本發(fā)明涉及植物基因工程及作物育種技術(shù)領(lǐng)域。具體地說，涉及一種抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻KCRC04的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)：

我國是世界上主要的水稻種植國和消費國，目前，中國水稻的種植面積位居全球第二，產(chǎn)量位居世界第一(蘇少泉，滕春紅。稻田除草劑的新發(fā)展。世界農(nóng)藥，2010，32:1-6.)。2011年，我國水稻的種植面積達(dá)到了3005.7萬公頃，稻谷的年產(chǎn)量達(dá)到了20100.1萬噸，占所有糧食產(chǎn)量的35.2％(中國統(tǒng)計年鑒，2012)。截至2008年底，我國的耕地面積已縮減至12171.6萬公頃，近幾年來耕地保有量也僅僅是維持在這一數(shù)量之上，而人口卻以每年5‰的速度增長(中國統(tǒng)計年鑒，2012)。從以上的統(tǒng)計數(shù)據(jù)可以看出，水稻的安全、穩(wěn)定的生產(chǎn)是保障國家糧食安全的關(guān)鍵。但是蟲害和雜草等不良環(huán)境因素限制了水稻產(chǎn)量潛力的發(fā)揮。

(1)昆蟲危害問題：蟲害是影響水稻生產(chǎn)的重要因素，每年造成的產(chǎn)量損失高達(dá)15％左右(張啟發(fā)。綠色超級稻的構(gòu)想與實踐，2009，科學(xué)出版社)。當(dāng)前對農(nóng)作物害蟲的防治措施還主要依賴化學(xué)農(nóng)藥。我國農(nóng)藥使用量全球第一，1990年用量不到30萬噸，而2005年用量就已達(dá)到140萬噸。農(nóng)藥的大量使用，既增加了農(nóng)民的種植成本，減少了種糧收益，又造成了環(huán)境污染、農(nóng)藥殘留、害蟲抗藥性增強(qiáng)以及殺傷天敵等一系列生態(tài)環(huán)境問題。Bt抗蟲蛋白，主要對鱗翅目昆蟲如水稻螟蟲的幼蟲有毒，有很強(qiáng)的專一性，通過培育轉(zhuǎn)基因Bt抗蟲水稻，能夠有效的防治水稻螟蟲的危害，減少農(nóng)藥使用量，增加農(nóng)民的收入，降低農(nóng)藥使用對環(huán)境造成的危害。

(2)雜草危害問題：稻田雜草與水稻在水、肥、生長空間上進(jìn)行競爭，直接影響水稻的產(chǎn)量。近年來直播和拋秧等栽培方法的使用，使得稻田的雜草危害變得日益嚴(yán)重。另外，隨著農(nóng)村人口往城市遷移速度的加快，水稻種植的規(guī)?；蜋C(jī)械化是一個可預(yù)見的趨勢，這使得傳統(tǒng)的人工除草的方法變得不現(xiàn)實。施用除草劑是解決這些新出現(xiàn)問題的最佳方案之一。因此，抗除草劑雜交稻將具有很大的實際需求和市場潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的是提供一種抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻KCRC04的構(gòu)建方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因水稻事件，通過將抗蟲抗除草劑基因構(gòu)建到一個表達(dá)載體上使得受體植物同時具有抗蟲抗除草劑的特性。通過多代的性狀定向篩選和鑒定，得到了抗蟲抗除草劑優(yōu)異株系并分離了外源載體的側(cè)翼序列，確定了其整合位點。該轉(zhuǎn)化事件獲得的轉(zhuǎn)基因水稻植株不僅可以用來作為品種改良的供體，而且特異性檢測方法的設(shè)計為鑒定包含該轉(zhuǎn)化事件同樣的T-DNA片段、且插入到同樣基因組位置的轉(zhuǎn)基因植株提供了途徑。

