本發(fā)明涉及一種球蟲卵囊制備方法，特別涉及一種無外源菌DNA污染的球蟲卵囊制備方法。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

全基因組測序，即對一種生物的基因組中的全部基因進行測序，測定其DNA的堿基序列。全基因組測序覆蓋面廣，能檢測個體基因組中的全部遺傳信息；準確性高，其準確率可高達99.99％。全基因組測序是目前生物學研究領(lǐng)域的熱門之一，對疾病防治和新藥開發(fā)具有重要意義。

球蟲是一類腸道內(nèi)寄生原蟲，球蟲卵囊來源于腸道或糞便，而腸道和糞便中存在大量的細菌和其它雜質(zhì)，因此，卵囊的分離純化對球蟲基因組研究至關(guān)重要。目前，關(guān)于卵囊分離純化的方法旨在獲得高純度卵囊，其中一個重要步驟就是用次氯酸鈉溶液對卵囊進行無菌化處理，但忽略了殘留在卵囊中的細菌DNA污染的問題，這種細菌DNA污染將對球蟲基因組研究產(chǎn)生重大影響，特別是在全基因組測序中產(chǎn)生大量的無效數(shù)據(jù)，甚至造成實驗失敗。

卵囊分離純化和基因組提取過程中，試驗用水和試劑也是外源菌DNA污染來源之一，通過細菌16s RNA基因通用引物PCR檢測，無論是抽濾或高壓滅菌后的試劑中仍存在一定量的細菌DNA污染，這種試劑中存在的DNA很可能粘附于卵囊表面，難以去除，對后續(xù)實驗造成影響。而商品化的無微生物DNA污染水(如Qiangen公司，Microbial DNA-free water,Cat#：338132)價格昂貴(約60RMB/mL)，不適用于大量試劑配制，因此實驗室自制無微生物DNA污染水尤為重要。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，利用石英自動亞沸高純水蒸餾器對實驗室常規(guī)超純水進行二次蒸餾得到二次蒸餾水，經(jīng)PCR檢測，所獲得的二次蒸餾水中完全去除了試驗用水中微生物DNA污染，此方法成本很低并能大量制水。

此外，利用1.2M蔗糖對卵囊進行漂浮，0.3M蔗糖溶液進行沉淀，能很好地去除卵囊中的雜質(zhì)。卵囊無菌化處理過程中，增加細胞裂解液的處理，能完全裂解次氯酸鈉溶液未能殺滅的細菌，顯微鏡下觀察，細胞裂解液對卵囊不造成任何影響， 而通過TE和水的反復漂洗，能完全去除殘留在卵囊表面的細菌DNA。本發(fā)明發(fā)明人也曾使用溶菌酶去除卵囊中殘留的細菌和DNA消化酶去除卵囊表面殘留的細菌DNA，但這兩種試劑需要在一定溫度下(37℃)發(fā)揮作用，溫度變化可能對卵囊產(chǎn)生影響，因此不適用于卵囊細菌和DNA污染的去除。

本發(fā)明首次針對球蟲卵囊中外源菌DNA污染，利用實驗室自制的無微生物DNA污染水配制試劑，采用1.2M蔗糖漂浮和0.3M蔗糖沉淀對卵囊進行純化，純化后的卵囊經(jīng)15％次氯酸鈉溶液和細胞裂解液雙重處理，最大程度裂解卵囊中的細菌，再通過TE和二次蒸餾水反復漂洗去除粘附于卵囊壁的外源菌DNA，獲得高純度的無外源菌DNA污染的球蟲卵囊，對球蟲卵囊基因組的研究具有重要意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種無外源菌DNA污染的球蟲卵囊的制備方法。

為了達到所述的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段：

本發(fā)明的一種無外源菌DNA污染的球蟲卵囊的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)置孢子化卵囊于離心管中離心，棄上清；

