本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)引物的設(shè)計(jì)方法及其應(yīng)用，所述方法是一種既可以在特定基因或區(qū)域，也可以在全基因組范圍內(nèi)設(shè)計(jì)出具有通用性和特異性的核酸擴(kuò)增反應(yīng)引物的方法。

背景技術(shù)：

核酸擴(kuò)增技術(shù)已成為當(dāng)前分子生物學(xué)研究和應(yīng)用中使用最多、最廣泛的手段之一，核酸擴(kuò)增的目的在于針對(duì)目標(biāo)序列，利用引物組擴(kuò)增一段不含任何副產(chǎn)物(非特異性DNA)的特異DNA片段，因此引物設(shè)計(jì)是核酸擴(kuò)增技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)?；诤怂釘U(kuò)增技術(shù)的目的，擴(kuò)增反應(yīng)的引物組首先需要具備特異性，即該引物組不能擴(kuò)增非目標(biāo)序列；為了提高效率，有時(shí)同時(shí)需要引物組具有通用性，即引物組可以應(yīng)用于多個(gè)目標(biāo)序列(多個(gè)目標(biāo)基因或區(qū)域，或多個(gè)目標(biāo)基因組)。

目前常用的引物設(shè)計(jì)軟件一般只能在預(yù)先設(shè)定的一個(gè)基因區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)引物，也就是說，用戶必須首先尋找到具有特異性和通用性的序列(通常的做法是，從文獻(xiàn)中獲取物種特異性基因，并根據(jù)其保守的范圍確定其通用性)，然后將其輸入引物設(shè)計(jì)軟件如Primer、PrimerExplorer V4等。然而，從文獻(xiàn)中獲得的所謂“物種特異性基因”往往基于滯后的知識(shí)，并未基于不斷增長的基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行必要的更新，導(dǎo)致基于該基因序列獲得的引物在實(shí)際應(yīng)用中不一定能確保其特異性和通用性，導(dǎo)致傳統(tǒng)方法引物設(shè)計(jì)的成功率偏低。表1舉例展示了現(xiàn)有技術(shù)阪崎克羅諾桿菌檢測方法中存在的引物特異性不夠的問題。也就是說，現(xiàn)有技術(shù)方法中所使用的阪崎克羅諾桿菌特異序列實(shí)際上并非阪崎克羅諾桿菌所特有，即，有可能將非阪崎克羅諾桿菌錯(cuò)誤地認(rèn)定為阪崎克羅諾桿菌。出現(xiàn)這類問題的原因之一是未利用現(xiàn)有基因組數(shù)據(jù)庫中對(duì)設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行包括諸如特異性檢測和判定等的有效性檢驗(yàn)。類似的問題同樣也存在于通用性的確認(rèn)。

表1阪崎克羅諾桿菌的現(xiàn)有檢測方法中引物的特異性分析

注：a)將專利中引物F3和B3間的序列與阪崎克羅諾桿菌的三個(gè)基因組(GI號(hào)分別為156932229、449306535和389839000)進(jìn)行Bowtie比對(duì)，確定檢測區(qū)域在GI號(hào)156932229基因組中的位置(星號(hào)*表示引物F3和B3間的序列可比對(duì)到GI號(hào)156932229基因組中的7個(gè)重復(fù)區(qū)域，本表中僅列出1個(gè)區(qū)域)。專利CN201310287426.5中四套引物的擴(kuò)增區(qū)域無法定位，文本中也沒有給出擴(kuò)增靶基因?yàn)楹畏N基因。b)將檢測區(qū)域序列在公共數(shù)據(jù)庫資源中進(jìn)行Blast比對(duì)，引物區(qū)域匹配程度越高，特異性越差。

因此，亟需一種新的方法，不但可以在特定基因或區(qū)域，而且可以在全基因組范圍內(nèi)高效率地設(shè)計(jì)出具有通用性和特異性的引物，滿足檢測、擴(kuò)增等對(duì)確保具有特異性和通用性的引物的需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明創(chuàng)新提出了一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)引物的設(shè)計(jì)方法。該方法既可以針對(duì)特定基因或區(qū)域的序列，也可以針對(duì)全基因組序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。該方法設(shè)計(jì)得到的引物能夠同時(shí)通過物理化學(xué)性質(zhì)檢測和通用性、特異性檢測。本發(fā)明方法得到的引物可以擴(kuò)增多個(gè)目標(biāo)序列(包括含多個(gè)目標(biāo)基因、多個(gè)目標(biāo)區(qū)域、或多個(gè)目標(biāo)基因組)；同時(shí)，得到的引物無法擴(kuò)增非目標(biāo)序列。本方法充分利用了公共資源中的基因組學(xué)數(shù)據(jù)，并采納恰當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)分析方法和工具，能夠在目標(biāo)序列(包括目標(biāo)基因、目標(biāo)區(qū)域、或目標(biāo)基因組)上高效率地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，獲得具有通用性和特異性的引物，其可靠性超過傳統(tǒng)的僅針對(duì)特定基因序列的引物設(shè)計(jì)方法， 本發(fā)明確保了所獲得的針對(duì)該目標(biāo)序列的引物的特異性和通用性。

