本發(fā)明屬于菌株的基因工程改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及克雷伯氏肺炎桿菌突變菌及其生產(chǎn)1,3-丙二醇的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1,3-丙二醇是一種重要的化學(xué)品，其與二元酸聚合可以合成聚酯材料，其中比較重要的是與對苯二甲酸聚合形成聚對苯二甲酸丙二醇酯，是一種性能優(yōu)良的紡織材料。1,3-丙二醇可以通過化學(xué)方法合成，也可以利用生物方法合成。包括丁酸梭菌、弗氏檸檬酸菌、克雷伯氏產(chǎn)酸桿菌、克雷伯氏肺炎桿菌肺炎桿菌等細菌可以利用甘油代謝合成1,3-丙二醇。杜邦公司開發(fā)了利用大腸桿菌工程菌株以葡萄糖為碳源合成1,3-丙二醇的方法。

克雷伯氏肺炎桿菌是一種重要的工業(yè)微生物，用于生物法生產(chǎn)1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙偶姻、2-酮基-D-葡萄糖酸等化學(xué)品的生產(chǎn)菌株?？死撞戏窝讞U菌具有生長旺盛，培養(yǎng)條件粗放等優(yōu)點。克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)1,3-丙二醇具有底物轉(zhuǎn)化率高，產(chǎn)物終濃度高等優(yōu)點。

丙酮酸是生物體的一個中間代謝產(chǎn)物，多種碳源通過代謝都可以合成丙酮酸，而細胞內(nèi)的丙酮酸又可以合成多種其他代謝產(chǎn)物，丙酮酸處于細胞代謝的一個非常重要的位置。在克雷伯氏肺炎桿菌中，丙酮酸是合成乳酸的原料，丙酮酸在乳酸脫氫酶的催化下，還原生成乳酸。在克雷伯氏肺炎桿菌中，丙酮酸是合成乙酰輔酶A的原料，丙酮酸合成乙酰乳酸有兩條途徑，一條是在丙酮酸脫氫酶系的催化下形成乙酰輔酶A，放出二氧化碳，同時還原NAD形成NADH，另外一條途徑是在丙酮酸甲酸裂解酶的催化下形成乙酰輔酶A，同時形成甲酸。這樣在克雷伯氏肺炎桿菌的細胞內(nèi)丙酮酸就處于一個多通道的節(jié)點。

在克雷伯氏肺炎桿菌中，甘油脫水可以形成3-羥基丙醛，3-羥基丙醛經(jīng)過還原形成1,3-丙二醇，另外一部分甘油可以氧化形成二羥基丙酮，進而磷酸 化形成磷酸二羥基丙酮進入酵解途徑，甘油也可以先磷酸化形成甘油-3-磷酸，再氧化形成磷酸二羥基丙酮進入酵解途徑，也形成丙酮酸。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是，提供克雷伯氏肺炎桿菌突變菌及所述突變菌的制備方法和所述突變菌用于發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的應(yīng)用。

本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供一種克雷伯氏肺炎桿菌突變菌，所述克雷伯氏肺炎桿菌突變菌為丙酮酸脫氫酶系活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌，或丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌，或丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活的克雷伯氏肺炎桿菌。

進一步地，所述丙酮酸脫氫酶系活性失活通過丙酮酸脫氫酶系基因中的一個或多個基因失活來實現(xiàn)；所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活通過丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因失活來實現(xiàn)；所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活通過丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因和乳酸脫氫酶ldhA基因同時失活來實現(xiàn)。

所述丙酮酸脫氫酶系活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌的制備方法為：將克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸脫氫酶系的基因中一個或多個基因進行失活來獲得丙酮酸脫氫酶系活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌。所述丙酮酸脫氫酶系是指催化丙酮酸形成乙酰輔酶A，同時釋放出二氧化碳并轉(zhuǎn)化NAD形成NADH的酶系。丙酮酸脫氫酶系也稱為乙偶姻脫氫酶系或丙酮酸脫氫酶復(fù)合物，可以催化乙偶姻分解成乙酰輔酶A和乙醛。所述丙酮酸脫氫酶系由焦磷酸硫胺素依賴的丙酮酸脫氫酶、二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶和二氫硫辛酰胺脫氫酶組成；其中丙酮酸脫氫酶α亞基由acoA基因編碼，丙酮酸脫氫酶β亞基由acoB基因編碼，二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶由acoC基因編碼，二氫硫辛酰胺脫氫酶由acoD基因編碼，其中的調(diào)節(jié)基因為acoK基因。

所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌的制備方法為：將克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因失活來獲得丙酮酸甲酸裂解酶活 性失活的克雷伯氏肺炎桿菌。所述丙酮酸甲酸裂解酶是催化丙酮酸形成乙酰輔酶A，同時形成甲酸的酶。所述丙酮酸甲酸裂解酶由pflB基因編碼。

所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活的克雷伯氏肺炎桿菌的制備方法為：將克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脫氫酶基因失活來獲得丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活的的克雷伯氏肺炎桿菌。所述乳酸脫氫酶由催化丙酮酸還原形成乳酸的酶。乳酸脫氫酶由ldhA基因編碼。

所述基因失活的方法采用同源重組法或Red重組酶介導(dǎo)的同源重組法。

本發(fā)明還提供了克雷伯氏肺炎桿菌突變菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的應(yīng)用，所述克雷伯氏肺炎桿菌突變菌為丙酮酸脫氫酶系活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌。

進一步地，所述丙酮酸脫氫酶系活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌通過丙酮酸脫氫酶系基因中的一個或多個基因失活獲得。

本發(fā)明還提供了克雷伯氏肺炎桿菌突變菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的應(yīng)用，所述克雷伯氏肺炎桿菌突變菌為丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌。

進一步地，所述丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的克雷伯氏肺炎桿菌通過丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因失活獲得。

