本發(fā)明屬于生物發(fā)酵領(lǐng)域，特別涉及一種羊肚菌的深層發(fā)酵培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

羊肚菌(Morchella)，又名羊肚菜，營養(yǎng)相當豐富，含多種人體必需的氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等，并且味道鮮美，是一種優(yōu)良的食用菌。此外，羊肚菌還含有豐富的抑制腫瘤的多糖及抗氧化作用的硒，羊肚菌甘寒無毒、有益腸胃，具有化痰理氣、增強免疫力等功效，因此，羊肚菌也是一種珍貴的藥用菌。目前市場上的羊肚菌大多來自野生，但由于過度采摘，野生的羊肚菌生長數(shù)量越來越少；而羊肚菌的人工栽培成本高、技術(shù)難且產(chǎn)量不穩(wěn)定，尚不能實現(xiàn)商業(yè)化和規(guī)模化。研究表明，在羊肚菌原生境，采用人工菌種的配套的技術(shù)措施，能夠有效提高羊肚菌的單位產(chǎn)量。

目前國內(nèi)外的原生境促繁技術(shù)主要集中在固體培養(yǎng)技術(shù)和液體培養(yǎng)技術(shù)。相對于固體培養(yǎng)技術(shù)，液體發(fā)酵技術(shù)具有菌絲體生長良好，培養(yǎng)基利用充分等優(yōu)點。但現(xiàn)有的液體發(fā)酵技術(shù)獲得的菌絲體單位產(chǎn)量較低(小于1.0％)，仍未達到大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)需求，另外由于菌體貼壁生長習性及營養(yǎng)失衡等原因，獲得的菌球形態(tài)不完整、大小不均勻，嚴重影響羊肚菌的效用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷從而提供一種能夠大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)并有效降低成本的深層發(fā)酵培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：一種羊肚菌的深層發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括如下步驟：

(1)本發(fā)明所使用的菌株為從四川省廣元市青川縣青溪鎮(zhèn)人工種植分離得到的羊肚菌(Mochella esculenta)Y-3^#菌株。將羊肚菌Y-3^#的菌絲體接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于20～25℃培養(yǎng)5～7天，獲得斜面菌種。

(2)將步驟(1)的斜面菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于20～25℃培養(yǎng)5～7天，獲得一級液體菌種；

(3)將步驟(2)獲得的一級液體菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的15-300L發(fā)酵罐中，攪拌器以軸向的攪拌方式不停攪拌；其中，培養(yǎng)溫度為20～25℃，通氣比值為0.5～1.5，罐壓為0.03～0.07Mpa，發(fā)酵罐的裝液體積比為50～70％，接種體積比為5～10％；

(4)在步驟(3)的基礎(chǔ)上，培養(yǎng)90～100h時，以恒定速率同時流加補入碳源溶液和氮源溶液，連續(xù)補料至培養(yǎng)結(jié)束，培養(yǎng)至144～162h結(jié)束；

(5)將步驟(4)得到的液體菌絲體經(jīng)紗布過濾、清水洗滌和甩干后，置于烘箱中烘干，至質(zhì)量不再變化時，即可得到羊肚菌的干菌絲體；

其中，步驟(1)所述的所述的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其配方為(按質(zhì)量百分比計)：馬鈴薯20％、葡萄糖2％、瓊脂2％，其余為水；

步驟(2)所述的液體培養(yǎng)基配方為(按質(zhì)量百分比計)：葡萄糖2.5-3.5％、酵母提取物0.5-1.5％、蛋白胨0.5-1.5％，其余為水；

步驟(3)中所述的液體培養(yǎng)基配方為：碳源30～40g/L、氮源15～20g/L、磷酸二氫鉀0.5～1.5g/L、七水硫酸鎂1.0～2.0g/L、消泡劑0.5～1.0g/L，其余為水。

一些實施例中，本發(fā)明所述的方法中，步驟(3)中所述的液體培養(yǎng)基中的碳源，包括葡萄糖、麥芽糖、蔗糖和可溶性淀粉的一種或兩種。

一些實施例中，本發(fā)明所述的方法中，步驟(3)中所述的液體培養(yǎng)基中的氮源包括酵母粉、蛋白胨、黃豆粉和玉米干粉的一種或兩種。

一些實施例中，本發(fā)明所述的方法中，步驟(3)中所采用的攪拌器為三層軸向流攪拌器，包括KSX型、A315型及MaxFlo型的一種或者兩種。

一些實施例中，本發(fā)明所述的方法中，步驟(3)中所采用的攪拌器轉(zhuǎn)速為200～400r/min。

一些實施例中，本發(fā)明所述的方法中，步驟(4)中所流加補入的碳源溶液質(zhì)量濃度為30％，包括葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和可溶性淀粉的一種或兩種。