(2)卵囊沉淀用PBS離心漂洗2次；

(3)卵囊沉淀用1.2M蔗糖漂浮1次，離心，收集上清液；

(4)上清液用二次蒸餾水稀釋，離心，棄上清；

(5)卵囊沉淀用0.3M蔗糖漂洗2次，離心，棄上清；

(6)卵囊沉淀用PBS離心漂洗3次，棄上清；

(7)卵囊沉淀用體積百分數(shù)為15％的次氯酸鈉溶液處理10-20min，期間多次震蕩，得到卵囊的懸浮液，離心，棄上清；

(8)卵囊沉淀用PBS離心漂洗3次，棄上清；

(9)卵囊沉淀加入細胞裂解液劇烈渦旋10-60s，室溫靜置，離心，棄上清；

(10)卵囊沉淀用TE離心漂洗2次，棄上清；

(11)卵囊沉淀用二次蒸餾水離心漂洗1次，棄上清；

(12)卵囊沉淀用PBS離心漂洗1次，棄上清，沉淀即為純化好的卵囊。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(1)、步驟(2)、步驟(4)以及步驟(6)-步驟(12)中所述的離心是指以3000rpm離心10min，步驟(3)以及步驟(5)中所述的離心是指以2000rpm離心10min。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(7)中卵囊沉淀用體積百分數(shù)為15％的次氯酸鈉溶液處理15min，期間多次震蕩，得到卵囊的懸浮液。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，步驟(9)中所述的細胞裂解液為Cellytic M細胞裂解液。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，方法中所用到的溶液或試劑均采用自制的二次蒸餾水制備，所述的二次蒸餾水是通過利用石英自動亞沸高純水蒸餾器對實驗室常規(guī)超純水進行二次蒸餾以及高壓滅菌后得到的。

在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的球蟲卵囊為雞球蟲卵囊。更優(yōu)選的，所述的球蟲卵囊為柔嫩艾美耳球蟲卵囊。

相較于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：

1、本發(fā)明使用石英自動亞沸高純水蒸餾器，對超純水進行二次蒸餾，高壓滅菌，得到二次蒸餾水，試驗所需試劑的配制均采用此二次蒸餾水，結(jié)果表明，水和配制的試劑中均不存在細菌DNA污染。

2、本發(fā)明對柔嫩艾美耳球蟲卵囊進行了分離純化，通過對卵囊進行1.2M蔗糖漂浮、0.3M蔗糖沉淀、15％(v/v)次氯酸鈉溶液及細胞裂解液處理，使得所獲得的卵囊純度很高，再通過TE和二次蒸餾水反復漂洗之后，不存在外源菌DNA污染。

3、本發(fā)明首次針對球蟲卵囊中存在的外源菌DNA的污染的問題提出了一種制備無外源菌DNA污染的球蟲卵囊的方法，該方法能夠分離純化出不含外源菌DNA的高純度卵囊，極大降低了外源菌DNA污染在球蟲基因組DNA研究中所帶來的實驗誤差和風險，對于球蟲卵囊基因組DNA提取、基因克隆、基因組(重)測序，以及表觀遺傳調(diào)控的研究等具有重要意義。

附圖說明

圖1為實驗室普通超純水PCR檢測結(jié)果；

M：DL2000標準分子量；1：陽性對照(大腸桿菌JM109)；2：實驗室普通超純水；3：陰性對照(Microbial DNA-free water,Qiangen)

圖2為常規(guī)方法純化的柔嫩艾美耳球蟲卵囊；

圖3為常規(guī)方法純化的柔嫩艾美耳球蟲卵囊基因組DNA提取及PCR鑒定結(jié)果；

a：基因組DNA提取結(jié)果。1：基因組DNA；M：DL5000標準分子量；

b：細菌16s RNA基因通用引物擴增結(jié)果。M：DL2000標準分子量；1：PCR擴增結(jié)果

圖4為實驗室自制二次蒸餾水PCR檢測結(jié)果；

M：DL2000標準分子量；1：實驗室自制二次蒸餾水；2：對照(Microbial DNA-free water,Qiangen)