本發(fā)明還提供了克雷伯氏肺炎桿菌突變菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的應(yīng)用，所述克雷伯氏肺炎桿菌突變菌為丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活的克雷伯氏肺炎桿菌。

進一步地，所述丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性同時失活的克雷伯氏肺炎桿菌通過丙酮酸甲酸裂解酶pflB基因和乳酸脫氫酶ldhA基因同時失活獲得。

本發(fā)明還提供了所述克雷伯氏肺炎桿菌突變菌生產(chǎn)1,3-丙二醇的方法，該方法為：將所述的克雷伯氏肺炎桿菌突變菌接種到以甘油為碳源的培養(yǎng)基中，進行微氧發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇。

進一步地，所述微氧發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇的培養(yǎng)條件為：發(fā)酵液pH值為6.8～7.2，發(fā)酵溫度為30～40℃。

相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果為：

相對于克雷伯氏肺炎桿菌野生菌株，失活丙酮酸脫氫酶酶系的克雷伯氏肺炎桿菌突變菌可以提高1,3-丙二醇的生產(chǎn)強度；失活丙酮酸甲酸裂解酶的克雷伯氏肺炎桿菌突變菌可以提高1,3-丙二醇的底物轉(zhuǎn)化率；同時失活丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶的克雷伯氏肺炎桿菌突變菌可以進一步提高1,3-丙二醇的底物轉(zhuǎn)化率。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細說明。以下采用的試劑和生物材料如未特別說明，均為商業(yè)化產(chǎn)品。

實施例1

利用基因重組方法對克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸脫氫酶系基因進行失活，來實現(xiàn)丙酮酸脫氫酶系活性失活。

本實施例中的克雷伯氏肺炎桿菌采用CGMCC 1.6366的菌株(該菌株也稱為TUAC01、AC01)，CGMCC 1.6366的菌株已經(jīng)在授權(quán)發(fā)明專利ZL201310346916.8中公開，另外在公開文獻(Wei Dong,Wang Min,Shi Jiping,Hao Jian.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.201239:1219–1226)中也已經(jīng)公開該菌株。該菌株是一株用于生產(chǎn)1,3-丙二醇，2,3-丁二醇，乙偶姻和2-酮基葡萄糖酸的菌株。該菌分離自土壤，分離過程及性狀描述見文獻(Hao Jian,等.Isolation and characterization of microorganisms able to produce 1,3-propanediol under aerobic conditions.World Journal of Microbiology Biotechnology 2008,24:1731-1740)。

利用Red重組酶輔助的同源重組方法敲除克雷伯氏肺炎桿菌中aocK基因，來實現(xiàn)消除菌株丙酮酸脫氫酶系活性，步驟如下：

1)利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸酶系及調(diào)控基因序列(acoK，acoA，acoB，acoC，acoD)，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行DNA序列測定。

根據(jù)克雷伯氏肺炎桿菌342(Genbank:NC_011283)基因組信息，設(shè)計丙酮酸脫氫酶系及調(diào)控基因PCR引物，上游引物aco-s： TTAATCCAGTAATTTCATCTCCAGCGCCCG(SEQ ID NO.1所示)，下游引物aco-a：TTATTGATGCAATGGTTGATCGCAGGCCGC(SEQ ID NO.2所示)。

通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，獲得丙酮酸脫氫酶系(acoK，acoA，acoB，acoC，acoD)基因片段，通過TA克隆方法連接到pMD-18T simple質(zhì)粒(商業(yè)產(chǎn)品)上，命名為pMD18T-aco質(zhì)粒，序列測定結(jié)果如(SEQ ID NO.3所示)。其中1-2766為acoK閱讀框，3019-3978為acoA閱讀框，3990-5009為acoB閱讀框，5013-6548為acoC閱讀框，6538-7935為acoD閱讀框。

2)利用步驟1克隆到的基因序列，制備兩側(cè)連有長同源臂中間連接抗性盒的DNA片段。

本步驟中的操作，采用在大腸桿中利用Red重組酶催化，具有短同源臂連接抗性盒的DNA片段與pMD18T-aco質(zhì)粒進行同源重組，獲得pMD18T-aco質(zhì)粒上重組失活的acoK基因，利用該質(zhì)粒作為模板通過PCR擴增具有長的同源臂的DNA片段，該片段兩側(cè)連有與acoK基因同源的序列，中間連接抗性盒。

本步驟操作原理和使用的質(zhì)粒和菌株等材料可參見(Wei et.al.Red recombinase assisted gene replacement in Klebsiella pneumoniae Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology 2012)，具體步驟如下：

a.pMD18T-aco質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化到含有pIJ790質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α-pIJ790中，命名為DH5α-pMD18T-aco。

b.設(shè)計引物acoK-s1和acoK-a1，序列分別為：

CTCAGCCAGTAAAATGCAGGCTTGCGGCGCATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.4所示)和GCTGCAGGCCCAGGACCAACTGGTGGAAATTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.5所示)。

利用引物acoK-s1和acoK-a1，以質(zhì)粒pIJ773為模板擴增出長約1.4Kb的DNA片段A。該片段的兩端分別具有與acoK序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ773質(zhì)粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

c.利用DNA片段A轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α-pMD18T-aco感受態(tài)細胞。利用電擊轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化電壓為2000V，選擇安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量為50mg/L。

DNA片段A兩側(cè)的同源序列與質(zhì)粒pMD18T-aco上的acoK同源部分發(fā)生重組，獲得質(zhì)粒，并命名為pMD18T-ΔacoK質(zhì)粒。

d.利用引物aco-s(SEQ ID NO.1所示)和acoK-a2ATGAAGCCATTGGATTTAGAAGGTCGCCAA(SEQ ID NO.6所示)，以pMD18T-ΔacoK質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲得2.4Kb的DNA片段B。