本發(fā)明構(gòu)建了包含草甘膦抗性基因cp4 epsps(SEQ ID NO:15)和抗螟蟲基因cry1C(SEQ ID NO:16)的遺傳轉(zhuǎn)化載體pZHZH15003，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法、以草甘膦作為篩選劑，成功地將pZHZH15003的T-DNA區(qū)單拷貝整合到水稻基因組中，并培育出抗螟蟲、抗草甘膦、農(nóng)藝性狀優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因水稻植株KCRC04，明確了外源T-DNA的插入位置并設(shè)計了特異性檢測方法。

本發(fā)明提供抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻KCRC04的T-DNA區(qū)核苷酸序列，所述T-DNA區(qū)核苷酸序列為如SEQ ID NO:1所示、或其互補序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA區(qū)核苷酸序列的左邊界側(cè)翼序列為如SEQ ID NO:2所示、或其互補序列或與 其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻KCRC04的T-DNA區(qū)核苷酸序列，所述T-DNA區(qū)核苷酸序列為如SEQ ID NO:1所示、或其互補序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列；所述T-DNA區(qū)核苷酸序列的右邊界側(cè)翼序列為如SEQ ID NO:3所示、或其互補序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供了用于普通PCR定性檢測KCRC04轉(zhuǎn)化事件及基因型的特異性引物對，包括：

LBF1:GGAAACAGCTGCCTGGGAT；

LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT；

RBR:TGTGACGATCGAAAAAATACGAAT。

本發(fā)明還提供了用于Realtime-PCR定量檢測KCRC04轉(zhuǎn)化事件的特異性引物對，包括：

LBF2:AGCTTAGCCAACACGGACTTG；

LBR:CAGTACATTAAAAACGTCCGCAAT。

本發(fā)明還提供了抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的檢測方法，包括以下步驟：

1)提取待測轉(zhuǎn)基因水稻的總DNA；

2)以步驟1)的DNA為模板，利用引物SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6進(jìn)行普通PCR或Realtime-PCR擴(kuò)增；

3)凝膠電泳分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物或分析Realtime-PCR擴(kuò)增曲線。

本發(fā)明還提供所述檢測方法在水稻育種中的應(yīng)用。涉及對上述轉(zhuǎn)化事件的水稻植株的檢測，以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因標(biāo)識、含量分析、基因漂移研究及雜交育種跟蹤等應(yīng)用。所述植株包含但不限于親本、自交后代、雜交后代的種子、花粉、雌蕊、葉片、根等各器官及植物細(xì)胞、植物組織等。

本發(fā)明還提供所述檢測方法在判斷KCRC04轉(zhuǎn)化事件的基因型中的應(yīng)用，具體為：

只有一條448bp大小帶型的材料為KCRC04純合基因型的材料；

只有一條590bp大小帶型的材料為不含KCRC04事件的材料；

有兩條帶型且大小分別為448bp和590bp的材料為KCRC04雜合基因型的材料。

本發(fā)明進(jìn)一步提供抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)人工合成草甘膦和螟蟲抗性基因cp4 epsps和cry1C；

(2)將步驟(1)中合成的基因構(gòu)建到同一遺傳轉(zhuǎn)化載體pZHZH15003中；

所述轉(zhuǎn)化載體pZHZH15003的具體構(gòu)建過程為：將CP4片段與PU130載體(該載體為pCambia3300的衍生載體，其構(gòu)建過程是：pCambia3300經(jīng)XhoI和HindIII酶切處理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130)分別用BamHI和SacI酶切，連接后得到骨架載體Pubi-CP4-T35spolyA；PCR擴(kuò)增rbcs啟動子并在其兩端分別添加HindIII和XmaI酶切位點，連接到來自Promega公司的克隆載體pGEM7Z上，獲得中間載體7Z-rbcs；合成cry1C-Tnos片段并添加酶切位點XmaI和SphI；分別用XmaI和SphI切割該片段和中間載體7Z-rbcs，連接后得到中間載體Prbcs-cry1C-Tnos；使用PmeI單酶切骨架載體Pubi-CP4-T35spolyA，并用CIP處理去磷酸化；使用SacI酶切中間載體Prbcs-cry1C-Tnos，并補平粘性末端。連接上述處理后的骨架片段和插入片段Prbcs-cry1C-Tnos，構(gòu)建得到pZHZH15003載體。

