本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種高效分離體外誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞和RPC的方法。

背景技術(shù)：

視網(wǎng)膜變性疾病是全球首要的致盲原因。在該疾病中，視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)的損傷和功能異常導(dǎo)致光感受器細(xì)胞(photoreceptor)變性，最終影響病人視力直至失明。由于RPE和光感受器細(xì)胞的不可再生，至今在臨床上缺乏對(duì)這類疾病的有效治療措施。相較于其他治療方法，細(xì)胞治療對(duì)視網(wǎng)膜退行性疾病的治療有更大的前景。

由于胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)具有無限增殖和分化為各種細(xì)胞的能力，因此可以作為理想的移植細(xì)胞的來源。已有報(bào)道證實(shí)ESCs-RPE應(yīng)用于人類視網(wǎng)膜退行性疾病臨床研究的可行性與安全性，盡管病人術(shù)后視力與正常生活的要求還有很大差距。那么，一套穩(wěn)定有效的體外全能干細(xì)胞向RPE細(xì)胞分化的方法對(duì)視網(wǎng)膜退行性疾病的治療和制藥研究顯得尤為重要。

在過去的十幾年間，多種方法被報(bào)道可以控制胚胎干細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分化，并且在多種動(dòng)物病變模型中發(fā)揮保護(hù)作用。但是這些報(bào)道的方法多數(shù)在后期形成含有色素團(tuán)塊的混合細(xì)胞群體，一般采用機(jī)械挑傳方法分離細(xì)胞。這種方法存在耗時(shí)長(zhǎng)、批次間差異大和細(xì)胞得率低等問題。

因此，需要一種分離體外誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)元前體細(xì)胞(neural retina progenitor cells,RPC)的方法，可以同時(shí)得到成熟的RPE細(xì)胞和RPC細(xì)胞，并且能夠做到方法簡(jiǎn)單、時(shí)間快捷和細(xì)胞得率高等優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種高效分離體 外誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞和RPC的方法，本發(fā)明方法可以簡(jiǎn)單、有效的實(shí)現(xiàn)兩種細(xì)胞的分離純化。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)：

一種高效分離體外誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigmented epithelium,RPE)和視網(wǎng)膜神經(jīng)元前體細(xì)胞(neural retina progenitor cells,RPC)的方法，包括以下步驟：

a、對(duì)人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)來源的具有色素團(tuán)塊的混合細(xì)胞進(jìn)行酶處理成單細(xì)胞，離心后棄上清，添加培養(yǎng)基重懸并接種于培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)；

b、培養(yǎng)1天后形成黑白混合的細(xì)胞懸球，定期換液并培養(yǎng)；

c、培養(yǎng)7天混合的細(xì)胞懸球會(huì)形成黑白兩個(gè)部分，然后機(jī)械分離得到兩種類型的細(xì)胞懸球；

d、收集不同細(xì)胞懸球并分別接種到培養(yǎng)皿中，放置培養(yǎng)并定期換液即可分別得到成熟的RPE細(xì)胞和RPC。

優(yōu)選的，步驟a中所述hESCs來源的具有色素團(tuán)塊的混合細(xì)胞為hESCs通過誘導(dǎo)分化或者自發(fā)分化的方法得到的；所述酶處理成單細(xì)胞為應(yīng)用0.25％胰酶在37℃條件下處理20分鐘，并用移液器吹打成單細(xì)胞然后終止胰酶反應(yīng)；所述離心后棄上清為用水平離心機(jī)1800rpm離心5分鐘后棄掉上清；所述培養(yǎng)基成分為：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，血清替代物的體積分?jǐn)?shù)為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L。所述培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行；所述培養(yǎng)皿為非粘附的細(xì)菌培養(yǎng)皿。

優(yōu)選的，步驟b中所述定期換液為每天換液，收集細(xì)胞懸球至15毫升離心管，用水平離心機(jī)400rpm離心3分鐘，棄上清加入新鮮培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

優(yōu)選的，步驟c中所述形成黑白兩個(gè)部分為混合懸球中的黑白細(xì)胞分別聚集并分離形成兩個(gè)粘連的黑色懸球與白色懸球；所述培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行；所述機(jī)械分離為用滅菌的刀片在黑白懸球的粘連出切割使兩懸球分離。

優(yōu)選的，步驟d中所述收集不同細(xì)胞懸球?yàn)橛靡埔浩鞲鶕?jù)顏色收集黑色與白色 兩種細(xì)胞懸球；所述培養(yǎng)皿為100ug/ml Matrigel包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿；所述定期換液為隔天換液；所述成熟的RPE細(xì)胞為具有鵝卵石樣形態(tài)，色素積累，表達(dá)相關(guān)蛋白并具有吞噬功能的細(xì)胞；所述培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行；所述RPC為表達(dá)相關(guān)蛋白的神經(jīng)元細(xì)胞。

本發(fā)明提供了一種分離體外誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞和RPC的方法，可以簡(jiǎn)單，有效的從hESCs來源的混合細(xì)胞群體中分離純化得到大量成熟的RPE細(xì)胞和RPC。與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明適用于hESCs來源的含有色素團(tuán)塊的混合細(xì)胞；相較于傳統(tǒng)的機(jī)械分離法，本發(fā)明方法簡(jiǎn)單，重復(fù)性好，成功率高，細(xì)胞純度和得率高，并且同時(shí)分離得到RPE細(xì)胞和RPC。