DNA片段B兩端分別具有acoK基因序列，該序列作為同源臂。DNA片段B中間具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B用于進行CGMCC1.6366染色體上acoK基因重組的線性DNA片段。

3)利用轉(zhuǎn)化將制備的DNA片段B轉(zhuǎn)入到克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中，DNA片段B與染色體上的丙酮酸脫氫酶酶系基因進行同源重組，篩選獲得菌株染色體丙酮酸脫氫酶酶系調(diào)控基因重組失活的菌株，具體步驟如下：

將pDK6-red質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到CGMCC 1.6366中，獲得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，線性DNA片段B電擊轉(zhuǎn)化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受態(tài)細胞。利用安普霉素篩選抗性菌株。命名為Kp-acoK^-。該菌株的丙酮酸脫氫酶系的調(diào)控基因通過同源重組而失活。

實施例2

利用Red重組酶輔助的同源重組方法敲除克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中的aocA基因，來實現(xiàn)菌株丙酮酸脫氫酶系活性失活。

1)制備兩側(cè)連有aocA基因同源臂中間連接抗性盒的DNA片段。

具體步驟如下：

a.設(shè)計引物acoA-s1和acoA-a1，序列分別為：

ATGCTCAGCAAACAGGCGTTATTGCAGGCTATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.7所示)和TCAGTATGAGACATAAACGTCTGTCAGCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO.8所示)。

利用引物acoA-s1和acoA-a1，以質(zhì)粒pIJ773為模板擴增出長約1.4Kb的DNA片段A1。該片段的兩端分別具有與acoA序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ773質(zhì)粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

b.利用DNA片段A1轉(zhuǎn)化實施例1中制備的感受態(tài)DH5α-pMD18T-aco感受態(tài)細胞。利用電擊轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化電壓為2000V，選擇安普霉素抗性的菌株，安普霉素用量為50mg/L。

DNA片段A1兩側(cè)的同源序列與質(zhì)粒pMD18T-acoA上的aco同源部分發(fā)生重組，獲得質(zhì)粒，并命名為pMD18T-ΔacoA質(zhì)粒。

c.利用引物acoA–s2GGCGATACGTTCACCCTGGGCGACCATCTG(SEQ ID NO.9所示)和acoA-a2GTCGTCGTCGCGAATTGACTGGATTAACAG(SEQ ID NO.10所示)，以pMD18T-ΔacoA質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲得2.4Kbp的DNA片段B2。

DNA片段B2兩端分別具有acoA基因外側(cè)相鄰序列，該序列作為同源臂。DNA片段B2中間具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段B2用于進行CGMCC1.6366染色體上acoA基因重組的線性DNA片段。

2)將制備的DNA片段B2轉(zhuǎn)入到克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366中，DNA片段B2與染色體上的丙酮酸脫氫酶系基因進行同源重組，篩選獲得菌株染色體丙酮酸脫氫酶酶系基因重組失活的菌株，具體步驟如下：

將pDK6-red質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到CGMCC 1.6366中，獲得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，線性DNA片段B2電擊轉(zhuǎn)化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受態(tài)細胞。利用安普霉素篩選抗性菌株。命名為Kp-acoA^-。該菌株的丙酮酸脫氫酶系的acoA基因通過同源重組而失活。

實施例3

利用Red重組酶輔助的同源重組方法克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366中失活aocB基因，來實現(xiàn)菌株丙酮酸脫氫酶系活性失活。

操作過程同實施例2，其中引物acoB-s CATTACCGAGTCGGCCATCATCGGAATGGCATTCCGGGGATCCGTCGACC (SEQ ID NO.11所示)和acoB-a ACCACCTCGACCGAGATCCCCTCTCTGGCCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.12所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoB-s2CGGTCAAACGTGCGCGAGAAGGCGGTGGCC(SEQ ID NO.13所示)和acoB-a2CGCCTACCTGAAGCGTCTCACCCTCTCGGG(SEQ ID NO.14所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通過基因敲除工作，獲得丙酮酸脫氫酶系acoB基因突變的菌株，命名為Kp-acoB^-。

實施例4

利用Red重組酶輔助的同源重組方法在克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中失活aocC基因，來實現(xiàn)消除菌株丙酮酸脫氫酶系活性。

操作過程同實施例2，其中引物acoC-s AGTCCGCGGCAGCGGGCGCG GGGATCGTATATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.15所示)和acoC-a CCTTCACCAGCAGGTCATTAACCGAAATCTTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.16所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoC-s2ATGAGCGAAATCAAGACGCTTGAAATGCCA(SEQ ID NO.17所示)和acoC-a2GCACATCGTATTTATCGTGCATAGCTCGTC(SEQ ID NO.18所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通過基因敲除工作，獲得丙酮酸脫氫酶系acoC基因突變的菌株，命名為Kp-acoC^-。

實施例5

利用Red重組酶輔助的同源重組方法在克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中失活aocD基因，來實現(xiàn)消除菌株丙酮酸脫氫酶系活性。

操作過程同實施例2，其中引物acoD-s TTGCCCAGGTCGCTATTAA TCATCGGTTCAATTCCGGGGATCCGTCGACC(SEQ ID NO.19所示)和acoD-a TTACTTGCGTCACCAGGGTCTGGGTATGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.20所示)替代acoA-s和acoA-a。引物acoD-s2ATGCACGATAAATACGATGTGCTGATCATC(SEQ ID NO.21 所示)和acoD-a2TTATTGATGCAATGGTTGATCGCAGGCCGC(SEQ ID NO.22所示)替代acoA-s2和acoA-a2

通過基因敲除工作，獲得丙酮酸脫氫酶系acoD基因失活的菌株，命名為Kp-acoD^-。

實施例6

利用Red重組酶輔助的同源重組方法在克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中失活丙酮酸甲酸裂解酶基因pflB，來實現(xiàn)消除菌株丙酮酸甲酸裂解酶活性。