(3)將步驟(2)中獲得的重組載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法導(dǎo)入到水稻品種‘空育131’中；具體步驟為：將構(gòu)建得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中；將農(nóng)桿菌菌液侵染水稻的胚性愈傷組織；將愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加了草甘膦的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑選抗性愈傷組織；將 抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，將分化形成的再生小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼苗生根后煉苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化體。

(4)對步驟(3)的轉(zhuǎn)化體進(jìn)行分子鑒定，篩選單拷貝插入且無載體骨架的T0代轉(zhuǎn)化植株，種植并收獲T1代種子；

(5)待步驟(4)的T1代種子發(fā)芽15天后噴施草甘膦，選取具有草甘膦抗性且符合孟德爾遺傳規(guī)律的轉(zhuǎn)基因水稻株系，檢測基因型，篩選純合株收獲T2代種子；

(6)種植步驟(5)的T2代種子，在植株不同生長階段鑒定其對水稻螟蟲的抗性，篩選抗蟲性好的株系收獲T3代種子；

(7)將步驟(6)的T3代種子培育成植株，評估株系的農(nóng)藝性狀，選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系檢測T-DNA區(qū)核苷酸序列，篩選具有T-DNA區(qū)單拷貝的轉(zhuǎn)基因水稻植株；所述T-DNA區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其互補序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列；

(8)利用所述檢測方法對步驟(7)的轉(zhuǎn)基因水稻植株進(jìn)行驗證，最終獲得抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻；

所述抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻，其T-DNA左邊界側(cè)翼序列如SEQ ID NO:2所示，或其互補序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列；其T-DNA右邊界側(cè)翼序列如SEQ ID NO:3所示，或其互補序列或與其同源性達(dá)到90％以上的核苷酸序列。

其中，所述步驟5)中草甘膦的噴施濃度范圍為0.3％-9％V/V。

本發(fā)明還進(jìn)一步提供了抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建方法在雜草控制和害蟲防治方面的應(yīng)用。

本發(fā)明獲得的抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻植株KCRC04是以水稻品種‘空育131’為受體通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得的，同時該轉(zhuǎn)化事件也適用于具有同樣的T-DNA片段、且插入到同樣基因組位置，而利用其他受體品種改良而獲得的植株。

本發(fā)明提供了抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的檢測方法及應(yīng)用，適用于轉(zhuǎn)基因水稻的安全評估和檢測，以及由該轉(zhuǎn)化事件獲得的轉(zhuǎn)基因水稻為供體而得到的各種轉(zhuǎn)基因水稻新品種。

一方面，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因水稻事件，由該轉(zhuǎn)化事件獲得的轉(zhuǎn)基因水稻具有抗螟蟲抗草甘膦的特性，應(yīng)用該轉(zhuǎn)基因水稻可以進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻新品種的培育和改良以防治螟蟲危害及雜草危害。

另一方面，本發(fā)明提供了一種抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的檢測方法，應(yīng)用該方法可以對包含與該轉(zhuǎn)化事件具有同樣的T-DNA片段、且插入到同樣基因組位置的轉(zhuǎn)基因水稻(包含親本、雜種及其后代)及其制品(包括植株、組織、稻谷、大米及其制品)實施檢測、監(jiān)測和安全管理。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中轉(zhuǎn)化事件的T-DNA區(qū)及插入位置示意圖。箭頭表示轉(zhuǎn)化事件檢測引物的設(shè)計位置，各元件的名稱標(biāo)注在圖上。LB，Left Border；RB，Right Border；S，SEQ ID NO。

圖2為本發(fā)明實施例1中轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定結(jié)果(抗體試紙檢測)。A：Southern雜交鑒定轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)；B：抗體試紙鑒定外源蛋白表達(dá)。星號表示含KCRC04事件的樣品。