本發(fā)明提出一種新的核酸擴(kuò)增反應(yīng)引物設(shè)計(jì)方法，該方法可以在特定的目標(biāo)基因或區(qū)域、或者目標(biāo)全基因組范圍內(nèi)設(shè)計(jì)出滿足通用性和特異性的引物，能夠廣泛地應(yīng)用于PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、等溫?cái)U(kuò)增(如LAMP等)、以及其它核酸擴(kuò)增反應(yīng)類型所需要引物的設(shè)計(jì)。

本發(fā)明提出的核酸擴(kuò)增反應(yīng)引物的設(shè)計(jì)方法，包括：(1)確定引物的目標(biāo)序列和非目標(biāo)序列；(2)針對(duì)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)單條引物；(3)引物序列比對(duì)；(4)根據(jù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的類型及其對(duì)引物組合方式的要求，將單條引物組合成引物組；(5)對(duì)引物組進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)、通用性以及特異性檢測和判定；(5)輸出符合條件的引物組。

本發(fā)明核酸擴(kuò)增反應(yīng)引物的設(shè)計(jì)方法，包括以下步驟：

(1)初始化：將由引物的所有目標(biāo)序列組成的集合定義為集合G_1，將由引物的所有非目標(biāo)序列組成的集合定義為集合G_2；

(2)設(shè)計(jì)單條引物：根據(jù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的類型，設(shè)定描述引物特性的各項(xiàng)參數(shù)，以集合G_1中的某一目標(biāo)序列為引物設(shè)計(jì)的候選序列，計(jì)算得出符合條件的單條引物，并記錄每條引物的信息；

(3)引物序列比對(duì)：將設(shè)計(jì)出的單條引物分別與集合G_1和集合G_2進(jìn)行序列比對(duì)，記錄比對(duì)信息；

(4)單條引物組合：根據(jù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的類型及其對(duì)引物組合方式的要求，將單條引物組合成引物組；

(5)引物的檢測：對(duì)引物組進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)、通用性以及特異性檢測和判定；

(6)輸出符合條件的引物組，即得到所述核酸擴(kuò)增反應(yīng)的引物。

其中，步驟(1)中，所述集合G_1是由引物的所有目標(biāo)序列組成,所述集合G_2是由引物的所有非目標(biāo)序列組成。

所述目標(biāo)序列是指引物設(shè)計(jì)的目標(biāo)基因或目標(biāo)區(qū)域、或目標(biāo)基因組序列。

所述非目標(biāo)序列是指除目標(biāo)基因或目標(biāo)區(qū)域之外的序列、或除目標(biāo)基因組之外的其它基因組序列。

在具體實(shí)施方案中，當(dāng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的檢測對(duì)象為特定某物種時(shí)，目標(biāo)序列 可以是待測物種全基因組，非目標(biāo)序列則是其它物種或其它相關(guān)物種的基因組。

在具體實(shí)施方案中，當(dāng)核酸擴(kuò)增反應(yīng)目標(biāo)為特定基因或區(qū)域時(shí)，目標(biāo)序列為待測基因或區(qū)域的DNA序列。根據(jù)實(shí)施方案對(duì)特異性的不同要求，非目標(biāo)序列可以是該目標(biāo)序列之外的其它任意所有序列，也可以是所在基因組中除目標(biāo)序列之外的其它序列。

例如，當(dāng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑闄z測混合的微生物基因組中是否存在某種特定微生物X，目標(biāo)序列是X微生物的各菌株基因組序列，而非目標(biāo)序列是除X微生物之外的其它微生物基因組序列。例如，當(dāng)實(shí)驗(yàn)?zāi)康臑樵O(shè)計(jì)恰當(dāng)?shù)囊镆詳U(kuò)增出小鼠、大鼠和人的某一基因序列X，則目標(biāo)序列是小鼠X基因、大鼠X基因和人X基因，非目標(biāo)序列是小鼠基因組中除X基因之外的其它序列，大鼠基因組中除X基因之外的其它序列，和人基因組中除X基因之外的其它序列。

其中，步驟(2)中，所述根據(jù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的類型，是指引物的應(yīng)用范圍，可以為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，實(shí)時(shí)定量PCR，也可以為等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)等，以及其它核酸擴(kuò)增反應(yīng)類型。所述“描述引物特性的各項(xiàng)參數(shù)”，包含但不限于引物的長度、GC含量、Tm值、3’端穩(wěn)定性、5’端穩(wěn)定性和/或二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性等物理化學(xué)性質(zhì)，在具體實(shí)施方案中根據(jù)實(shí)際情況確定適當(dāng)?shù)囊豁?xiàng)或多項(xiàng)參數(shù)的組合。所述“記錄每條引物的信息”，是指記錄包括引物在所述特定目標(biāo)序列中的位置、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)和/或引物的長度等信息，在具體實(shí)施方案中根據(jù)實(shí)際情況確定適當(dāng)?shù)囊豁?xiàng)或多項(xiàng)參數(shù)的組合。