1)利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌丙酮酸甲酸裂解基因序列(pflB)，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行DNA序列測定。

根據(jù)克雷伯氏肺炎桿菌342(Genbank:NC_011283)基因組信息，設(shè)計丙酮酸甲酸裂解酶基因PCR引物，上游引物pflB-s：ATGTCCGAGCTTAATGAAAAGTTAGCCACA(SEQ ID NO.23所示)，下游引物pflB-a：TTACATGGTCTGAGTGAAGGTACGGGTAAT(SEQ ID NO.24所示)。

通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，獲得丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)基因片段，通過TA克隆方法連接到pMD-18T simple質(zhì)粒上，命名為pMD18T-pflB質(zhì)粒，序列測定結(jié)果如(SEQ ID NO.25所示)。

2)利用步驟1克隆到的基因序列，制備兩側(cè)連有長同源臂中間連接抗性盒的DNA片段。

a.pMD18T-pflB質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化到含有pIJ790質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α-pIJ790中，命名為DH5α-pMD18T-pflB。

b.設(shè)計引物pflB-s1和pflB-a1，序列分別為：CTGGTCTGCCGGATGCTTACGGCCGTGGTCATTCCGGGGATCCGTCGACC

(SEQ ID NO.26所示)和GTGCAGTTTCTGAATTTTCTTCATGAAACGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC (SEQ ID NO.27所示)。

利用引物pflB-s1和pflB-a1，以質(zhì)粒pIJ773為模板擴增出長約1.4Kb的DNA片段C。該片段的兩端分別具有與pflB序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ773質(zhì)粒的安普霉素抗性基因aac(3)IV。

c.利用DNA片段C轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α-pMD18T-pflB感受態(tài)細胞。選擇安普霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，安普霉素用量為50mg/L。

DNA片段C兩側(cè)的同源序列與質(zhì)粒pMD18T-pflB上的pflB同源部分發(fā)生重組，獲得質(zhì)粒，并命名為pMD18T-ΔpflB質(zhì)粒。

d.利用引物pflB-s(SEQ ID NO.23所示)和pflB-a(SEQ ID NO.24所示)，以pMD18T-ΔpflB質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲得2.4Kb的DNA片段D。

DNA片段D兩端分別具有pflB基因序列，該序列作為同源臂。DNA片段D中間具有安普霉素抗性基因aac(3)IV，DNA片段D用于進行CGMCC1.6366染色體上pflB基因重組的線性DNA片段。

3)利用轉(zhuǎn)化將制備的DNA片段D轉(zhuǎn)入到克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC1.6366中，DNA片段D與染色體上的丙酮酸甲酸裂解酶基因進行同源重組，篩選獲得菌株染色體丙酮酸甲酸裂解酶基因重組失活的菌株，具體步驟如下：

將pDK6-red質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到CGMCC 1.6366中，獲得CGMCC1.6366-pDK6-red菌株，線性DNA片段D電擊轉(zhuǎn)化CGMCC 1.6366-pDK6-red感受態(tài)細胞。利用安普霉素篩選抗性菌株。命名為Kp-pflB^-。該菌株的丙酮酸甲酸裂解酶基因通過同源重組而失活。

實施例7

利用Red重組酶輔助的同源重組方法在克雷伯氏肺炎桿菌Kp-pflB^-中失活乳酸脫氫酶基因(ldhA)，來實現(xiàn)同時消除菌株丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶活性。

1)利用PCR擴增克雷伯氏肺炎桿菌乳酸脫氫酶基因序列(ldhA)，通過TA克隆方法連接到克隆載體，并進行DNA序列測定。

根據(jù)克雷伯氏肺炎桿菌342(Genbank:NC_011283)基因組信息，設(shè)計乳酸脫氫酶基因PCR引物，上游引物ldhA-s： GTGTCGTTAATTATCTCGCTCATTGAGAGC(SEQ ID NO.28所示)，下游引物ldhA-a：CTAATGCATCAGGTCGGCGAGCTTATAGAC(SEQ ID NO.29所示)。

通過上述引物，以克雷伯氏肺炎桿菌CGMCC 1.6366基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，獲得乳酸脫氫酶(ldhA)基因片段，通過TA克隆方法連接到pMD-18T simple質(zhì)粒上，命名為pMD18T-ldhA質(zhì)粒，序列測定結(jié)果如(SEQ ID NO.30所示)。其中649-1638為ldhA閱讀框。

2)利用步驟1克隆到的基因序列，制備兩側(cè)連有長同源臂中間連接抗性盒的DNA片段。

a.pMD18T-ldhA質(zhì)粒熱擊轉(zhuǎn)化到含有pIJ790質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α-pIJ790中，命名為DH5α-pMD18T-ldhA。

b.設(shè)計引物ldhA-s1和ldhA-a1，序列分別為：AACTTTGTCTTTCAAAGAGATTCCGCAAATATTCCGGGGATCCGTCGACC

(SEQ ID NO.31所示)和AATCAGACGATAGCGTTCGGGCAGGTTTCATGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQ ID NO.32所示)。

利用引物ldhA-s1和ldhA-a1，以質(zhì)粒pIJ778為模板擴增出長約1.4Kb的DNA片段E。該片段的兩端分別具有與ldhA序列同源的同源臂，中間包含了來源于pIJ778質(zhì)粒的鏈霉素抗性基因aadA。

c.利用DNA片段E轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α-pMD18T-ldhA感受態(tài)細胞。選擇鏈霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，鏈霉素用量為25mg/L。