一些實施例中，本發(fā)明所述的方法中，步驟(4)中所流加補入的氮源溶液的質(zhì)量濃度為20％，包括酵母粉、蛋白胨、黃豆粉和玉米干粉的一種或兩種。

一些實施例中，本發(fā)明所述的方法中，步驟(4)開始補加碳源和氮源的時間為90～100h。

一些實施例中，本發(fā)明所述的方法中，步驟(4)碳源和氮源的流加補入速率為1.0～2.0g/L/h。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點和有益效果：

(1)通過采用流加補料的培養(yǎng)工藝大幅度提高了羊肚菌菌絲體的單位產(chǎn)量，達3.7％以上。

(2)通過改進發(fā)酵罐攪拌器(將徑向流攪拌器改為寬葉軸向流攪拌器)，顯著改善了羊肚菌菌絲體下沉與貼壁生長的現(xiàn)象，不僅利于菌絲體生長，還保證了菌體的完好形態(tài)，菌球更加完整、均勻。

(3)該工藝已成功應(yīng)用于300L規(guī)模深層發(fā)酵培養(yǎng)，能夠滿足大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)需求。

(4)通過該培養(yǎng)工藝獲得的菌絲體含有與野生羊肚菌效用相同的有效成分，并且各有效成分含量也與野生羊肚菌相近，其中，氨基氮(主要是氨基酸和蛋白質(zhì))含量高于50％，腺苷含量在1％左右，多糖含量高于5％。說明通過該培養(yǎng)方法獲得的菌絲體具有與野生羊肚菌相同的營養(yǎng)價值和效用。

附圖說明

圖1為發(fā)酵罐寬葉軸向流攪拌器類型。

具體實施方式

下面以具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明不受下述實施例的限定。

實施例1

(1)將羊肚菌Y-3^#的菌絲體接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于20℃培養(yǎng)5天，獲得斜面菌種。所述的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其配方為(按質(zhì)量百分比計)：馬鈴薯20％、葡萄糖2％、瓊脂2％，其余為水。

(2)將步驟(1)的斜面菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于20℃培養(yǎng)5天，獲得一級液體菌種；所述的液體培養(yǎng)基配方為(按質(zhì)量百分比計)：葡萄糖2.5％、酵母提取物1.5％、蛋白胨0.5％，其余為水。

(3)將步驟(2)獲得的一級液體菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的三層攪拌器類型均為KSX型，發(fā)酵罐的裝液量為70％，接種量為5％，所述的百分數(shù)均為體積比，培養(yǎng)溫度為20℃，通氣比值為0.5，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，罐壓為0.05Mpa。所述的液體培養(yǎng)基配方為：葡萄糖30g/L、酵母粉20g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、七水硫酸鎂2.0g/L、消泡劑1.0g/L，其余為水。

(4)培養(yǎng)至90h時，以2.0g/L/h的速率同時流加補入葡萄糖溶液(質(zhì)量濃度為30％)和酵母粉溶液(質(zhì)量濃度為20％)，連續(xù)補料至144h培養(yǎng)結(jié)束。

(5)將步驟(4)得到的液體菌絲體經(jīng)紗布過濾、清水洗滌和甩干后，置于烘箱中烘干，至質(zhì)量不再變化時，即可得到羊肚菌的干菌絲體。

對干菌絲體進行稱重和成分分析后可得到四種參數(shù)：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要為氨基酸和蛋白質(zhì)量，％)，其結(jié)果見表1。

實施例2

(1)將羊肚菌Y-3^#的菌絲體接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于22℃培養(yǎng)6天，獲得斜面菌種。所述的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其配方為(按質(zhì)量百分比計)：馬鈴薯20％、葡萄糖2％、瓊脂2％，其余為水。

(2)將步驟(1)的斜面菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于22℃培養(yǎng)6天，獲得一級液體菌種；所述的液體培養(yǎng)基配方為(按質(zhì)量百分比計)：葡萄糖3.5％、酵母提取物0.5％、蛋白胨1.5％，其余為水。