其中，步驟(3)中，所述序列比對(duì)，可以使用Bowtie、Bowtie2、BWA、SOAP等短序列快速比對(duì)軟件，也可以為Blast、Blat等長序列比對(duì)軟件，優(yōu)選地，為Bowtie、Bowtie2、BWA、SOAP等快速比對(duì)軟件。所述“記錄比對(duì)信息”，是指每條引物在集合G_1和集合G_2中每個(gè)序列上面的位置、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)等信息。

其中，步驟(4)中，所述根據(jù)核酸擴(kuò)增反應(yīng)的類型，是指引物的應(yīng)用范圍，可以為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，實(shí)時(shí)定量PCR、也可以為等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)等，以及其它核酸擴(kuò)增反應(yīng)類型。所述對(duì)引物組合方式的要求，是指單條引物在所述特定目 標(biāo)序列上的位置、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)，以及單條引物間的距離等。

其中，步驟(5)中，所述對(duì)引物組進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)檢測，是指檢測各條引物在每個(gè)序列上的位置關(guān)系與正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)、引物的GC含量與擴(kuò)增區(qū)域的GC含量的關(guān)系、引物的Tm值與擴(kuò)增區(qū)域的Tm值的關(guān)系、引物之間是否發(fā)生相互作用等。所述通用性檢測和判定，是指檢測該引物組能否根據(jù)檢測需求應(yīng)用在G_1集合中的多個(gè)目標(biāo)序列，若符合檢測需求，則通用性檢測結(jié)果為“通過”；若不符合檢測需求，則通用性檢測結(jié)果為“未通過”。所述特異性檢測和判定，是指檢測該引物組能否用于集合G_2中的任意一個(gè)非目標(biāo)序列，若不能用于集合G_2中的任意一個(gè)非目標(biāo)序列，則特異性檢測結(jié)果為“通過”，若能用于集合G_2中的一個(gè)或多個(gè)非目標(biāo)序列，則特異性檢測結(jié)果為“未通過”。若未通過上述物理化學(xué)性質(zhì)、通用性及特異性三項(xiàng)檢測的，則放棄該引物組，繼續(xù)篩選合適的引物組。

其中，步驟(6)中，所述輸出符合條件的引物組，是指輸出前步驟中獲得的能夠同時(shí)通過物理化學(xué)性質(zhì)檢測、通用性和特異性檢測的引物組中每一條引物的位置、長度、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)、以及該引物組的通用性情況(即可以用于哪些目標(biāo)序列上)等信息。系統(tǒng)將符合條件的引物組按照通用性程度排序，通用性越強(qiáng)，排名越靠前，系統(tǒng)按此順序輸出符合條件的引物組。其中，引物組的數(shù)量可預(yù)先設(shè)定。

本發(fā)明還提出了按上述方法設(shè)計(jì)得到的引物，所述引物包括引物組，所述引物組為：

F3：5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’(SEQ ID NO：1)

FIP：5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA(SEQ ID NO：2)

BIP：5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’(SEQ ID NO：3)

B3：5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’(SEQ ID NO：4)。

本發(fā)明還提出了按上述方法設(shè)計(jì)得到的引物，所述引物包括引物組，所述引物組為：

P1：5’-GGAGCCTGCTCAGTCTGTT-3’(SEQ ID NO：5)

P2：5’-TAACTGGGCCAAGGAAGGT-3’(SEQ ID NO：6)。

本發(fā)明還提出了按上述方法設(shè)計(jì)得到的引物，所述引物包括引物組，所述引物組為：

P3：5’-GACTCACGAAAGCCAGCTG-3’(SEQ ID NO：7)

P4：5’-AGTCAGCACGCCATACCA-3’(SEQ ID NO：8)

本發(fā)明還提出了將上述引物設(shè)計(jì)方法或引物分別在阪崎克羅諾桿菌和志賀氏菌相關(guān)基因(或區(qū)域)的擴(kuò)增或檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明方法充分運(yùn)用了基因組學(xué)數(shù)據(jù)以及相關(guān)方法、工具，能夠在目標(biāo)序列，(可以是特定基因或區(qū)域、也可以是全基因組)上高效率地進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，獲得具有高通用性和高特異性的引物，其可靠性超過傳統(tǒng)的僅針對(duì)特定基因序列的引物設(shè)計(jì)方法。本發(fā)明可以廣泛應(yīng)用于PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、等溫?cái)U(kuò)增，包括LAMP，以及其它核酸擴(kuò)增反應(yīng)類型中的引物設(shè)計(jì)。