DNA片段E兩側(cè)的同源序列與質(zhì)粒pMD18T-ldhA上的ldhA同源部分發(fā)生重組，獲得質(zhì)粒，并命名為pMD18T-ΔldhA質(zhì)粒。

d.利用引物ldhA-s(SEQ ID NO.28所示)和ldhA-a(SEQ ID NO.29所示)，以pMD18T-ΔldhA質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，獲得2.4Kb的DNA片段F。

DNA片段F兩端分別具有l(wèi)dhA基因序列，該序列作為同源臂。DNA片段F中間具有鏈霉素抗性基因aadA，DNA片段F用于進行Kp-pflB^-染色體上 ldhA基因重組的線性DNA片段。

3)利用轉(zhuǎn)化將制備的DNA片段F轉(zhuǎn)入到克雷伯氏肺炎桿菌Kp-pflB^-中，DNA片段F與染色體上的乳酸脫氫酶(ldhA)基因進行同源重組，篩選獲得菌株染色體乳酸脫氫酶基因重組失活的菌株，具體步驟如下：

將pDK6-red質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Kp-pflB^-中，獲得Kp-pflB^--pDK6-red菌株，線性DNA片段F電擊轉(zhuǎn)化Kp-pflB^--pDK6-red感受態(tài)細胞。利用鏈霉素篩選抗性菌株。命名為Kp-pflB^--ldhA^-。該菌株的乳酸脫氫酶基因和丙酮酸甲酸裂解酶基因通過同源重組而同時失活。

實施例8

將實施例1-7中獲得的丙酮酸脫氫酶系活性失活的菌株、丙酮酸甲酸裂解酶活性失活的菌株、丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脫氫酶活性同時失活的菌株進行1,3-丙二醇發(fā)酵實驗。

1)種子培養(yǎng)，將構(gòu)建的突變株和出發(fā)野生型菌株接種到250ml錐形瓶中，瓶中含有50ml液體種子培養(yǎng)基。種子培養(yǎng)基成分為：蛋白胨5g/L，NaCL 5g/L，酵母粉10g/L。將種子瓶放置在30℃震蕩培養(yǎng)過夜。

2)發(fā)酵培養(yǎng)，將一瓶種子接種到5L發(fā)酵罐中，罐中裝有3L發(fā)酵培養(yǎng)基，通風(fēng)0.5L/min，攪拌轉(zhuǎn)速200轉(zhuǎn)/min，利用堿液調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值為7.0，37℃培養(yǎng)12小時。

發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：硫酸銨4g/L；磷酸氫二鉀0.69g/L；磷酸二氫鉀0.25g/L；硫酸鎂0.2g/L；酵母粉1.5g/L；甘油30g/L；微量元素1.0ml/L；鐵溶液1.0ml/L。

其中，微量元素為：硫酸錳100mg/L；氯化鋅70mg/L；鉬酸鈉35mg/L；硼酸60mg/L；氯化鈷200mg/L；硫酸銅29.28mg/L；氯化鎳25mg/L；濃鹽酸(37％)0.9ml/L。

鐵溶液為：每升水中加入硫酸亞鐵5.0g，37％的濃鹽酸4ml。

定時取樣，測定發(fā)酵液中各組分含量，甘油消耗完全為發(fā)酵終點。測定方法采用液相色譜法測定，利用HPX-87H色譜柱對發(fā)酵液組分進行分離，利用紫外和視差檢測器檢測。流動相0.05mol/L硫酸水溶液，流速0.8ml/min， 柱溫箱60℃。各菌株發(fā)酵結(jié)果如表1所示。

表1，各菌株發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇結(jié)果

由表1中數(shù)據(jù)可以看出，失活丙酮酸脫氫酶系活性的突變菌株與出發(fā)野生菌株相比較，1,3-丙二醇的生產(chǎn)強度增大了0.26-0.27g/Lh，但是底物甘油向1,3-丙二醇的質(zhì)量轉(zhuǎn)化率降低了2.5-3％。失活丙酮酸甲酸裂解酶活性的突變株與出發(fā)野生菌株相比較，1,3-丙二醇的生產(chǎn)強度降低了0.14g/Lh，但是底物甘油向1,3-丙二醇的質(zhì)量轉(zhuǎn)化率增加了2.3％。同時失活丙酮酸甲酸裂解酶活性和乳酸脫氫酶活性的突變株與出發(fā)野生菌株相比較，1,3-丙二醇的生產(chǎn)強度降低了0.09g/Lh，但是底物甘油向1,3-丙二醇的質(zhì)量轉(zhuǎn)化率增加了4.6％。

上述僅為本發(fā)明的部分優(yōu)選實施例，本發(fā)明并不僅限于實施例的內(nèi)容。對于本領(lǐng)域中的技術(shù)人員來說，在本發(fā)明技術(shù)方案的構(gòu)思范圍內(nèi)可以有各種變化和更改，所作的任何變化和更改，均在本發(fā)明保護范圍之內(nèi)。

<110> 中國科學(xué)院上海高等研究院

<120> 克雷伯氏肺炎桿菌突變菌及其制備方法和應(yīng)用

<130> 2015

<160> 32

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaatccagt aatttcatct ccagcgcccg 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ttattgatgc aatggttgat cgcaggccgc 30

