本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種輔助診斷線粒體糖尿病的試劑盒。
背景技術(shù)：
：線粒體糖尿病是一種特殊類型糖尿病，臨床上有特征性表現(xiàn)，如發(fā)病年齡早，母系遺傳，不伴有肥胖，常伴有耳聾和神經(jīng)肌肉損害，胰島素分泌明顯不足，容易出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥，由于線粒體功能缺陷，易發(fā)生乳酸酸中毒。在治療上，口服藥物療效差，早期需要胰島素治療，需慎用雙胍類降糖藥物(易發(fā)生乳酸酸中毒)，小心使用他汀類藥物和耳毒性藥物(神經(jīng)肌肉受損)。然而，此種類型糖尿病的診斷最終需要基因診斷，即線粒體突變檢測(cè)，線粒體突變檢測(cè)有助于早期進(jìn)行診斷，制定個(gè)體化的治療方案，并判斷預(yù)后，也有助于了避免藥物治療發(fā)生潛在的不良反應(yīng)。比如，他汀類藥物是糖尿病患者常用的降脂藥物，橫紋肌損傷是其不良反應(yīng)之一，如果發(fā)現(xiàn)帶有線粒體突變的患者，就應(yīng)該少劑量開始，密切觀察。目前尚缺乏線粒體突變檢測(cè)的產(chǎn)品，指導(dǎo)糖尿病診斷分型。在線粒體突變檢測(cè)前，很多線粒體糖尿病患者被誤診為1型糖尿病或2型糖尿病。目前研究發(fā)現(xiàn)A1555GSNP位點(diǎn)與耳聾相關(guān)，G3337ASNP位點(diǎn)與心肌病相關(guān)、T14674CSNP位點(diǎn)與肌病相關(guān)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的問題是輔助診斷線粒體糖尿病。為解決上述問題，本發(fā)明首先提供了一種輔助診斷線粒體糖尿病的產(chǎn)品甲。所述輔助診斷線粒體糖尿病的產(chǎn)品甲可包括用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于G3337ASNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)；所述G3337ASNP位點(diǎn)可為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列1所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸。所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于G3337ASNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述G3337ASNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述G3337ASNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物。所述分型檢測(cè)引物具體可為通過單堿基延伸反應(yīng)檢測(cè)所述G3337ASNP位點(diǎn)的引物。上述產(chǎn)品甲中，所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于G3337ASNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述G3337ASNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述G3337ASNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述G3337ASNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)可由序列表的序列12所示的引物3337F和序列表的序列13所示的引物3337R組成；所述用于檢測(cè)所述G3337ASNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列34所示的引物3337UEP。所述產(chǎn)品甲還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體1：如果待測(cè)者線粒體基因組基于G3337ASNP位點(diǎn)的基因型為GA雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于G3337ASNP位點(diǎn)的基因型為GG純合型、待測(cè)患者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。本發(fā)明還提供一種輔助診斷線粒體糖尿病的產(chǎn)品乙。所述產(chǎn)品乙可包括用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T14674CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)；所述T14674CSNP位點(diǎn)可為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列2所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸。用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T14674CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述T14674CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述T14674CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物。所述分型檢測(cè)引物具體可為通過單堿基延伸反應(yīng)檢測(cè)所述T14674CSNP位點(diǎn)的引物。上述產(chǎn)品乙中，所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T14674CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述T14674CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述T14674CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述T14674CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)可由序列表的序列14所示的引物14674F和序列表的序列15所示的引物14674R組成；所述用于檢測(cè)所述T14674CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列35所示的引物14674UEP。所述產(chǎn)品乙還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體1：如果待測(cè)者線粒體基因組基于T14674CSNP位點(diǎn)的基因型為TC雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T14674CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)患者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。本發(fā)明還提供了一種輔助診斷線粒體糖尿病的試劑盒，所述試劑盒包括上述任一所述產(chǎn)品甲和/或上述任一所述產(chǎn)品乙。