附圖說明

圖1本發(fā)明引物設(shè)計(jì)方法的流程圖。

圖2實(shí)施例1的阪崎克羅諾桿菌LAMP引物的位置及正負(fù)鏈關(guān)系示意圖。

圖3利用實(shí)施例1設(shè)計(jì)的阪崎克羅諾桿菌LAMP引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)后產(chǎn)物的電泳圖。

圖4實(shí)施例2的志賀氏菌PCR引物的位置、正負(fù)鏈關(guān)系示意圖。

圖5利用實(shí)施例2的志賀氏菌PCR引物進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)后產(chǎn)物的電泳圖。

具體實(shí)施方式

結(jié)合以下具體實(shí)施例和附圖，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，本發(fā)明的保護(hù)內(nèi)容不局限于以下實(shí)施例。在不背離發(fā)明構(gòu)思的精神和范圍下，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠想到的變化和優(yōu)點(diǎn)都被包括在本發(fā)明中，并且以所附的權(quán)利要求書為保護(hù)范圍。實(shí)施本發(fā)明的過程、條件、試劑、實(shí)驗(yàn)方法等，除以下專門提及的內(nèi)容之外，均為本領(lǐng)域的普遍知識(shí)和公知常識(shí)，本發(fā)明沒有特別限制內(nèi)容。

實(shí)施例1阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)檢測用LAMP引物的設(shè)計(jì)

LAMP是榮研化學(xué)株式會(huì)社研發(fā)的核酸擴(kuò)增方法，LAMP引物一般由來自基因組6個(gè)不同位置(分別為F3、F2、F1c、B1c、B2和B3)序列的4條單獨(dú)的 引物(F3，B3，F(xiàn)2和F1c組成的FIP，B2和B1c組成的BIP)組成。

本發(fā)明針對(duì)阪崎克羅諾桿菌設(shè)計(jì)具有通用性和特異性的LAMP引物的方法，包括如下步驟：

(1)初始化：

使用2013年8月5號(hào)從NCBI的FTP上下載的有完整基因組序列的所有細(xì)菌和古菌的數(shù)據(jù)，共2,599個(gè)全基因組序列。設(shè)定集合G_1，其包含目標(biāo)基因組序列(即，阪崎克羅諾桿菌的3個(gè)全基因組序列)，其GI號(hào)分別為156932229、449306535和389839000，所設(shè)計(jì)引物應(yīng)當(dāng)能夠檢測出對(duì)應(yīng)的3株阪崎克羅諾桿菌，即具有通用性；設(shè)定集合G_2，其包含非目標(biāo)基因組序列(即，除阪崎克羅諾桿菌的前述3個(gè)目標(biāo)基因組序列之外的2596個(gè)全基因組序列)，所設(shè)計(jì)的引物應(yīng)當(dāng)不能夠檢測到除阪崎克羅諾桿菌之外的細(xì)菌和古細(xì)菌，即，具有特異性。

(2)設(shè)計(jì)單條引物：

根據(jù)LAMP引物的特性及本發(fā)明的需求，設(shè)定引物的GC含量、Tm值、3’端穩(wěn)定性、5’端穩(wěn)定性(見表2)及引物長度(18～25bp)等特性參數(shù)，同時(shí)設(shè)定單條引物不能產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)、自身不能發(fā)生相互作用等條件，以GI號(hào)為156932229的阪崎克羅諾桿菌ATCC BAA-894的全基因組序列作為單條引物設(shè)計(jì)的候選序列，計(jì)算得出符合上述設(shè)定條件的單條引物。并記錄每條引物在156932229基因組序列上的位置、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)以及引物的長度等信息。

表2 LAMP反應(yīng)中單條引物的特性要求

(3)引物序列比對(duì)：

使用比對(duì)軟件Bowtie，將上一步設(shè)計(jì)出的單條引物分別與集合G_1中的所 有目標(biāo)基因組和集合G_2中的所有非目標(biāo)基因組進(jìn)行序列比對(duì)。為了確保獲得的引物的通用性，當(dāng)該單條引物與集合G_1中的目標(biāo)序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，使用參數(shù)設(shè)置“-a -n 0”，即要求該單條引物與所有目標(biāo)序列完全匹配。為了確保獲得的引物的特異性，當(dāng)該單條引物與集合G_2中的非目標(biāo)序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，使用參數(shù)“-a -n 3”，即，該單條引物與所有非目標(biāo)序列不超過3個(gè)錯(cuò)配。比對(duì)結(jié)束后，獲得符合上述比對(duì)條件的單條引物，并記錄每條引物在集合G_1和集合G_2中的每個(gè)基因組上的位置、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)等信息。