圖5為純化的無外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊(Bar＝10μm)；

圖6為提取的無外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊基因組DNA；

M：DL5000標準分子量；1：基因組DNA抽提結(jié)果；

圖7為細菌16s RNA基因通用引物擴增結(jié)果；

1：抽提的基因組DNA為模板擴增結(jié)果；2：陽性對照(大腸桿菌JM109為模板)；3：以第二次TE漂洗卵囊后的上清為模板擴增結(jié)果；M：DL2000標準分子量

圖8為基因組DNA和陽性對照擴增產(chǎn)物大小差異結(jié)果。

1：基因組DNA擴增產(chǎn)物；2：陽性對照擴增產(chǎn)物；M：DL5000標準分子量

具體實施方式

下面通過實驗并結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，應該理解的是，這些實施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對其進行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

實施例1無外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球蟲卵囊制備方法

1.材料與方法

1.1材料

1.1.1主要設備

石英自動亞沸高純水蒸餾器(精達儀器制造有限公司，SYZ-135型)；

低溫高速離心機(Eppendorf，5810R，A-4-62轉(zhuǎn)頭)；

恒溫搖床(Crystal，IS-RDHⅠ)

1.1.2試驗動物、卵囊

2周齡黃雛雞，飼養(yǎng)于無球蟲環(huán)境；

柔嫩艾美耳球蟲廣東株(實驗室保存)。

1.1.3引物

細菌16s RNA基因通用引物：

27F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG

1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT

1.1.4試劑

二次蒸餾水(使用石英自動亞沸高純水蒸餾器對超純水進行二次蒸餾，高壓滅菌后得到)、PBS(含137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄，PH 7.6，二次蒸餾水配制)、TE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，PH 8.0，二次蒸餾水配制)高壓滅菌；2.5％重鉻酸鉀溶液(w/w，二次蒸餾水配制)；15％次氯酸鈉溶液(v/v，二次蒸餾水配制)；1.2M蔗糖溶液(二次蒸餾水配制，經(jīng)0.22μm濾器抽濾)；細胞裂解液Cellytic M購自SIGMA公司(Cat#:C2978)；DNA提取試劑DNAzol購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司(Cat#:DP3001)；其它試劑均為分析純。

1.2方法

1.2.1柔嫩艾美耳球蟲卵囊收集與孢子化

柔嫩艾美耳球蟲廣東株孢子化完全卵囊感染10只2周齡黃雛雞(5萬感染量/只)，感染168h后殺雞，收集盲腸，縱向剪開腸道，收集腸內(nèi)容物，腸內(nèi)容物用15％次氯酸鈉消化10min后，經(jīng)60目、100目銅篩過濾，濾液離心(3500rpm離心10min)，沉淀加入一定量PBS重懸，3500rpm離心10min，沉淀用100mL2.5％重鉻酸鉀重懸于250mL錐形瓶中，29℃孢子化48h，直至95％以上卵囊完全孢子化。

1.2.2柔嫩艾美耳球蟲卵囊常規(guī)純化處理及基因組DNA提取

柔嫩艾美耳球蟲卵囊常規(guī)處理及基因組DNA提取參照現(xiàn)有的方法進行，所需試劑的配制均采用實驗室普通超純水配制。具體步驟如下：

1)柔嫩艾美耳球蟲卵囊的常規(guī)純化處理

(1)置孢子化完全卵囊(2×10⁸個)于50mL離心管中離心(3000rpm，10min)，棄上清；

(2)卵囊沉淀用PBS離心漂洗2次(3000rpm，10min)；

(3)卵囊沉淀用1.2M蔗糖漂浮1次(2000rpm，10min)，收集上清液；

(4)上清液加4倍體積的水稀釋，離心(3000rpm，10min)，棄上清；

(5)卵囊沉淀用PBS離心漂洗3次(3000rpm，10min)，棄上清；

(6)卵囊沉淀用40mL 15％次氯酸鈉溶液處理15min，期間多次震蕩；

(7)離心(3000rpm，10min)，棄上清；

(8)卵囊沉淀用PBS離心漂洗3次(3000rpm，10min)，棄上清，沉淀即為純化好的卵囊。

2)柔嫩艾美耳球蟲卵囊的基因組DNA提取

(1)純化好的卵囊沉淀用2mL DNAzol重懸，加入適量1.4mm珠子(Ceramic beads，Mo Bio公司，Cat#：13113-325；使用前用20％乙醇浸泡處理，PBS反復清洗)；

