，取最大頻率的堿基作為該SNP的組成堿基。5.獲取診斷位點(diǎn)、控制位點(diǎn)獲取可區(qū)分供受體的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)即受體為純合子且供體為雜合子或與受體不同基因型的純合子，作為診斷位點(diǎn)。診斷位點(diǎn)包括以下4種情況，見以下表6，其 中，B表示可區(qū)分供受體的供體SNP的組成堿基。表6受體基因型受體基因型標(biāo)簽供體基因型供體基因型標(biāo)簽0/0(與參考序列堿基一致的純合子)AA1/1BB0/0(與參考序列堿基一致純合子)AA0/1AB1/1(與參考序列堿基不同的純合子)BB0/0AA1/1(與參考序列堿基不同的純合子)BB0/1AB獲取控制位點(diǎn)即供受體均為基因型相同的純合子，用來評(píng)估比對(duì)錯(cuò)誤及校正供體比例。包括以下2種情況，見下表，表7。表7受體基因型受體基因型標(biāo)簽供體基因型供體基因型標(biāo)簽0/0AA0/0AA1/1BB1/1BB6.計(jì)算供體比例對(duì)去重且唯一比對(duì)(比對(duì)到參考序列唯一位置)的血漿數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)診斷位點(diǎn)中來自供體或受體的reads(讀段)，通過加權(quán)公式，計(jì)算供體比例，模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加權(quán)公式計(jì)算的供體比例值與真實(shí)供體含量呈準(zhǔn)確線性關(guān)系(＝0.9917)，通過線性關(guān)系進(jìn)一步評(píng)估真實(shí)供體含量。主要包含兩部分：(1)校正供體比例(供體cfDNA比例)計(jì)算校正供體比例是指已經(jīng)評(píng)估過比對(duì)和/或測序錯(cuò)誤的供體比例。先計(jì)算供體cfDNA比例及比對(duì)錯(cuò)誤。以下將受體中cfdDNA比例簡稱為供體比例。A.供體比例＝供體來源的reads數(shù)/(供體+受體)來源reads數(shù)，具體加權(quán)公式如下：其中，N表示reads數(shù)，NAB(B)表示受體純合供體雜合的診斷位點(diǎn)中來自供體的reads，NBB(B)表示受體純合供體純合且與受體不同基因型診斷位點(diǎn)中來自供體的reads，同理，NAB(A)和NBB(A)及表示診斷位點(diǎn)中來自受體的reads。B.對(duì)無法區(qū)分供受體的位點(diǎn)即受體純合供體純合且基因型相同的位點(diǎn)，將其作為控制位點(diǎn)，可以評(píng)估比對(duì)和/或測序錯(cuò)誤，公式如下：其中，N表示reads數(shù)，NCC(C)表示控制位點(diǎn)中正確reads數(shù)，NCC(error)表示控制位點(diǎn)中錯(cuò)誤reads數(shù)。C.校正供體比例為供體比例與比對(duì)和/或測序錯(cuò)誤的差，即校正供體比例＝供體比例- 比對(duì)和/或測序錯(cuò)誤。(2)與真實(shí)cfdDNA的線性擬合我們模擬了0％、0.5％、1.5％、3.5％、5.5％、8％供體比例的實(shí)驗(yàn)，計(jì)算出真實(shí)cfdDNA含量與校正供體比例間的線性擬合關(guān)系(r＝0.9917)。真實(shí)cfdDNA含量＝(校正供體比例-0.8986)/0.7515。使用不同大小的捕獲芯片，具體的線性系數(shù)有所不同。利用程序語言，將上述該示例提供的基于BGISEQ-100測序平臺(tái)的器官移植無創(chuàng)排斥監(jiān)測方法編碼成一軟件包，具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.該軟件包程序化本發(fā)明的全面、有效的基因分型算法。包括使用TVC等一般工具對(duì)供受體進(jìn)行基因分型，對(duì)一般工具無法分型的位點(diǎn),通過讀段支持頻率(即各堿基的頻率)來分型，最大化基因分型位點(diǎn)。對(duì)于目標(biāo)區(qū)域捕獲測序來說，為使測序成本在合理范圍內(nèi),捕獲的SNP位點(diǎn)數(shù)較少，但使用此基因分型算法，可以獲取最多的診斷位點(diǎn)。2.檢測值準(zhǔn)確反映真實(shí)供體含量。模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)加權(quán)公式計(jì)算所得校正供體比值與真實(shí)供體含量呈準(zhǔn)確線性關(guān)系(＝0.9917)，通過線性關(guān)系細(xì)化檢測供體比例，使其盡可能接近真實(shí)供體含量。3.靈活、一體化的軟件包實(shí)現(xiàn)，可移植性強(qiáng)，可獨(dú)立部署、高效運(yùn)行。4.低創(chuàng)或無創(chuàng)的檢測、可接受的成本、直觀的數(shù)字化結(jié)果展示，可作為一種便捷、早期、無創(chuàng)、準(zhǔn)確的移植排斥監(jiān)測技術(shù)，可作為臨床免疫排斥檢測的輔助或補(bǔ)充手段。實(shí)施例四選擇正常供體(樣品名D)及受體(樣品名R)的血細(xì)胞樣品進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲測序，對(duì)混合了供體DNA的受體血漿進(jìn)行全基因組測序，混合比例分別為0％、0.5％、1.5％、3.5％、5.5％、8％，對(duì)測序有效數(shù)據(jù)通過tmap比對(duì)、BamDuplicates去重、質(zhì)量控制(QC)、供受體基因分型、獲取診斷位點(diǎn)及控制位點(diǎn)、供體比例計(jì)算，最終獲得模擬實(shí)驗(yàn)的供體含量檢測報(bào)告，以評(píng)估器官移植排斥程度。本檢測系統(tǒng)各部流程方法都已整合到軟件Donor_Fraction_Calculation_main中，本軟件的運(yùn)行環(huán)境為Unix/Linux操作系統(tǒng)，通過Unix/Linux命令行運(yùn)行。1、具體操作步驟如下：在LINUX操作系統(tǒng)計(jì)算機(jī)終端中輸入以下命令：perlDonor_Fraction_Calculation_main.pl-d-llist-oresultDonor_Fraction_Calculation_main命令行參數(shù)見表8參數(shù)說明。表8參數(shù)說明一個(gè)完整的list表舉例如下：>RDreceptor1.bamdonor2.bam03.bam0.54.bam1.55.bam3.56.bam5.57.bam88.bam該list表示名為RD(受體供體)的模擬實(shí)驗(yàn)，需檢測混合了供體DNA比例分別為0％、0.5％、1.5％、3.5％、5.5％、8％采樣點(diǎn)文庫的供體比例。2、分析結(jié)果表9顯示統(tǒng)計(jì)及質(zhì)量控制分析的部分節(jié)選結(jié)果。表9以下表10顯示供體cfDNA比例的部分結(jié)果節(jié)選。表10續(xù)：續(xù)：續(xù)：續(xù)：從模擬實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加權(quán)公式計(jì)算的校正供體比例值與真實(shí)供體含量呈準(zhǔn)確線性關(guān)系(＝0.9917)，具體線性關(guān)系見圖5。在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個(gè)實(shí)施例”、“一些實(shí)施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實(shí)施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)包含于本發(fā)明的至少一個(gè)實(shí)施例或示例中。在本說明書中，對(duì)上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實(shí)施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點(diǎn)可以在任何的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例或示例中以合適的方式結(jié)合。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā) 明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。當(dāng)前第1頁1 2 3