(4)單條引物組合：

從上述步驟中產(chǎn)生的候選的單條引物F3、F2、F1c、B1c、B2和B3，按照?qǐng)D2中的條件設(shè)定這六條單條引物之間的位置以及在正負(fù)鏈上的關(guān)系，將單條引物組合成引物組。單條引物組合成引物組可按通用方法操作。

(5)引物組的檢測：

首先對(duì)引物組進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)檢測，包括：①引物組在目標(biāo)序列或者非目標(biāo)序列上能否滿足引物之間的位置關(guān)系、正負(fù)鏈關(guān)系；②引物組的GC含量、Tm值等與其擴(kuò)增區(qū)域的GC含量是否滿足相互關(guān)系；③每一條引物與其它單條引物之間是否存在相互作用。

其次，對(duì)引物組進(jìn)行通用性檢測和判定，即檢測該引物組能否應(yīng)用在集合G_1中的多個(gè)目標(biāo)序列。該引物組能應(yīng)用于集合G_1中的越多的目標(biāo)序列，通用性越好。

接著，對(duì)引物組進(jìn)行特異性檢測和判定，即檢測該引物組能否用于集合G_2中的任意一個(gè)非目標(biāo)序列。若不能用于集合G_2中的任意一個(gè)非目標(biāo)序列，則特異性檢測結(jié)果為“通過”，若能用于集合G_2中的一個(gè)或多個(gè)非目標(biāo)序列，則特異性檢測結(jié)果為“未通過”。

通過上述物理化學(xué)性質(zhì)、通用性及特異性三項(xiàng)檢測的，則該引物組即為符合條件的引物組。若未通過上述物理化學(xué)性質(zhì)、通用性及特異性三項(xiàng)檢測，則放棄該引物組。繼續(xù)或重新篩選，直至獲得符合條件的引物組。

(6)輸出符合條件的引物組：

輸出前步驟中獲得的能夠同時(shí)通過物理化學(xué)性質(zhì)檢測、通用性和特異性檢測的引物組中每一條引物的位置、長度、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)、 以及該引物組的通用性情況(即可以用于哪些目標(biāo)序列上)等信息。系統(tǒng)將符合條件的引物組按照通用性程度排序，通用性越強(qiáng)，排名越靠前，系統(tǒng)按此順序輸出符合條件的引物組。其中，引物組的數(shù)量可預(yù)先設(shè)定，在本實(shí)施例中引物組的數(shù)量預(yù)先設(shè)定為5。

例如，經(jīng)過運(yùn)行程序在AT富集區(qū)設(shè)計(jì)出LAMP反應(yīng)引物組5個(gè)，隨機(jī)選擇一個(gè)引物組進(jìn)行有效性驗(yàn)證。所述引物組的序列為：

F3：5’-GGATTAGGAAATATACGACGC-3’(SEQ ID NO：1)

FIP：5’-AGCAAAACCCATTGGTACCTTATACTGTCTATGGGCACAA-3’(SEQ ID NO：2)

BIP：5’-TGAATATGATCCCCCGGCTTCTGGGAGGAAATATCGCTAA-3’(SEQ ID NO：3)

B3：5’-AGCATATATGATACGGGGAA-3’(SEQ ID NO：4)

所用的LAMP反應(yīng)體系如下(反應(yīng)總體積為25μL)：1×Thermopol反應(yīng)緩沖液，6mmol/L Mg²⁺，1.6mmol/L dNTP，0.8μmol/L的FIP和BIP引物，0.3μmol/L的F3和B3引物，8U Bst DNA聚合酶，0.8mol/L甜菜堿，和不同濃度的DNA模板(1ng～1pg)。

當(dāng)使用阪崎克羅諾桿菌(編號(hào)為CICC 21560)DNA為模板時(shí)，采用設(shè)計(jì)的引物組成功地進(jìn)行了擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖如圖3所示，泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，泳道1～4分別為DNA模板量為1ng、100pg、10pg和1pg的阪崎克羅諾桿菌的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，呈現(xiàn)出LAMP反應(yīng)特征性的梯形條帶，泳道5為以滅菌水作陰性對(duì)照模板擴(kuò)增后的產(chǎn)物，不呈現(xiàn)LAMP反應(yīng)特征性的梯形條帶。

根據(jù)該引物組在GI號(hào)為156932229的阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)ATCC BAA-894上的位置，將F3到B3之間的擴(kuò)增區(qū)域序列(包含F(xiàn)3和B3)與數(shù)據(jù)庫中阪崎克羅諾桿菌的另外兩個(gè)全基因組序列(GI分別為389839000和449306535)進(jìn)行Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，引物區(qū)序列均完全匹配，表明本實(shí)施例中的上述引物組可以擴(kuò)增目前已有的3株阪崎克羅諾桿菌，通用性很好。