附圖說明

圖1為本發(fā)明人胚胎干細(xì)胞系H1來源的含色素的混合分化細(xì)胞及酶處理后懸浮培養(yǎng)的示意圖；

圖2為本發(fā)明黑色與白色細(xì)胞懸球機(jī)械分離并收集的示意圖；

圖3為本發(fā)明黑白懸球分別貼壁并長(zhǎng)期培養(yǎng)的的細(xì)胞形態(tài)示意圖；

圖4為本發(fā)明分離純化的H1來源RPE細(xì)胞形態(tài)及鑒定示意圖；

圖5為本發(fā)明分離純化的H1來源的RPC的免疫熒光鑒定示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。

實(shí)施例

本實(shí)施例為高效分離體外誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)元前體細(xì)胞的方法。

本實(shí)施例中，所述混合細(xì)胞為多干細(xì)胞分化得到的含有色素團(tuán)塊的混合細(xì)胞群體，均能利用本方法實(shí)現(xiàn)分離目的。

本實(shí)施例中，所述分離細(xì)胞的方法包括如下步驟：

a.對(duì)hESCs來源的具有色素團(tuán)塊的混合細(xì)胞進(jìn)行酶處理成單細(xì)胞，離心后棄上清，添加培養(yǎng)基重懸并接種于培養(yǎng)皿中懸浮培養(yǎng)；

本步驟中所述hESCs為第50代的H1細(xì)胞系；所述具有色素團(tuán)塊的混合細(xì)胞為通過定向誘導(dǎo)分化hESCs45天后得到的，如圖1A；所述酶處理成單細(xì)胞為應(yīng)用 0.25％胰酶在37℃條件下處理20分鐘，并用移液器吹打成單細(xì)胞然后終止胰酶反應(yīng)；所述離心后棄上清為用水平離心機(jī)1800rpm離心5分鐘后棄掉上清；所述培養(yǎng)基成分為：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清替代物、非必須氨基酸、青霉素、鏈霉素、谷氨酰胺及β-巰基乙醇，其中，血清替代物的體積分?jǐn)?shù)為20％，非必須氨基酸的濃度為0.01mmol/L，青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為100ug/ml，谷氨酰胺的濃度為1mmol/L，β-巰基乙醇濃度為0.1mmol/L；所述培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行；所述培養(yǎng)皿為非粘附的細(xì)菌培養(yǎng)皿。

b.培養(yǎng)1天后形成黑白混合的細(xì)胞懸球，定期換液并培養(yǎng)；

本步驟中所述一天后形成的黑白細(xì)胞混合的細(xì)胞懸球如圖1B所示；所述定期換液為每天換液，收集細(xì)胞懸球至15毫升離心管，用水平離心機(jī)400rpm離心3分鐘，棄上清加入新鮮培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

c.培養(yǎng)7天混合的細(xì)胞懸球會(huì)形成黑白兩個(gè)部分，然后機(jī)械分離得到兩種類型的細(xì)胞懸球；

本步驟中所述形成黑白兩個(gè)部分為混合懸球中的黑白細(xì)胞分別聚集并分離形成兩個(gè)粘連的黑色懸球與白色懸球如圖1C和1D所示3天和7天的細(xì)胞懸球狀態(tài)；所述培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行；所述機(jī)械分離為用滅菌的刀片在黑白懸球的粘連出切割使兩懸球分離如圖2A和2B。

d.收集不同細(xì)胞懸球并分別接種到培養(yǎng)皿中，放置培養(yǎng)并定期換液即可分別得到成熟的RPE細(xì)胞和RPC。

本步驟中所述收集不同細(xì)胞懸球?yàn)橛靡埔浩鞲鶕?jù)顏色收集黑色與白色兩種細(xì)胞懸球如圖2C和2D；所述培養(yǎng)皿為100ug/ml Matrigel包被的細(xì)胞培養(yǎng)皿；所述定期換液為隔天換液；所述成熟的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞為具有鵝卵石樣形態(tài)，色素積累，表達(dá)相關(guān)蛋白并具有吞噬功能的細(xì)胞，如圖3A和3C為黑色細(xì)胞懸球貼壁1周和3周的細(xì)胞形態(tài)圖；所述培養(yǎng)是在37℃和5％CO₂培養(yǎng)箱中進(jìn)行；所述視網(wǎng)膜神經(jīng)元前體細(xì)胞為表達(dá)相關(guān)蛋白的神經(jīng)元細(xì)胞，如圖3B和3D為白色細(xì)胞懸球貼壁1周和3周的細(xì)胞形態(tài)圖。

進(jìn)一步對(duì)分離純化的H1來源的RPE細(xì)胞(H1-RPE)進(jìn)行免疫組化鑒定，發(fā)現(xiàn)H1-RPE細(xì)胞具有典型的鵝卵石樣形態(tài)和色素積累；表達(dá)成熟的RPE細(xì)胞相關(guān)蛋白ZO-1，并且具有吞噬外節(jié)的能力，如圖4。對(duì)分離純化的H1來源的視網(wǎng)膜神經(jīng)元前體細(xì)胞進(jìn)行免疫組化鑒定，發(fā)現(xiàn)白色懸球在貼壁培養(yǎng)4周后表達(dá)視網(wǎng)膜神經(jīng) 元相關(guān)蛋白GFAP(膠質(zhì)神經(jīng)元標(biāo)記)，Rho，Crx和Recoverin(視桿細(xì)胞標(biāo)記)，如圖5。

最后說明的是，上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā)明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。