(2)機械破碎12～15min，顯微鏡檢查卵囊和孢子囊破碎情況；

(3)卵囊破碎液離心(14000rpm，10min)，去除氣泡和大部分卵囊壁等雜質(zhì)；

(4)收集上清至新的1.5mL EP管中；

(5)離心(14000rpm，10min)；

(6)上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管中，每1mL DNAzol加入500μL無水乙醇，顛倒混勻；

(7)離心(10000rpm，2min)，棄上清；

(8)沉淀用75％乙醇(二次蒸餾水稀釋)漂洗2次(10000rpm，2min)；

(9)第二次次漂洗后，棄上清，室溫晾干1～2min；

(10)50～100μL TE溶液溶解DNA；

(11)DNA濃度測定，并取5μL提取的基因組DNA進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(12)以提取的基因組DNA為模板，以細菌16s RNA基因通用擴增引物為引物進行PCR擴增，膠回收擴增獲得的片段，并進行測序分析。

1.2.3無外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球蟲卵囊純化處理及基因組DNA提取

無外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球蟲卵囊無菌化處理在常規(guī)處理方法中次氯酸鈉處理之后增加了細胞裂解液處理，并增加了TE和二次蒸餾水漂洗去除卵囊表面殘留的外源菌DNA，所需試劑的配制均采用實驗室自制二次蒸餾水。具體步驟如下：

1)無外源菌DNA污染的柔嫩艾美耳球蟲卵囊的純化處理

(1)置孢子化完全卵囊(3×10⁸個)于50mL離心管中離心(3000rpm，10min)，棄上清；

(2)卵囊沉淀用PBS離心漂洗2次(3000rpm，10min)；

(3)卵囊沉淀用1.2M蔗糖漂浮1次(2000rpm，10min)，收集上清液；

(4)上清液用二次蒸餾水4倍稀釋，離心(3000rpm，10min)，棄上清；

(5)卵囊沉淀用0.3M蔗糖漂洗2次(2000rpm，10min)，棄上清；

(6)卵囊沉淀用PBS離心漂洗3次(3000rpm，10min)，棄上清；

(7)卵囊沉淀用40mL 15％次氯酸鈉溶液處理15min，期間多次震蕩，得到卵囊的懸浮液，離心(3000rpm，10min)，棄上清；

(8)卵囊沉淀用PBS離心漂洗3次(3000rpm，10min)，棄上清；

(9)卵囊沉淀加入4mL Cellytic M細胞裂解液劇烈渦旋30s，室溫靜置1min，離心(3000rpm，10min)，棄上清；

(10)40mL TE離心漂洗2次(3000rpm，10min)，棄上清；

(11)二次蒸餾水離心漂洗1次(3000rpm，10min)，棄上清；

(12)PBS離心漂洗1次(3000rpm，10min)，棄上清，沉淀即為純化好的卵囊。

2)柔嫩艾美耳球蟲卵囊的基因組DNA提取

(1)純化好的卵囊沉淀用2mL DNAzol重懸，加入適量1.4mm珠子(Ceramic beads，Mo Bio公司，Cat#：13113-325；使用前用20％乙醇浸泡處理，PBS反復清洗)；