圖3為本發(fā)明實施例1中轉(zhuǎn)基因植株的除草劑抗性及性狀分離的情況。箭頭指示的株系為野生型對照。轉(zhuǎn)基因株系中枯死的植株為分離出來的陰性基因型。星號表示含KCRC04事件的樣品。

圖4為本發(fā)明實施例1中轉(zhuǎn)化事件對不同濃度草甘膦的耐受性的鑒定情況。A：野生型‘空育131’噴施0.3％的草甘膦；B、C、D、E、F、G、H、I分別為KCRC04轉(zhuǎn)基因水稻分別噴施0、0.3％、2.4％、4.8％、6％、9％、15％、24％(V/V)的草甘膦。噴施兩周后照相。

圖5為本發(fā)明實施例1中轉(zhuǎn)化事件對水稻螟蟲的抗性鑒定情況。A：轉(zhuǎn)化事件對水稻二化螟的抗性；B：轉(zhuǎn)化事件在田間對稻縱卷葉 螟的抗性。箭頭指示為受稻縱卷葉螟危害的葉片。

圖6為本發(fā)明實施例2中轉(zhuǎn)化事件的特異性檢測結(jié)果。A：普通PCR對KCRC04的定性檢測及基因型檢測。M，DL2000plus DNA marker，大小標(biāo)注在旁邊；+/+表示KCRC04純合基因型；+/-表示KCRC04雜合基因型；-/-表示不含有KCRC04的基因型；B：Realtime-PCR對KCRC04的定量檢測。1-4分別為KCRC04不同含量模板的擴(kuò)增曲線產(chǎn)物。1，512pg基因組DNA；2，64pg基因組DNA；3，8pg基因組DNA；4，1pg基因組DNA。

具體實施方式

以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

實施例1抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的獲得

抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的構(gòu)建方法如下：

1、基因的合成、遺傳轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因植株的獲得

根據(jù)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的序列，人工合成cp4 epsps和cry1C基因。構(gòu)建到同一遺傳轉(zhuǎn)化載體pZHZH15003中。載體pZHZH15003的具體構(gòu)建過程為：將CP4片段與PU130載體(該載體為pCambia3300的衍生載體，其構(gòu)建過程是：pCambia3300經(jīng)XhoI和HindIII酶切處理，用Pubi取代P35s-Bar部分得到PU130)分別用BamHI和SacI酶切，連接后得到骨架載體Pubi-CP4-T35spolyA；PCR擴(kuò)增rbcs啟動子并在其兩端分別添加HindIII和XmaI酶切位點，連接到來自Promega公司的克隆載體pGEM 7Z上，獲得中間載體7Z-rbcs；合成cry1C-Tnos片段并添加酶切位點XmaI和SphI；分別用XmaI和SphI切割該片段和中間載體7Z-rbcs，連接后得到中間載體Prbcs-cry1C-Tnos；使用PmeI單酶切骨架載體Pubi-CP4-T35spolyA，并用CIP處理去磷酸 化；使用SacI酶切中間載體Prbcs-cry1C-Tnos，并補平粘性末端。連接上述處理后的骨架片段和插入片段Prbcs-cry1C-Tnos，構(gòu)建得到pZHZH15003載體。

載體T-DNA區(qū)域示意圖見圖1，T-DNA區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。將重組pZHZH15003載體通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入到水稻品種‘空育131’中。具體導(dǎo)入的步驟為：將構(gòu)建得到的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中；將農(nóng)桿菌菌液侵染水稻的胚性愈傷組織；將愈傷組織轉(zhuǎn)移到添加了草甘膦的選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選培養(yǎng)，挑選抗性愈傷組織；將抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)，將分化形成的再生小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)，幼苗生根后煉苗、移栽，得到轉(zhuǎn)基因水稻轉(zhuǎn)化體。

2、水稻轉(zhuǎn)基因植株的分子鑒定

對這些轉(zhuǎn)化事件拷貝數(shù)和載體骨架進(jìn)行分析，同時分析CP4 EPSPS和cry1C蛋白的表達(dá)，篩選到單拷貝且沒有T-DNA區(qū)域以外載體骨架、蛋白正常表達(dá)的轉(zhuǎn)基因T0植株種到溫室并收獲T1代種子。KCRC04的分子鑒定結(jié)果見表1。