<210> 3

<211> 7935

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎桿菌

<400> 3

ttaatccagt aatttcatct ccagcgcccg actcatcgct tgagtgcggc tattcacttt 60

aagcttcgcg tagatgtttt tgatgtgcca tttgaccgtc tcggcagaaa tagctaggga 120

gcgggcgatt tctttgttca tctgaccttc agcgatcagc tgtaatatct gaaattctcg 180

ctcgctgagt tccccatgaa tatcggggct tccactattt agcggtgttc tgtctgcagg 240

cgcgcgcttg tctgcccagg gttcatggac tatcccttcc tctgtacaag ccgaagagaa 300

atcattcata ccgataagca aaggttgcaa ggtatcgcca gcgtcaagaa agaggccctt 360

gagatgctgt tgttcagcca gcagcagcac tggttgaaat gtcgtgcgcg cagcggcagt 420

tttgccgctg ttccacaagg ctaatgacca gagcgtacgc agacgcgctg cggttaacct 480

gtccccccgg ctttcctgat cggagaccat ctcagccagt aaaatgcagg cttgcggcgc 540

ctggcctctg gcgagaagaa gccggctgcg gctaagggat gcagacataa cgatggcgcg 600

ttggcaggga tgttcggcat ccattctgaa gctggcggcc atttgttcaa gctgccgttg 660

cagttgctct gcgccggtga aattgccgcg ctgcaggcgc accctcacct gctcggctaa 720

caacatggcc tggagccgtt gccagccgcg agacaccgca aggcgctgcg catgctccag 780

caatcgctcg gcctcatagg gcatatcgct atctaaggcc tgacgcgcga gataggtata 840

gcaacgactc agcgcgtcgg gtggactgaa ccggtcgatg aattcgagcc ggtcggctaa 900

cagatgctcg ggcgagtcac ccctctgaca ttcataggct atctccgcca gcagcggcgc 960

cagcgtcgcg ccactggtcg actgggtgcc ggtataacat tcagcctggc gcaacgtttt 1020

ctctgcgtac cacccggctt ttcccagatc gccctgacaa agatgacact gggcaatgat 1080

aaacgcgcga tataccgaga caaacagatt atctaaagga ctttccggag agggcatatg 1140

ctgttgaacc tccagcgcgt cgtgatagcg ctggttaaca acatggcaat agctgagaat 1200

attgcatatc agaccatcaa cccaggtgtc gccgcagggc acttcggcca gcaacggctg 1260

aacaatagcc agactctccg ggatgttttc agcaaaggct tcgcaaattg cccgcacaac 1320

gcgcaattta caccaggtgc tgcgggttaa atcatcacgg tgatgaagca ccatctgatc 1380

gaggttatca agcagctgcc tcgactcatc aaagtggaaa taatgcgcca gtgcccaggc 1440

caggttaatt tgcaggtcaa tgcgcgcagg atcggtgctg ggcggtaaat gatgcatcca 1500

tgagatcagg gtatcgatat ccccttcttc cgccagtgac tgagcgcttg cgccgtcctg 1560

cccggggcta tgcaccggct tgcctgcgct gagcgcatgg cgtaccgcct cagaccacag 1620

cttctgttcg acgaaccaat gactggctaa ttcatgtagc tgtttgcgat caatagcgtt 1680

gttctgctgc agcatggtcc gaagattttc ctgcaacaga ggatggtagc ggaaccagta 1740

gccttgttcg tcaagggctg acaaaaaaag gttgtgtcgc tcaatccatg ccagcatcgc 1800

tttactatca tcacgtccag tcactgcatt gcataattcg gcatttaacc gactgaggaa 1860

ggacgttttc accagaaaat caagaacctg ttccggcagc ggatccagta ccacctcttt 1920

cagatagcgg gcaatagacc gtgttcctcc atgcatattg cgcaacagat gctcgggatc 1980

atgctgtaat tctgcggaca atgaagcgat cttcatccct gcaatccagc cctctgtcac 2040

ggactgtagc cgctgtgcat ggtggttgct gaggggtagc gcaaccgtgc ggctaaaata 2100

gtgttttgtt tcttcgagcg tgaattgcag gtctcgatca tagatttcca ccagttggtc 2160

ctgggcctgc agctggctca gcgcaagatt cgggtggaaa cggctgccaa tgatcagatg 2220

caaagcggca ggcgcatgct tgagtaaata ccccagcgct tcatagaccc cacgatcgtt 2280

aatcacgtgg aagtcgtcga tgatcaggta tacgtcatgc gggcaatagt gtagctggtt 2340

aatgagcccg gccagcagtt gctcggagct ggagagcttc tgttcttcca tgtcacgcca 2400

gaaatcggcg tcccagtcag catagagtgg acgcaatgct tgcagcagat aaggaataaa 2460

ctgccatacg tcatcatcat cctcatcgag gctcagccag gcgatacgtt caccctgggc 2520

gaccatctgc tgatgccatt gcgccaacag cgtggttttg ccaaatccag cgccggcgca 2580

gacgacgccc aaccggcact gctgaacggg attgagaagc tgaagaagcc gggggcgctc 2640

cagcaattgt atcgaggagc gaggcgggac gaatttggtc aggattaacg gcaagcctcg 2700

cgtcagccgc aatggcccgg agaccagtga gggtgattgg cgaccttcta aatccaatgg 2760

cttcatccgt ggtgtctact cgctttgttt tttttcaatt gtacgccagc caccgggatg 2820

acatggggca ggcaaacttt atggctacac aaaatttaga aagtttgacc tcaagcatga 2880

aaacccccac ctaccccccc atgaaggtgg cttcgcactc tctctaaccg ctcgtagatt 2940

cattgcatgg gtgtggccag ggttattcgc cctgtctgtt ggccccgcct ggtgaccttt 3000

attgaggaga attaaacgat gctcagcaaa caggcgttat tgcaggctta ccgcaagatg 3060

cgggagatca ggacctttga agagcggttg catcaggaaa ataccagcgg tgatattccc 3120

ggcttcattc acctttatac cggtgaggag gccatcgcgg tgggggtctg cgaaaattta 3180

acgagcgcag attttattgg ttcaacacac cgtggacatg gccactgtat tgctaaaggg 3240

tgcgacattc acggcatgat ggccgaaata ttcggtaagg acagcgggtt atgtcgcggt 3300

aagggtgggt cgatgcacat tgccgatctg tcgaaaggaa tgctgggagc gaacgctatc 3360

gttgggggag cccctcccct ggccatcggc gccgcgctaa cggcaaagac gctaaaaacc 3420