(2)機械破碎12～15min，顯微鏡檢查卵囊和孢子囊破碎情況；

(3)卵囊破碎液離心(14000rpm，10min)，去除氣泡和大部分卵囊壁等雜質(zhì)；

(4)收集上清至新的1.5mL EP管中；

(5)離心(14000rpm，10min)；

(6)上清轉(zhuǎn)移至新的1.5mL EP管中，每1mL DNAzol加入500μL無水乙醇，顛倒混勻；

(7)離心(10000rpm，2min)，棄上清；

(8)沉淀用75％乙醇(二次蒸餾水稀釋)漂洗2次(10000rpm，2min)；

(9)第二次漂洗后，棄上清，室溫晾干1～2min；

(10)50～100μL TE溶液溶解DNA；

(11)DNA濃度測定，并取5μL提取的基因組DNA進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(12)以提取的柔嫩艾美耳球蟲卵囊基因組DNA為模板，以細菌16s RNA基因通用擴增引物為引物進行PCR擴增，同時以大腸桿菌JM109為陽性對照，膠回收擴增獲得的片段，并進行測序分析。

2.結(jié)果

2.1實驗室普通超純水PCR檢測結(jié)果

利用細菌16s RNA基因通用引物對實驗室普通超純水進行PCR檢測，結(jié)果顯 示，普通超純水中存在細菌DNA污染，結(jié)果如圖1所示。

2.2常規(guī)方法純化柔嫩艾美耳球蟲卵囊結(jié)果

利用常規(guī)方法純化處理的柔嫩艾美耳球蟲卵囊，結(jié)果如圖2所示。

2.3常規(guī)方法處理的卵囊基因組DNA提取及PCR鑒定結(jié)果

DNA濃度測定結(jié)果顯示，所提取的常規(guī)方法處理的卵囊基因組DNA濃度為150μg/mL，純度為1.78。用細菌16s RNA基因通用引物進行PCR擴增，擴增結(jié)果顯示，提取的經(jīng)常規(guī)方法處理的卵囊基因組DNA能擴增出一條大小約為1500bp的條帶，且有雜帶，結(jié)果如圖3所示。測序結(jié)果顯示，提取的經(jīng)常規(guī)方法處理的卵囊基因組DNA中含有大腸桿菌基因組DNA污染。

2.4實驗室自制二次蒸餾水PCR檢測結(jié)果

利用細菌16s RNA基因通用引物對實驗室自制二次蒸餾水進行PCR檢測，結(jié)果顯示，自制二次蒸餾水不存在細菌DNA污染，結(jié)果如圖4所示。

2.5無外源菌DNA污染的卵囊純化結(jié)果

顯微鏡下觀察純化后的卵囊，所獲得的卵囊純度高，基本沒有雜質(zhì)，結(jié)果如圖5所示。

2.6無外源菌DNA污染的卵囊基因組DNA提取及PCR鑒定結(jié)果

電泳結(jié)果顯示所提取的卵囊基因組DNA量大，純度高，且無斷裂，結(jié)果如圖6所示；DNA濃度測定結(jié)果顯示，所提取的基因組DNA濃度為181μg/mL，純度為1.771。

細菌16s RNA基因通用引物PCR擴增結(jié)果顯示，本試驗過程處理卵囊所用試劑不能擴增出條帶，柔嫩艾美耳球蟲卵囊基因組DNA和大腸桿菌JM109都能擴增出大小約為1500bp的單一條帶，但條帶大小有一定差異，結(jié)果如圖7和圖8所示，以提取的無外源菌DNA污染的卵囊基因組DNA為模板所獲得片段測序結(jié)果如SEQ ID NO.1所示，以大腸桿菌JM109為模板所獲得片段測序結(jié)果如SEQ ID NO.2所示。

對測序結(jié)果進行Blast分析結(jié)果顯示，從提取的柔嫩艾美耳球蟲基因組DNA中擴增獲得的片段為球蟲頂質(zhì)體基因序列(Eimeria tenella apicoplast gene for 16S small subunit ribosomal RNA,complete sequence,strain:NIAH)，陽性對照為大腸桿菌16s RNA基因序列，PCR鑒定和測序結(jié)果表明，使用本發(fā)明的方法完全消除了外源菌DNA的污染。