所述試劑盒還可包括用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于A1555GSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)、用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于A3243GSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)、用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T3264CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)、用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T3271CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)、用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T4291CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)、用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于A8296GSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)、用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于C12258ASNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)、用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T14709CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)和/或用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T14577CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)；所述A1555GSNP位點(diǎn)為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列3所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸；所述A3243GSNP位點(diǎn)為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列4所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸；所述T3264CSNP位點(diǎn)為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列5所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸；所述T3271CSNP位點(diǎn)為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列6所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸；所述T4291CSNP位點(diǎn)為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列7所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸；所述A8296GSNP位點(diǎn)為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列8所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸；所述C12258ASNP位點(diǎn)為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列9所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸；所述T14709CSNP位點(diǎn)為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列10所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸；所述T14577CSNP位點(diǎn)為人線粒體基因組DNA中的序列表的序列11所示區(qū)段中自5’末端第151位核苷酸。所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于A1555GSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述A1555GSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述A1555GSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述A1555GSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)可由序列表的序列16所示的引物1555F和序列表的序列17所示的引物1555R組成；所述用于檢測(cè)所述A1555GSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列36所示的引物 1555UEP。所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于A3243GSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述A3243GSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述A3243GSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述A3243GSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)可由序列表的序列18所示的引物3243F和序列表的序列19所示的引物3243R組成；所述用于檢測(cè)所述A3243GSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列37所示的引物3243UEP。所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T3264CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述T3264CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述T3264CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述T3264CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)可由序列表的序列20所示的引物3264F和序列表的序列21所示的引物3264R組成；所述用于檢測(cè)所述T3264CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列38所示的引物3264UEP。