表1 KCRC04的DNA陽性鑒定結(jié)果

注：RQ值代表外源基因與內(nèi)源基因Actin的DNA拷貝比值。

RQ值在0.1-0.6區(qū)間時，認(rèn)為靶標(biāo)基因是單拷貝插入。但由于檢測RQ值存在著一定誤差，需要Southern方法進(jìn)行驗證，具體操作按照如下步驟進(jìn)行。

1)CTAB法抽提轉(zhuǎn)化植株總基因組DNA。分單株取葉片0.5-1g，放入預(yù)冷的研缽中，加入液氮快速將葉片研磨成粉末，倒入2mL離心管中。加入700μl預(yù)熱至65℃的1.5％CTAB提取液并搖勻，65℃水浴保溫30-60min，期間搖動幾次；室溫冷卻后，加入700μl氯仿，搖勻后，顛倒輕搖10min，室溫下8000rpm離心10min；將上清移至另一離 心管中，加入等體積的沉淀液(異丙醇)，-20℃下沉淀30分鐘，室溫下8000rpm離心10min；用700μl 75％乙醇漂洗2-3次，風(fēng)干后溶于50μl TE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2)基因組DNA的酶切。選用限制性內(nèi)切酶HindIII酶切轉(zhuǎn)化植株總基因組DNA，酶切反應(yīng)體系如下：

混勻后于37℃酶切10-18h左右，酶切后先取5μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)電泳，檢測酶切效果。最后將酶切后的總DNA在1％的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行低電壓(30-40V)電泳過夜。

3)轉(zhuǎn)膜。將凝膠修整后切去右下角作為標(biāo)記，浸泡在0.25mol/L HCl至溴酚藍(lán)變黃，蒸餾水洗兩次；堿變性液(1.5M NaCl,0.5M NaOH)中變性45min，去離子水漂洗；中和液(1M pH7.4的Tris-HCl，1.5M NaCl)中漂洗30min，更換中和液漂洗15min；置于搭好的轉(zhuǎn)膜臺上，用10×SSC作為轉(zhuǎn)膜液，Hybond-N+尼龍膜漂洗于去離子水液面，直至完全濕潤，浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中；用10×SSC溶液進(jìn)行毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移16-20h，將膠上的DNA轉(zhuǎn)移到尼龍膜上。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，將尼龍膜用2×SSC溶液簡單漂洗后，紫外交聯(lián)儀上交聯(lián)1min后，室溫晾干，用保鮮膜將膜包好，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

4)探針合成及雜交與顯影。探針標(biāo)記及雜交與顯影采用Roche公司DIG High Primer DNALabeling and Detection Starter Kit I，按照試劑盒的說明進(jìn)行操作。本發(fā)明以CP4基因部分序列作為雜交探針。

5)雜交。加熱雜交液DIG Easy Hyb(10ml/100cm2)，在雜交爐中42℃下預(yù)雜交30分鐘；95℃下變性探針(25ng/ml)，5分鐘后置于冰上；將變性探針加入到預(yù)先加熱的DIG Easy Hyb中(3.5ml/100cm2)，混勻；倒掉預(yù)雜交液，加入變性的探針；雜交爐中42℃下雜交4h-O/N。

6)洗膜。倒掉雜交液，然后用2×SSC，0.1％SDS室溫下洗滌兩次，每次5分鐘；最后用0.5×SSC，0.1％SDS，65℃下洗滌兩次，每次15分鐘。

7)顯色。同探針檢測操作。結(jié)果如圖2A所示，KCRC04轉(zhuǎn)化事件為外源T-DNA單拷貝插入基因組的事件。

利用上海佑隆生物科技有限公司產(chǎn)品AntiCP4和AntiCry1C試紙條通過如下步驟檢測植物組織中的蛋白。取樣：取測定組織(葉片、根、花粉等)，加水磨碎樣品；檢測：取試紙條，檢測端浸入樣品；結(jié)果觀察：5-10分鐘后觀察結(jié)果，對照線顯出，表示試驗正常。檢測線是否顯出表示是否含有檢測蛋白。如圖2B所示，PCR檢測呈陽性的轉(zhuǎn)基因植株全部可以檢測出條帶來，而野生型對照材料沒有檢測出條帶。表明外源的cp4 epsps基因和cry1C基因可以在轉(zhuǎn)基因水稻細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出蛋白。