對(duì)上述引物組進(jìn)行特異性檢測。首先，從理論上進(jìn)行分析，將該引物組與其它所有非阪崎克羅諾桿菌的基因組進(jìn)行Bowtie比對(duì)(將參數(shù)設(shè)置為“-a -n 3”， 即允許不超過3個(gè)堿基不匹配)，發(fā)現(xiàn)上述引物組的序列在非阪崎克羅諾桿菌的基因組中不存在。此外，從對(duì)28株非阪崎克羅諾桿菌和1株阪崎克羅諾桿菌菌株進(jìn)行的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)結(jié)果(見表3)可以看出，使用該引物組僅有阪崎克羅諾桿菌菌株擴(kuò)增結(jié)果為陽性，而其它非阪崎克羅諾桿菌菌株均為陰性。因此，上述引物組具有很好的特異性。

綜合上述實(shí)驗(yàn)及理論分析可知，根據(jù)本發(fā)明方法設(shè)計(jì)出的阪崎克羅諾桿菌的LAMP引物具有很好的通用性和特異性，滿足設(shè)計(jì)的要求。

表3引物特異性檢測的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

注：a)CGMCC：中國普通微生物菌種保藏中心，CICC：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，CMCC：中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心。b)+：陽性結(jié)果，-：陰性結(jié)果。

實(shí)施例2志賀氏菌檢驗(yàn)用PCR引物的設(shè)計(jì)

本發(fā)明針對(duì)志賀氏菌(Shigella spp.)設(shè)計(jì)具有通用性和特異性的PCR引物，步驟如下：

(1)初始化：

使用2013年8月5號(hào)從NCBI的FTP上下載的有完整基因組序列的所有細(xì)菌和古菌的數(shù)據(jù)，共2599個(gè)全基因組序列。集合G_1中包含目標(biāo)基因組序列(即，志賀氏菌的9個(gè)全基因組序列)，集合G_2中包含非目標(biāo)基因組序列(即，除前述集合G_1中的9個(gè)全基因組序列之外的2590個(gè)全基因組序列)。

(2)設(shè)計(jì)單條引物：

PCR引物來源于基因組中的2個(gè)位置(引物P1和引物P2)。根據(jù)PCR引物的特性以及本實(shí)施例的需求，設(shè)定引物的GC含量、Tm值、3’端穩(wěn)定性、5’端穩(wěn)定性(見表4)及引物長度(18～25bp)等特性參數(shù)，且規(guī)定單條引物不能產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)、自身不能發(fā)生相互作用等條件，以GI號(hào)為110804074的福氏志賀氏菌(Shigella flexneri 5str.8401)的全基因組序列作為單條引物設(shè)計(jì)的候選序列，計(jì)算得出符合條件的單條引物。并記錄每一個(gè)單條引物在110804074基因組序列上的位置、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)以及引物的長度等信息。

表4 PCR反應(yīng)中單條引物的特性要求

(3)引物序列比對(duì)：

使用比對(duì)軟件Bowtie，將上一步設(shè)計(jì)出的單條引物分別與集合G_1中的目標(biāo)基因組序列和集合G_2中的非目標(biāo)基因組進(jìn)行序列比對(duì)。為了保證引物的通用性，當(dāng)該單條引物與集合G_1中的目標(biāo)序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，使用參數(shù)設(shè)置“-a -n 0”，即要求該單條引物與目標(biāo)序列完全匹配；為了保證引物的特異性，當(dāng)該單條引物與集合G_2中的非目標(biāo)序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，使用參數(shù)設(shè)置“-a -n 3”，即允許該單條引物與非目標(biāo)序列有不超過3個(gè)錯(cuò)配。比對(duì)結(jié)束后，記錄每一個(gè)單條引物在集合G_1和集合G_2中的每個(gè)基因組上的位置、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)。

(4)單條引物組合：

從上述步驟中產(chǎn)生的候選的單條引物中挑選引物P1和引物P2，并按照?qǐng)D4中的條件設(shè)定2條單條引物之間的位置以及在正負(fù)鏈上的關(guān)系，將單條引物組合成引物組。

(5)引物的檢測：

首先對(duì)引物組進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)檢測，包括：①引物組在目標(biāo)序列或者非目標(biāo)序列上能否滿足引物之間的位置關(guān)系、正負(fù)鏈關(guān)系；②引物組的GC含量、Tm值等與其擴(kuò)增區(qū)域的GC含量是否滿足相互關(guān)系；③每一條引物與其它單條引物之間是否存在相互作用。

其次，對(duì)引物組進(jìn)行通用性檢測和判定，即檢測該引物組能否應(yīng)用在集合G_1中的9個(gè)目標(biāo)序列。該引物組能應(yīng)用于集合G_1中的越多的目標(biāo)序列，通用性越好。

接著，對(duì)引物組進(jìn)行特異性檢測和判定，即檢測該引物組能否用于集合G_2中的任意一個(gè)非目標(biāo)序列，若不能用于集合G_2中的任意一個(gè)非目標(biāo)序列，則特異性檢測結(jié)果為“通過”，若能用于集合G_2中的一個(gè)或多個(gè)非目標(biāo)序列，則特異性檢測結(jié)果為“未通過”。