(3)將步驟(2)獲得的一級液體菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的三層攪拌器類型下層和中層均為KSX型、上層為A315型，發(fā)酵罐的裝液量為50％，接種量為8％，所述的百分數(shù)均為體積比，培養(yǎng)溫度為22℃，通氣比值為1.0，攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min，罐壓為0.07Mpa。所述的液體培養(yǎng)基配方為：蔗糖35g/L、酵母粉7.5g/L、黃豆粉7.5g/L、磷酸二氫鉀1.0g/L、七水硫酸鎂1.5g/L、消泡劑0.5g/L，其余為水。

(4)培養(yǎng)至95h時，以1.5g/L/h的速率同時流加補入蔗糖溶液(質(zhì)量濃度為30％)和酵母粉-黃豆粉混合溶液(酵母粉和黃豆粉各含10％)，連續(xù)補料至150h培養(yǎng)結(jié)束。

(5)將步驟(4)得到的液體菌絲體經(jīng)紗布過濾、清水洗滌和甩干后，置于烘箱中烘干，至質(zhì)量不再變化時，即可得到羊肚菌的干菌絲體。

對干菌絲體進行稱重和成分分析后可得到四種參數(shù)：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要為氨基酸和蛋白質(zhì)量，％)，其結(jié)果見表1。

實施例3

(1)將羊肚菌Y-3^#的菌絲體接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于20℃培養(yǎng)7天，獲得斜面菌種。所述的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其配方為(按質(zhì)量百分比計)：馬鈴薯20％、葡萄糖2％、瓊脂2％，其余為水。

(2)將步驟(1)的斜面菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于20℃培養(yǎng)7天，獲得一級液體菌種；所述的液體培養(yǎng)基配方為(按質(zhì)量百分比計)：葡萄糖3.0％、酵母提取物1.0％、蛋白胨1.0％，其余為水。

(3)將步驟(2)獲得的一級液體菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的300L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的三層攪拌器類型均為MaxFlo型，發(fā)酵罐的裝液量為60％，接種量為8％，所述的百分數(shù)均為體積比，培養(yǎng)溫度為20℃，通氣比值為1.5，攪拌轉(zhuǎn)速為400r/min，罐壓為0.05Mpa。所述的液體培養(yǎng)基配方為：麥芽糖40g/L、蛋白胨9.0g/L、玉米干粉9.0g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、七水硫酸鎂2.0g/L、消泡劑0.5g/L，其余為水。

(4)培養(yǎng)至100h時，以1.0g/L/h的速率同時流加補入麥芽糖溶液(質(zhì)量濃度為30％)和蛋白胨-玉米干粉混合溶液(蛋白胨和玉米干粉各含10％)，連續(xù)補料至156h培養(yǎng)結(jié)束。

(5)將步驟(4)得到的液體菌絲體經(jīng)紗布過濾、清水洗滌和甩干后，置于烘箱中烘干，至質(zhì)量不再變化時，即可得到羊肚菌的干菌絲體。

對干菌絲體進行稱重和成分分析后可得到四種參數(shù)：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要為氨基酸和蛋白質(zhì)量，％)，其結(jié)果見表1。

實施例4

(1)將羊肚菌Y-3^#的菌絲體接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)6天，獲得斜面菌種。所述的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其配方為(按質(zhì)量百分比計)：馬鈴薯20％、葡萄糖2％、瓊脂2％，其余為水。

(2)將步驟(1)的斜面菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于25℃培養(yǎng)6天，獲得一級液體菌種；所述的液體培養(yǎng)基配方為(按質(zhì)量百分比計)：葡萄糖2.5％、酵母提取物1.0％、蛋白胨0.5％，其余為水。

(3)將步驟(2)獲得的一級液體菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的15L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的三層攪拌器類型分別為：下層和中層均為A315型、上層為MaxFlo型，發(fā)酵罐的裝液量為50％，接種量為10％，所述的百分數(shù)均為體積比，培養(yǎng)溫度為25℃，通氣比值為1.0，攪拌轉(zhuǎn)速為400r/min，罐壓為0.03Mpa。所述的液體培養(yǎng)基配方為：可溶性淀粉35g/L、黃豆粉18g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、七水硫酸鎂1.0g/L、消泡劑1.5g/L，其余為水。

(4)培養(yǎng)至95h時，以1.5g/L/h的速率同時流加補入可溶性淀粉溶液(質(zhì)量濃度為30％)和黃豆粉溶液(質(zhì)量濃度為20％)，連續(xù)補料至156h培養(yǎng)結(jié)束。