3、水稻轉(zhuǎn)基因植株的草甘膦抗性鑒定及基因型分析

T1種子發(fā)芽，15天后噴施草甘膦，選取草甘膦抗性和敏感植株符合孟德爾遺傳規(guī)律的株系，取樣檢測基因型，選取純合株收獲T2種子；

為了檢測轉(zhuǎn)基因水稻對草甘膦除草劑的抗性，于兩葉期以0.6％(V/V)濃度的草甘膦噴施，一周后觀察植株表型。結(jié)果顯示噴施除草劑后轉(zhuǎn)基因植株可以正常生長而野生型材料逐漸干枯、死亡(如圖3所示，照片拍攝于噴施除草劑一周后)。這表明了含有本發(fā)明轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因水稻對草甘膦除草劑具有抗性。同時因為外源基因的單拷貝插入，在T0代時表現(xiàn)為雜合狀態(tài)，自交收獲T1種子后會有基因和性狀分離現(xiàn)象且符合孟德爾遺傳規(guī)律，因此統(tǒng)計草甘膦抗性和敏感植株的比例可以驗證外源基因的整合狀況。表2中數(shù)據(jù)表明，KCRC04轉(zhuǎn)化事件的遺傳特點符合孟德爾遺傳規(guī)律。

表2 KCRC04T1代株系的除草劑抗性及分離情況結(jié)果

4、水稻轉(zhuǎn)基因植株的螟蟲抗性鑒定

播種T2代種子，鑒定其對草甘膦不同濃度的耐受性及對水稻螟蟲的抗性。選取抗性好的株系收獲T3種子。

草甘膦耐受性分析通過以下步驟實現(xiàn)。播種：將轉(zhuǎn)基因和對照種子播種在穴盤中，待幼苗長至三葉一心到五葉一心時期進(jìn)行草甘膦噴灑。施藥后二周內(nèi)觀察并記錄植株的葉色和長勢等情況。草甘膦噴灑設(shè)計8個梯度，分別是草甘膦含量為0，0.3％，2.4％，4.8％，6％，9％，15％，24％(V/V)。結(jié)果如圖4所示(照片拍攝于噴施除草劑兩周后)，0.3％為廠家推薦的田間噴施濃度，野生型對照噴施0.3％的草甘膦后即會枯死，而轉(zhuǎn)基因水稻可以耐受9％(V/V)以下的濃度，相當(dāng)于可以耐受推薦噴施濃度的30倍。在噴施15％和24％濃度的草甘膦后轉(zhuǎn)基因植株會表現(xiàn)出葉尖變黃，生長減緩，但依然能夠存活。

螟蟲抗性鑒定通過室內(nèi)生測和田間調(diào)查兩種方式評估。室內(nèi)生測實驗通過以下步驟實現(xiàn)。播種：將轉(zhuǎn)基因和對照種子播種在穴盤中，待發(fā)芽25天左右備用；接蟲：在培養(yǎng)皿內(nèi)加入3-5片水稻葉片或2cm長的莖稈，底部加入一層干凈濕潤的濾紙，接入10頭二化螟初孵幼蟲，用透氣膠帶封口，再用一塊大小合適的黑布蓋住，橡皮筋固定；培養(yǎng)：接種完畢后放在培養(yǎng)室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：溫度28℃，濕度85％±5％，光照時間16L/8D；統(tǒng)計：接蟲5天后統(tǒng)計二化螟死亡率和校正死亡率。死亡率以對照植株進(jìn)行校正，計算公式為：