通過上述物理化學(xué)性質(zhì)、通用性及特異性三項(xiàng)檢測的，則該引物組即為符合條件的引物組。若未通過上述物理化學(xué)性質(zhì)、通用性及特異性三種檢測，則放棄該引物組。繼續(xù)或重新篩選，直至獲得符合條件的引物組。

(6)輸出符合條件的引物組：

輸出前步驟中獲得的能夠同時(shí)通過物理化學(xué)性質(zhì)檢測、通用性和特異性檢測的引物組中每一條引物的位置、長度、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)、以及該引物組的通用性情況(即可以用于哪些目標(biāo)序列上)等信息。系統(tǒng)將符合條件的引物組按照通用性程度排序，通用性越強(qiáng)，排名越靠前，系統(tǒng)按此順序輸 出符合條件的引物組。其中，引物組的數(shù)量可預(yù)先設(shè)定，在本實(shí)施例中引物組的數(shù)量預(yù)先設(shè)定為5。

例如，經(jīng)過運(yùn)行程序在AT富集區(qū)設(shè)計(jì)出PCR反應(yīng)所需要的引物組5個(gè)，隨機(jī)選擇一個(gè)引物組進(jìn)行有效性驗(yàn)證。所述引物組的序列為：

P1：5’-GGAGCCTGCTCAGTCTGTT-3’(SEQ ID NO：5)

P2：5’-TAACTGGGCCAAGGAAGGT-3’(SEQ ID NO：6)

所用的PCR反應(yīng)體系(反應(yīng)總體積為25μL)為：1×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg²⁺)，0.1mmol/L dNTP，0.8μmol/L的P1和P2引物和0.1U/μL Taq DNA聚合酶和50ng/μL DNA模板。所用的反應(yīng)溫度條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，不同溫度(51℃、53℃、55℃、57℃和59℃)退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；最后72℃延伸7min；16℃保存。

當(dāng)使用志賀氏菌(編號(hào)為CGMCC1.1868，為福氏志賀氏菌)DNA為模板時(shí)，采用設(shè)計(jì)的引物組成功進(jìn)行了擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖如圖5所示，泳道M為100bp梯度DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNAMarker I(100bp～600bp)，泳道1～4分別為退火溫度為51℃、53℃、55℃、57℃和59℃的志賀氏菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，其片段大小約為240bp，與預(yù)期片段大小(242bp)一致，泳道5為以滅菌水作陰性對(duì)照模板擴(kuò)增后的產(chǎn)物，沒有條帶。

通過將該引物組的P1和P2序列與所有細(xì)菌基因組的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Bowtie比對(duì)(允許不超過3個(gè)錯(cuò)配)，在理論上對(duì)該引物組的特異性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩條引物僅在志賀氏菌的9個(gè)基因組里同時(shí)出現(xiàn)，而在所有其它細(xì)菌基因組里均不能同時(shí)出現(xiàn)，表明采用本發(fā)明方法設(shè)計(jì)的該引物組具有很好的特異性。

綜合上述實(shí)驗(yàn)及理論分析可知，根據(jù)本發(fā)明方法設(shè)計(jì)出的志賀氏菌的PCR引物具有很好的通用性和特異性，滿足設(shè)計(jì)的要求。

實(shí)施例3阪崎克羅諾桿菌(Cronobacter sakazakii)OmpA基因擴(kuò)增用PCR引物的設(shè)計(jì)

利用本發(fā)明設(shè)計(jì)用以擴(kuò)增阪崎克羅諾桿菌OmpA基因的PCR引物，步驟如下：

(1)初始化：

使用2013年8月5號(hào)從NCBI的FTP上下載的三株阪崎克羅諾桿菌的完整 基因組序列(GI號(hào)分別為156932229、449306535和389839000)。設(shè)定集合G_1，其包含三株阪崎克羅諾桿菌的OmpA基因序列；設(shè)定集合G_2，其包含三株阪崎克羅諾桿菌基因組中除OmpA基因之外的其它序列。

(2)設(shè)計(jì)單條引物：

根據(jù)PCR引物的特性以及本實(shí)施例的需求，設(shè)定引物(P3和P4)的GC含量、Tm值、3’端穩(wěn)定性、5’端穩(wěn)定性(見表4)及引物長度(18～25bp)等特性參數(shù)，且規(guī)定單條引物不能產(chǎn)生發(fā)卡結(jié)構(gòu)、自身不能發(fā)生相互作用等條件，以GI號(hào)為156932229的阪崎克羅諾桿菌的OmpA基因序列作為單條引物設(shè)計(jì)的候選序列，計(jì)算得出符合條件的單條引物。并記錄每一個(gè)單條引物在156932229基因組序列上的位置、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)以及引物的長度等信息。