(5)將步驟(4)得到的液體菌絲體經(jīng)紗布過濾、清水洗滌和甩干后，置于烘箱中烘干，至質(zhì)量不再變化時，即可得到羊肚菌的干菌絲體。

對干菌絲體進行稱重和成分分析后可得到四種參數(shù)：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要為氨基酸和蛋白質(zhì)量，％)，其結(jié)果見表1。

實施例5

(1)將羊肚菌Y-3^#的菌絲體接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于22℃培養(yǎng)5天，獲得斜面菌種。所述的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其配方為(按質(zhì)量百分比計)：馬鈴薯20％、葡萄糖2％、瓊脂2％，其余為水。

(2)將步驟(1)的斜面菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于22℃培養(yǎng)5天，獲得一級液體菌種；所述的液體培養(yǎng)基配方為(按質(zhì)量百分比計)：葡萄糖3.0％、酵母提取物0.5％、蛋白胨1.5％，其余為水。

(3)將步驟(2)獲得的一級液體菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的300L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的三層攪拌器類型分別為：下層和中層均為KSX型、上層為MaxFlo型，發(fā)酵罐的裝液量為60％，接種量為5％，所述的百分數(shù)均為體積比，培養(yǎng)溫度為22℃，通氣比值為0.5，攪拌轉(zhuǎn)速為300r/min，罐壓為0.03Mpa。所述的液體培養(yǎng)基配方為：葡萄糖20g/L、麥芽糖20g/L、蛋白胨15g/L、磷酸二氫鉀1.0g/L、七水硫酸鎂1.5g/L、消泡劑1.5g/L，其余為水。

(4)培養(yǎng)至90h時，以2.0g/L/h的速率同時流加補入葡萄糖-麥芽糖混合溶液(葡萄糖和麥芽糖各含15％)和蛋白胨溶液(質(zhì)量濃度為20％)，連續(xù)補料至162h培養(yǎng)結(jié)束。

(5)將步驟(4)得到的液體菌絲體經(jīng)紗布過濾、清水洗滌和甩干后，置于烘箱中烘干，至質(zhì)量不再變化時，即可得到羊肚菌的干菌絲體。

對干菌絲體進行稱重和成分分析后可得到四種參數(shù)：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要為氨基酸和蛋白質(zhì)量，％)，其結(jié)果見表1。

實施例6

(1)將羊肚菌Y-3^#的菌絲體接種到試管斜面培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)7天，獲得斜面菌種。所述的斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其配方為(按質(zhì)量百分比計)：馬鈴薯20％、葡萄糖2％、瓊脂2％，其余為水。

(2)將步驟(1)的斜面菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的搖瓶中，于25℃培養(yǎng)7天，獲得一級液體菌種；所述的液體培養(yǎng)基配方為(按質(zhì)量百分比計)：葡萄糖3.5％、酵母提取物1.5％、蛋白胨1.0％，其余為水。

(3)將步驟(2)獲得的一級液體菌種接種至裝有液體培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐的三層攪拌器類型均為A315型，發(fā)酵罐的裝液量為70％，接種量為10％，所述的百分數(shù)均為體積比，培養(yǎng)溫度為25℃，通氣比值為1.5，攪拌轉(zhuǎn)速為200r/min，罐壓為0.07Mpa。所述的液體培養(yǎng)基配方為：蔗糖15g/L、可溶性淀粉15g/L、玉米干粉20g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、七水硫酸鎂1.0g/L、消泡劑1.0g/L，其余為水。

(4)培養(yǎng)至100h時，以1.0g/L/h的速率同時流加補入蔗糖-可溶性淀粉混合溶液(蔗糖和可溶性淀粉各含15％)和玉米干粉溶液(質(zhì)量濃度為20％)，連續(xù)補料至156h培養(yǎng)結(jié)束。

(5)將步驟(4)得到的液體菌絲體經(jīng)紗布過濾、清水洗滌和甩干后，置于烘箱中烘干，至質(zhì)量不再變化時，即可得到羊肚菌的干菌絲體。

對干菌絲體進行稱重和成分分析后可得到四種參數(shù)：干重(％)、腺苷含量(％)、多糖含量(％)和氨基氮含量(主要為氨基酸和蛋白質(zhì)量，％)，其結(jié)果見表1。

表1各實施例所得干菌絲體參數(shù)對比