所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T3271CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述T3271CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述T3271CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述T3271CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)可由序列表的序列22所示的引物3271F和序列表的序列23所示的引物3271R組成；所述用于檢測(cè)所述T3271CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列39所示的引物3271UEP。所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T4291CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述T4291CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述T4291CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述T4291CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)可由序列表的序列24所示的引物4291F和序列表的序列25所示的引物4291R組成；所述用于檢測(cè)所述T4291CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列40所示的引物4291UEP。所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于A8296GSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述A8296GSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述A8296GSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述A8296GSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)可由序列表的序列26所示的引物8296F和序列表的序列27所示的引物8296R組成；所述用于檢測(cè)所述A8296GSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列41所示的引物8296UEP。所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于C12258ASNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述C12258ASNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述C12258ASNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述C12258ASNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)可由序列表的序列28所示的引物12258F和序列表的序列29所示的引物12258R組成；所述用于檢測(cè)所述C12258ASNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列42所示的引物12258UEP。所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T14709CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述T14709CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述T14709CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述T14709CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)可由序列表的序列30所示的引物14709F和序列表的序列31所示的引物14709R組成；所述用于檢測(cè)所述T14709CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列43所示的引物14709UEP。所述用于檢測(cè)待測(cè)者線粒體基因組基于T14577CSNP位點(diǎn)的基因型的物質(zhì)可包括用于擴(kuò)增含有所述T14577CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物對(duì)和/或用于檢測(cè)所述T14577CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物；所述用于擴(kuò)增含有所述T14577CSNP位點(diǎn)的靶序列的PCR擴(kuò)增引物 對(duì)可由序列表的序列32所示的引物14577F和序列表的序列33所示的引物14577R組成；所述用于檢測(cè)所述T14577CSNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物可為序列表的序列44所示的引物14577UEP。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體3：如果待測(cè)者線粒體基因組基于A1555GSNP位點(diǎn)的基因型為GG純合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于A1555GSNP位點(diǎn)的基因型為AA純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體4：如果待測(cè)者線粒體基因組基于A3243GSNP位點(diǎn)的基因型為AG雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于A3243GSNP位點(diǎn)的基因型為AA純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體5：如果待測(cè)者線粒體基因組基于T3264CSNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T3264CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體6：如果待測(cè)者線粒體基因組基于T3271CSNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T3271CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體7：如果待測(cè)者線粒體基因組基于T4291CSNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T4291CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體8：如果待測(cè)者線粒體基因組基于A8296GSNP位點(diǎn)的基因型為GG純合型或AG雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于A8296GSNP位點(diǎn)的基因型為AA純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體9：如果待測(cè)者線粒體基因組基于C12258ASNP位點(diǎn)的基因型為AA純合型或CA雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于C12258ASNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體10：如果待測(cè)者線粒體基因組基于T14709CSNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型或TC雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T14709CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。