田間調(diào)查方式為隨機(jī)選取10株水稻，計算整株葉片數(shù)和卷葉數(shù)以計算卷葉率來評估對稻縱卷葉螟的抗性；計算整株分蘗數(shù)和枯心數(shù)以計算枯心率來評估對水稻二化螟的抗性。螟蟲抗性鑒定結(jié)果見表3和圖5，數(shù)據(jù)表明KCRC04對水稻螟蟲的抗性較強(qiáng)，能夠有效的降低螟 蟲的危害，從而減少農(nóng)藥的施用量。

表3 KCRC04對水稻螟蟲的抗性。

5、水稻轉(zhuǎn)基因植株的綜合農(nóng)藝性狀

農(nóng)藝性狀分析采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計，小區(qū)面積10.8平米，植株行間距26cm×16.5cm(五八寸)，小區(qū)內(nèi)種植20株×15行，轉(zhuǎn)基因和對照各種植3次重復(fù)。整個生育期采用正常的田間管理措施。收獲時，排除小區(qū)四周兩行的植株，在剩余范圍內(nèi)，隨機(jī)選取10個植株作為樣本，測定產(chǎn)量相關(guān)性狀并進(jìn)行統(tǒng)計分析，評估株系的綜合農(nóng)藝性狀。KCRC04的綜合農(nóng)藝性狀表現(xiàn)見表4。數(shù)據(jù)表明在螟蟲沒有發(fā)生或是害蟲防治措施良好的情況，KCRC04的綜合農(nóng)藝性狀不會比野生型對照的差。

表4 KCRC04的綜合農(nóng)藝性狀

6、T-DNA區(qū)的側(cè)翼序列分離及插入位置確定

選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良的株系分離T-DNA區(qū)的側(cè)翼序列。得到的側(cè)翼序列與水稻基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，明確外源T-DNA插入位置。

利用Adaptor-PCR分析轉(zhuǎn)基因片段插入位置，具體步驟如下：

用2mL離心管法制備基因組DNA備用。

用ddH2O將接頭引物AD-L (CTAATACGAGTCACTATAGCGCTCGAGCGGCCGCCGGGGAGGT)和AD-S(Pi-ACCTCCCC-NH2)分別稀釋到100μmol/L，等體積混合，94℃水浴變性4min，自然冷卻至室溫后即為50μmol/L的接頭。

在滅菌的0.5mL離心管中加入下列反應(yīng)體系，室溫(25℃)孵育16h：

反應(yīng)結(jié)束后65℃水浴10min終止反應(yīng)。

以步驟3中的酶切連接產(chǎn)物作為第一輪PCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)體系如下：

其中，所述SP1和VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示和SEQ ID NO:13所示。

首輪PCR反應(yīng)程序為：94℃，5min；(94℃，30sec；72℃，3min)×7cycles；(94℃，30sec；67℃，3min)×32cycles；67℃，7min；25℃，10min。

以步驟4中相應(yīng)的PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系如下：

其中，所述SP2和VP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:12所示和SEQ ID NO:14所示。

二輪PCR反應(yīng)程序：94℃，5min；(94℃，30sec；72℃，3min)×5cycles；(94℃，30sec；67℃，3min)×20cycles；67℃，7min；25℃，10min。

取5μL第二輪PCR的產(chǎn)物于1％(w/v)0.5×TBE瓊脂糖凝膠中電泳檢測，挑選有250bp以上DNA片段的PCR產(chǎn)物用雙脫氧鏈終止法進(jìn)行測序。

測序結(jié)果在RGAP數(shù)據(jù)庫中(http://rice.plantbiology.msu.edu/)用BLASTN工具與水稻基因組序列進(jìn)行同源比對，以最好的匹配結(jié)果為插入位點。