ggcaacgtcg gtgtctcttt tacgggcgat gggggttcta atcagggcct ggtctttgaa 3480

gccatcaata tggccgtcgt gctccagctc ccagcggtct ttattttcga gaacaacggt 3540

tacggcgaag ggaccggtca tgactacgcc gtgggtgggc gtgatatcgc ccgacgcgcc 3600

gctggcttcg gcctgccggc agtgaccgtt gatggcaccg atttctttgc cgtttatgag 3660

gccacttcag aggcggtcaa acgtgcgcga gaaggcggtg gcccaagcgt cattgaggcc 3720

aaagccttcc gctggcacgg tcattttgag ggggatcccg cgctataccg cgcggaaggt 3780

gaagtgcaac gcctgcgtga acaacatgat ccgctgaaga ttttcaccgc taaggtcaaa 3840

cagcatatca ccccggaaga actggcagcg attgacgagg aagtcgaagc ccttgtcaac 3900

gatgcggtat tgaaggcccg cgccgctgcc tatccggctc cggaagacct gctgacagac 3960

gtttatgtct catactgagg gtgataacta tggcgattaa aacctatcgt gaagcggtca 4020

aggaagccct ggctcaggaa atggaacgcg atgaacgcgt ggtgctcatc ggtgaagatt 4080

tgcgtggcgg tcatggcgga aatgcgcccg aagaggcgaa gatagaagcc tttggcggtg 4140

tgctcggcgt cactaaaggg ctgtggacgc agttcggctc cgatcgggtg atcgacacgc 4200

ccattaccga gtcggccatc atcggaatgg cggccggcgc cgcagcgacg ggtctgcggc 4260

cggtcgcgga attgatgttc atggattttt ttggcgtgag tcacgatgcg ctgtacaacc 4320

aggcggctaa gttccgctac atgtttggtg gcaaagccag agccccgctg gtgatgcgag 4380

ggatgatcgg cgcggggttt tccgccgcgg cccagcattc acagtcaccc tataatatct 4440

ttgccaccac gccagggctg aaggtggtgg tgccctcgac gccttatgac gtcaaaggtc 4500

tgttaatcca gtcaattcgc gacgacgacc cggtggtttt ctgcgagcat aaaatgctgt 4560

acgacctcaa gggcgaggta ccggacgaga gctataccct cccgctaggt gtagccaact 4620

atacccgcga aggagaagac gtcaccatca ttgcgttgtc ggcaatggtg cataaagcca 4680

atcaggtggc ggacaaactg gccagagagg ggatctcggt cgaggtggtc gacccgcgga 4740

ccatttcgcc gctggatgag gaagggattc tggaatcggt ggcgtccacg gggcgggtag 4800

tgattgtcga cgaatccgcg gcacgcttcg gttttgcgca tgatgtcgcg gcgctgatcg 4860

cgtcccaggc attccatttc ctcaaagcgc ccgttctgct ggtgacgccg ccacacacgc 4920

cggtcccgtt ctcccctgct ctcgaaaaac tctggatccc tggcgtagaa cgtatcgaag 4980

cagccgtccg tcaagtgctg gaggattaac ctatgagcga aatcaagacg cttgaaatgc 5040

caaagtgggg gctttccatg gaagaaggct tgctcgctcg gtgggcaatc caggagggtg 5100

acagcttcac cccagggcag gaaatctgtg agattgaaac cagtaaaatc gtcaatgtgc 5160

tggaggcccc ctttgccggt acgttacgtc ggatactcgc ccgagagggt gagacgcttc 5220

aggtaggcgc cgtgctggcc ctggcggctg acgcttcggt cagcgatgct gacctggacg 5280

aattcgctgc cactctggct acggcgaaat ccgcagcccc tggcacggag gctgccgcgc 5340

cggacgtagc ggcacaggca ggcgctaagc caccttccgt tgtttcgccg ccatccaaca 5400

gccccgagcc ccccgttggg cagaccgaca tccccgtcag tctgcaaggc gtgaccgatg 5460

tgactcaggt taatgccacg ccccatgcgt tacgactctc tgcccgctgg ggtgtcgacc 5520

tgaaaaaagt ccgcggcagc gggcgcgggg atcgtatctc tgtttctgat ctggaaagcg 5580

cgatccttgc cgccggcggt cgcctggcct ccccgacgcc ccctgttcgt cgcagcaaag 5640

cgccccgctc gcatgccgat gacagccagg tatcggccac cccgctggcg cgccgtctgg 5700

ccggcaagct gggtatcaac ttgcatgact gccgaagcag cggttcacgc ggccgggtga 5760

gtcgcgatga tgtgctggcc gcggcgttgt tactcgacga gcacccgcag accagcccgg 5820

tacaggagag taccccggta ccctatgaaa gcatccccat gtccggtatg cggcgggcta 5880

tcgcctctcg cctgcaaacg tccaagcaac agtctcccca tttccgtttg agcgtcgatc 5940

tcgatctgga acgactgtta gcgctacgtc aggaaattaa ccgcgaagta cccggcgtca 6000

agatttcggt taatgacctg ctggtgaagg cctgcgccct ggcgctggtg gccgtgcctg 6060

acgtcaacat tcagtttgat gaagcgacac aaagtatccg ccgctttgcg gatgccgaca 6120

tttcagtggc cgttgcgctg cctgccgggc taattacccc tattgttcgc tcggcgaacc 6180

ggaaatcaat tagcgacata tcgaacgaaa ttcactcgct ggtgaccagg gccaaagcgg 6240

gcacgctgaa gccggaagag ttccaggggg ggacctttag cgtgtcaaat ctggggatgc 6300

ttggcgtccg gcagtttgac gccatcatca atccaccgca aagtgcaatc ctcgccattg 6360

gcgccggcga aatgcgggcg gtagtacgcg acgggcaaat cgtcgcgcgc cagcaaatga 6420

cggtatcgct atcctgcgat caccgggtta tcgatggcgc ggcaggtgcg gcttttctcc 6480

gggaactcag gcgactggct gaaaccccaa ccttgatgtt tatccaggag acgagctatg 6540

cacgataaat acgatgtgct gatcatcggc ggtggtcctg ggggatatgt ggccgccatc 6600

cgtgccggcc agctagggct tcgtaccgca ttagtggaga aacaacatct gggcggcatc 6660

tgcctgaact ggggatgcat tccaaccaag gcgctgttgc atggcgctga ggtcgcgcac 6720

agtatcaccc atgccagtca gctgggcatc agcgtgggtg aggtgaacat cgatctgcag 6780

aaactggtgc agtttagccg taccgtatcg caacagctca ccggcggggt ggcgtacctg 6840