所述試劑盒還可包括記載有如下判斷標(biāo)準(zhǔn)的載體11：如果待測(cè)者線粒體基因組基于T14577CSNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型或TC雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T14577CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。上述任一所述產(chǎn)品甲、上述任一所述產(chǎn)品乙或上述任一所述試劑盒在制備用于輔助診斷 線粒體糖尿病的試劑盒中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，利用本發(fā)明所提供的輔助診斷線粒體糖尿病的試劑盒可以輔助診斷線粒體糖尿病，具有較高的準(zhǔn)確率，對(duì)于線粒體糖尿病的診斷和治療具有重大價(jià)值。附圖說明圖1為與線粒體糖尿病相關(guān)的SNP位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果。其中左上為A3243GSNP位點(diǎn)，右上為A1555GSNP位點(diǎn)，左下為G3337ASNP位點(diǎn)，右下為T14674CSNP位點(diǎn)。圖2為人工合成的含SNP位點(diǎn)的基因片段的測(cè)序結(jié)果。其中，A為T3264CSNP位點(diǎn)，B為T3271CSNP位點(diǎn)，C為T4291CSNP位點(diǎn)，D為A8296GSNP位點(diǎn)，E為C12258ASNP位點(diǎn)，F(xiàn)為T14709CSNP位點(diǎn)，G為T14577CSNP位點(diǎn)。圖3為11個(gè)SNP位點(diǎn)的質(zhì)譜檢測(cè)峰圖。其中，A為T3264CSNP位點(diǎn)，B為G3337ASNP位點(diǎn)，C為T14577CSNP位點(diǎn)，D為T14709CSNP位點(diǎn)，E為A1555GSNP位點(diǎn)，F(xiàn)為A3243GSNP位點(diǎn)，G為T14674CSNP位點(diǎn)，H為A8296GSNP位點(diǎn)，I為C12258ASNP位點(diǎn)，J為T3271CSNP位點(diǎn)，K為T4291CSNP位點(diǎn)。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)描述，給出的實(shí)施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的各個(gè)試驗(yàn)均是在各受試者知情同意的前提下進(jìn)行的。北京大學(xué)人民醫(yī)院糖尿病樣本庫(kù)中的90例40歲前已被診斷為2型糖尿病的患者(男61例，女29例，年齡35.4±6.4歲)均簽署知情同意書，并經(jīng)北京大學(xué)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后，進(jìn)行試驗(yàn)。ABI3730XL測(cè)序儀為AppliedBiosystems公司產(chǎn)品，貨號(hào)為3730xl。實(shí)施例1、與線粒體糖尿病相關(guān)的SNP位點(diǎn)一、新SNP位點(diǎn)與線粒體糖尿病的關(guān)聯(lián)分析抽取患者的空腹靜脈血3mL，用血液基因組提取試劑盒(北京博邁德基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品)提取靜脈血的基因組DNA，然后用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)其中的50例患者進(jìn)行全線粒體基因組測(cè)序，用ABI3730XL測(cè)序儀對(duì)其余40例患者進(jìn)行全線粒體基因組測(cè)序分析，對(duì)發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致線粒體糖尿病的SNP位點(diǎn)，用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行驗(yàn)證(見圖1)。將90例患者的全線粒體基因組測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中正常健康人的全線粒體基因組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)4個(gè)與線粒體糖尿病相關(guān)的SNP位點(diǎn)(見表1)，分別為G3337ASNP位點(diǎn)、T14674CSNP位點(diǎn)、A1555GSNP位點(diǎn)和A3243GSNP位點(diǎn)：G3337ASNP位點(diǎn)為序列表的序列1自5’末端第151位核苷酸，T14674CSNP位點(diǎn)為序列表的序列2自5’末端第151位核苷酸，A1555GSNP位點(diǎn)為序列表的序列3自5’末端第151位核苷酸，A3243GSNP位點(diǎn)為序列表的序列4自5’末端第151位核苷酸。可見，在人類線粒體基因組中，基于G3337ASNP位點(diǎn)基因型為GA雜合型或GG純合型(未發(fā)現(xiàn)AA純合型的情況)，基于T14674CSNP位點(diǎn)基因型為TC雜合型或TT純合型(未發(fā)現(xiàn)CC純合型的情況)，基于A3243GSNP位點(diǎn)基因型為AG雜合型或AA純合型(未發(fā)現(xiàn)GG純合型的情況)，基于A1555GSNP位點(diǎn)基因型為AA純合型或GG純合型(未發(fā)現(xiàn)GA雜合型的情況)。表1.90例患者中與線粒體糖尿病相關(guān)的SNP位點(diǎn)的基因型二、現(xiàn)有SNP位點(diǎn)的篩選通過文獻(xiàn)檢索篩選出國(guó)際上比較公認(rèn)的7個(gè)導(dǎo)致線粒體糖尿病相關(guān)的位點(diǎn)，包括T3264CSNP位點(diǎn)、T3271CSNP位點(diǎn)、T4291CSNP位點(diǎn)、A8296GSNP位點(diǎn)、C12258ASNP位點(diǎn)、T14709CSNP位點(diǎn)和T14577CSNP位點(diǎn)?