(3)引物序列比對(duì)：

使用比對(duì)軟件Bowtie，將上一步設(shè)計(jì)出的單條引物分別與集合G_1中的目標(biāo)基因組序列和集合G_2中的非目標(biāo)基因組進(jìn)行序列比對(duì)。為了保證引物的通用性，當(dāng)該單條引物與集合G_1中的目標(biāo)序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，使用參數(shù)設(shè)置“-a -n 0”，即要求該單條引物與目標(biāo)序列完全匹配；為了保證引物的特異性，當(dāng)該單條引物與集合G_2中的非目標(biāo)序列進(jìn)行比對(duì)時(shí)，使用參數(shù)設(shè)置“-a -n 3”，即允許該單條引物與非目標(biāo)序列有不超過3個(gè)錯(cuò)配。比對(duì)結(jié)束后，記錄每一個(gè)單條引物在集合G_1和集合G_2中的每個(gè)基因組上的位置、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)。

(4)單條引物組合：

從上述步驟中產(chǎn)生的候選的單條引物中挑選引物P3和引物P4，并按照?qǐng)D4中的條件設(shè)定2條單條引物之間的位置以及在正負(fù)鏈上的關(guān)系，將單條引物組合成引物組。

(5)引物的檢測：

首先對(duì)引物組進(jìn)行物理化學(xué)性質(zhì)檢測，包括：①引物組在目標(biāo)序列或者非目標(biāo)序列上能否滿足引物之間的位置關(guān)系、正負(fù)鏈關(guān)系；②引物組的GC含量、Tm值等與其擴(kuò)增區(qū)域的GC含量是否滿足相互關(guān)系；③每一條引物與其它單條引物之間是否存在相互作用。

其次，對(duì)引物組進(jìn)行通用性檢測和判定，即檢測該引物組能否應(yīng)用在集合G_1中的9個(gè)目標(biāo)序列。該引物組能應(yīng)用于集合G_1中的越多的目標(biāo)序列，通用性越好。

接著，對(duì)引物組進(jìn)行特異性檢測和判定，即檢測該引物組能否用于集合G_2中的任意一個(gè)非目標(biāo)序列，若不能用于集合G_2中的任意一個(gè)非目標(biāo)序列，則特異性檢測結(jié)果為“通過”，若能用于集合G_2中的一個(gè)或多個(gè)非目標(biāo)序列，則特異性檢測結(jié)果為“未通過”。

通過上述物理化學(xué)性質(zhì)、通用性及特異性三項(xiàng)檢測的，則該引物組即為符合條件的引物組。若未通過上述物理化學(xué)性質(zhì)、通用性及特異性三種檢測，則放棄該引物組。繼續(xù)或重新篩選，直至獲得符合條件的引物組

(6)輸出符合條件的引物組：

輸出前步驟中獲得的能夠同時(shí)通過物理化學(xué)性質(zhì)檢測、通用性和特異性檢測的引物組中每一條引物的位置、長度、正負(fù)鏈信息(即來源于正鏈還是負(fù)鏈)、以及該引物組的通用性情況(即可以用于哪些目標(biāo)序列上)等信息。系統(tǒng)將符合條件的引物組按照通用性程度排序，通用性越強(qiáng)，排名越靠前，系統(tǒng)按此順序輸出符合條件的引物組。其中，引物組的數(shù)量可預(yù)先設(shè)定(在本實(shí)施例中引物組的數(shù)量預(yù)先設(shè)定為5)。

例如，經(jīng)過運(yùn)行程序在GC含量正常區(qū)設(shè)計(jì)出PCR反應(yīng)所需要的引物組5個(gè)，隨機(jī)選擇一個(gè)引物組進(jìn)行有效性驗(yàn)證。所述引物組的序列為：

P3：5’-GACTCACGAAAGCCAGCTG-3’(SEQ ID NO：7)

P4：5’-AGTCAGCACGCCATACCA-3’(SEQ ID NO：8)

所用的PCR反應(yīng)體系(反應(yīng)總體積為25μL)為：1×PCR反應(yīng)緩沖液(含Mg²⁺)，0.1mmol/L dNTP，0.8μmol/L的P3和P4引物，0.1U/μL Taq DNA聚合酶和50ng/μL DNA模板。所用的反應(yīng)溫度條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，循環(huán)30次；最后72℃延伸7min；16℃保存。

當(dāng)使用阪崎克羅諾桿菌(編號(hào)為CICC 21560)DNA為模板時(shí)，采用設(shè)計(jì)的引物組進(jìn)行了擴(kuò)增，電泳分析結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期片段大小(230bp)一致。

因此，根據(jù)本發(fā)明方法設(shè)計(jì)出的阪崎克羅諾桿菌OmpA基因的PCR引物能夠滿足設(shè)計(jì)的要求。