ttgaagaaaa atggcgtgca ggtcattgat ggcaccgcgc ggctgcgcgg caaggggcaa 6900

ataacggtcg aggatgcccg aggggagacg cgcgattacc gggccgatca cgtgatcctg 6960

gccacgggcg cccgaccacg cgcattacca ggcatcgcgc cagatggcga atatatctgg 7020

acctatttcg aggcgctgcg gcctaagcta ttgcccaggt cgctattaat catcggttca 7080

ggggcgattg gcgtcgagtt cgccagcctt tataacgatc tgggctgtaa agtgacgctg 7140

gtcgagctgg cgtcgcagtt tttgccagtg gaagatgccg aggtgtctgc agcagtgcgt 7200

aagtcattcg aaaaacgcgg tattcaggtc catacccaga ccctggtgac gcaagtaaag 7260

ctcaccggga ccggggtgcg ctgcaccatg aaaaacaccg gcgccgaata ttctcaggac 7320

gtcgaacgtg tgctgctggc ggtcggcgta cagccgaata ttgaagatct ggggctggaa 7380

acgctgggcg tcgagttaga ccgcggtttt atcaagacgg acaccgcttg tcgtactaac 7440

gtattcgggc tgtatgccat cggcgatgta gccggcccgc cgtgcctggc gcacaaggcc 7500

agccacgaag gcgtgctctg cgttgagaca ctggctggtg tcgaaggcgc ccacccgctt 7560

gatcgcgact atgtgcccgg ttgcacgtat gcccggcccc aggttgccag tctgggcctg 7620

acggaatcga cggccctggc caggggacgg cccgtcagga tcggtaagtt ctcctggcag 7680

aataatggta aggcgctggc cagcggcgag acagagggtt ttgtgaagac gattttcgat 7740

gctgaaaccg gcgagttgct gggcgcgcat atggttggcg cacaggtcac ggaactgatc 7800

caggggtttg gcatcgcccg tcacctggag gccacagatg aaagtctcct gtcgatgatc 7860

ttcgcgcatc caacactttc cgaagcgatg catgaatcca tcctcgcggc ctgcgatcaa 7920

ccattgcatc aataa 7935

<210> 4

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctcagccagt aaaatgcagg cttgcggcgc attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 5

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gctgcaggcc caggaccaac tggtggaaat tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atgaagccat tggatttaga aggtcgccaa 30

<210> 7

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

atgctcagca aacaggcgtt attgcaggct attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 8

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tcagtatgag acataaacgt ctgtcagcag tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggcgatacgt tcaccctggg cgaccatctg 30

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gtcgtcgtcg cgaattgact ggattaacag 30

<210> 11

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cattaccgag tcggccatca tcggaatggc attccgggga tccgtcgacc cattaccgag 60

tcggccatca tcggaatggc attccgggga tccgtcgacc 100

<210> 12

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

accacctcga ccgagatccc ctctctggcc tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cggtcaaacg tgcgcgagaa ggcggtggcc 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cgcctacctg aagcgtctca ccctctcggg 30

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

agtccgcggc agcgggcgcg gggatcgtat attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ccttcaccag caggtcatta accgaaatct tgtaggctgg agctgcttc 49

<210> 17

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgagcgaaa tcaagacgct tgaaatgcca 30

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

gcacatcgta tttatcgtgc atagctcgtc 30

<210> 19

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ttgcccaggt cgctattaat catcggttca attccgggga tccgtcgacc 50

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ttacttgcgt caccagggtc tgggtatggt gtaggctgga gctgcttc 48

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

atgcacgata aatacgatgt gctgatcatc 30

<210> 22

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

ttattgatgc aatggttgat cgcaggccgc 30

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca 30

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 24

ttacatggtc tgagtgaagg tacgggtaat 30

<210> 25

<211> 2283

<212> DNA

<213> 克雷伯氏肺炎桿菌

<400> 25

atgtccgagc ttaatgaaaa gttagccaca gcctgggaag gttttgcgaa aggtgactgg 60

cagaatgaag tcaacgtccg tgactttatt cagaaaaact acaccccata tgaaggcgac 120

gaatccttcc tggctggcgc gactgaagcg accaccaagc tgtgggacag cgtaatggaa 180

ggtgtaaaac aggaaaaccg cactcacgcg cctgttgatt ttgacactgc cctggcctcc 240

accatcacct ctcacgacgc aggctatatc gagaaaggtc tggaaaaaat cgttggtctg 300

cagaccgaag cgccgctgaa acgtgcgatc atcccgttcg gtggtattaa aatggttgaa 360

ggttcctgca aagcgtacaa tcgcgagctg gacccgatgc tgaaaaaaat cttcactgag 420

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<213> 克雷伯氏肺炎桿菌

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