得到的側(cè)翼序列如SEQ ID NO:2所示和SEQ ID NO:3所示。

利用以上步驟獲得的轉(zhuǎn)化事件KCRC04單拷貝插入水稻基因組第一染色體chr01:39516775-39516790位置，具有螟蟲和草甘膦的抗性，且其他農(nóng)藝性狀與‘空育131’對照品種無明顯差異。包含該轉(zhuǎn)化事件的轉(zhuǎn)基因植株可以用大面積噴灑的方法去除雜草和雜株，提高工作效率。同時該類轉(zhuǎn)基因植株可以防止螟蟲對水稻植株的危害，減少農(nóng)藥的施用量，從而保證產(chǎn)量的穩(wěn)定，減少勞動投入，降低農(nóng)藥對環(huán)境 的污染。此外，該轉(zhuǎn)化事件可以作為供體通過有性雜交或定點插入等方法導(dǎo)入其他水稻植株中從而使得其他水稻植株獲得抗螟蟲抗草甘膦的特性。因此只要含有與KCRC04轉(zhuǎn)化事件同樣的T-DNA片段、且插入到同樣基因組位置的水稻植株都屬于本發(fā)明保護(hù)范疇。

實施例2抗螟蟲抗草甘膦轉(zhuǎn)基因水稻的檢測方法

依據(jù)KCRC04轉(zhuǎn)化事件的外源T-DNA區(qū)邊界序列及側(cè)翼的水稻基因組序列設(shè)計引物，通過PCR方法擴(kuò)增特異性條帶，以檢測水稻樣品中是否含有與KCRC04轉(zhuǎn)化事件同樣的T-DNA片段、且插入到同樣基因組位置的事件以及轉(zhuǎn)化事件的基因型和含量。具體操作按照如下步驟進(jìn)行。

1)抽提水稻葉片基因組DNA(具體方法見實施例1)。

2)采用普通PCR方法，設(shè)計特異性引物L(fēng)BF1、LBR和RBR，序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)總體積為20μl：DNA模板2μl，10×PCR buffer 2μl，10mM dNTP0.4μl，10mM LBF1引物0.8μl，10mM LBR和RBR引物各0.4μl，Taq DNA聚合酶0.2μl，加水到20μl。PCR反應(yīng)條件如下：①94℃預(yù)變性4分鐘，②94℃變性0.5分鐘，③58℃退火0.5分鐘，④72℃延伸0.5分鐘，⑤從②－④循環(huán)35次，⑥72℃延伸10分鐘，⑦4℃保存。PCR產(chǎn)物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，結(jié)果如圖6A所示。用此特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，擴(kuò)出一條448bp大小帶型的材料為KCRC04純合基因型的材料，擴(kuò)出一條590bp大小帶型的材料為不含KCRC04事件的材料，擴(kuò)出兩條帶型且大小分別為448bp和590bp的材料為KCRC04雜合基因型的材料。PCR產(chǎn)物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示。

3)采用Realtime-PCR方法，設(shè)計特異性引物L(fēng)BF2和LBR，序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示進(jìn)行檢測。PCR反應(yīng)總體積為10μl：DNA模板0.5μl，10mM LBF2和LBR引物各0.2μl，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master[ROX]5μl，加水到10μl。PCR反應(yīng)條件如下：①95℃預(yù)變性10分鐘，②95℃變性10秒，③60℃退火延伸30秒，④從②－③循環(huán)40次。Realtime-PCR擴(kuò)增曲線如圖6B所示，擴(kuò)增產(chǎn)物如SEQ ID NO:10所示。此方法最低檢測到的KCRC04基因組DNA含量為8pg，表明該檢測方法靈敏度高。

KCRC04轉(zhuǎn)化事件檢測方法的建立，可以確認(rèn)轉(zhuǎn)基因水稻樣品是否含有該轉(zhuǎn)化事件以及轉(zhuǎn)化事件的基因型和含量。這不僅能夠應(yīng)用于KCRC04轉(zhuǎn)基因水稻大規(guī)模生產(chǎn)時對其轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行檢測、監(jiān)測和標(biāo)識，還能在雜交育種過程中的目標(biāo)片段跟蹤方面發(fā)揮重要的作用。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。