，F(xiàn)有人線粒體基因組的研究結(jié)果如下：基于T3264CSNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T3264CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基于T3271CSNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T3271CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基于T4291CSNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型或CT雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T4291CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基于A8296GSNP位點(diǎn)的基因型為GG純合型或AG雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于A8296GSNP位點(diǎn)的基因型為AA純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基于C12258ASNP位點(diǎn)的基因型為AA純合型或CA雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于C12258ASNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基于T14709CSNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型或TC雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T14709CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者；基于T14577CSNP位點(diǎn)的基因型為CC純合型或TC雜合型、待測(cè)者為或候選為患有線粒體糖尿病的患者，如果待測(cè)者線粒體基因組基于T14577CSNP位點(diǎn)的基因型為TT純合型、待測(cè)者不為或候選不為患有線粒體糖尿病的患者。實(shí)施例2、檢測(cè)實(shí)施例1中與線粒體糖尿病相關(guān)的SNP位點(diǎn)一、模板的制備(1)將步驟一中編號(hào)為1的患者的基因組DNA作為模板1，模板1中含有如序列表中序列1所示的人線粒體基因片段。模板1中基因組DNA的濃度為10ng/μL。(2)將步驟一中編號(hào)為2的患者的DNA作為模板2，模板2中含有如序列表中序列2所示的人線粒體基因片段。模板2中基因組DNA的濃度為10ng/μL。(3)將步驟一中編號(hào)為3的患者的DNA作為模板3，模板3中含有如序列表中序列1所示的人線粒體基因片段。模板3中基因組DNA的濃度為10ng/μL。(4)將步驟一中編號(hào)為4的患者的DNA作為模板4，模板4中含有如序列表中序列4所示的人線粒體基因片段。模板4中基因組DNA的濃度為10ng/μL。(5)制備模板5，具體制備步驟如下(由諾賽基因組研究中心有限公司協(xié)助完成)：①對(duì)序列表中序列5所示的人線粒體基因片段的全序列進(jìn)行分析，檢查內(nèi)部是否含有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)和重復(fù)序列，分析序列GC含量，根據(jù)序列分析的結(jié)果，進(jìn)行單鏈寡核苷酸的設(shè)計(jì)及合成。②利用梯度PCR技術(shù)將步驟①合成的單鏈寡核苷酸拼接成如序列表中序列5所示的基因片段，并用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果見圖2中A。③將步驟②制備的基因片段與pMD18-T載體(Takara公司產(chǎn)品)連接，得到重組質(zhì)粒。④將步驟③制備的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，得到攜帶重組質(zhì)粒的大腸桿菌。⑤提取步驟④獲得的大腸桿菌的質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒DNA。步驟⑤提取的重組質(zhì)粒DNA即為模板5，模板5中含有如序列表中序列5所示的人線粒體基因片段。模板5攜帶T3264CSNP位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)為序列表的序列5自5’末端第151位核苷酸所示。模板5中重組質(zhì)粒DNA的濃度為10ng/μL。(6)按照上述制備模板5的步驟，將序列表中序列5分別替換為序列表中序列6、序列表中序列7、序列表中序列8、序列表中序列9、序列表中序列10和序列表中序列11， 其它步驟均不變，分別得到模板6、模板7、模板8、模板9、模板10和模板11。其中人工合成相應(yīng)的基因片段用ABI3730XL測(cè)序儀進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果依次見圖2中B-圖2中G。模板6中含有如序列表中序列6所示的人線粒體基因片段。模板6攜帶T3271CSNP位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)為序列表的序列6自5’末端第151位核苷酸所示。模板6中重組質(zhì)粒DNA的濃度為10ng/μL。模板7中含有如序列表中序列7所示的人線粒體基因片段。模板7攜帶T4291CSNP位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)為序列表的序列7自5’末端第151位核苷酸所示。模板7中重組質(zhì)粒DNA的濃度為10ng/μL。模板8中含有如序列表中序列8所示的人線粒體基因片段。模板8攜帶A8296GSNP位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)為序列表的序列8自5’末端第151位核苷酸所示。模板8中重組質(zhì)粒DNA的濃度為10ng/μL。模板9中含有如序列表中序列9所示的人線粒體基因片段。模板9攜帶C12258ASNP位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)為序列表的序列9自5’末端第151位核苷酸所示。模板9中重組質(zhì)粒DNA的濃度為10ng/μL。模板10中含有如序列表中序列10所示的人線粒體基因片段。模板10攜帶T14709CSNP位點(diǎn)，該SNP位點(diǎn)為序列表的序列10自5’末端第151位核苷酸所示。模板10中重組質(zhì)粒DNA的濃度為10ng/μL。模板11中含有如序列表中序列11所示的人線粒體基因片段。模板11攜帶T14577CSNP，該SNP位點(diǎn)為序列表的序列11自5’末端第151位核苷酸所示。模板11中重組質(zhì)粒DNA的濃度為10ng/μL。(7)抽取正常健康人的空腹靜脈血3mL，用血液基因組提取試劑盒(北京博邁德基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品)提取靜脈血的基因組DNA。將正常健康人的基因組DNA作為模板12。二、引物的制備基于大量的序列分析、篩選、驗(yàn)證和效果比較，設(shè)計(jì)并合成用于鑒定各個(gè)SNP位點(diǎn)的PCR引物和分型檢測(cè)引物。各SNP位點(diǎn)的PCR引物見表2，各SNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物見表3。由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成各SNP位點(diǎn)的PCR引物和分型檢測(cè)引物。將表2中編號(hào)為1-8的PCR引物等摩爾質(zhì)量的進(jìn)行混合，得到混合引物1；將表2中編號(hào)為9-16的PCR引物等摩爾質(zhì)量的進(jìn)行混合，得到混合引物2；將表2中編號(hào)為17-22的PCR引物等摩爾質(zhì)量的進(jìn)行混合，得到混合引物3。將表3中編號(hào)為23-26的分型檢測(cè)引物混合，得到混合引物4，混合引物4中編號(hào)為23-26的分型檢測(cè)的濃度分別為8.06μM、8.15μM、9.06μM和9.40μM；將表3中編號(hào)為27-30的分型檢測(cè)引物混合，得到混合引物5，混合引物5中編號(hào)為27-30的分型檢測(cè)的濃度分別為8.25μM、9.38μM、10.09μM和11.10μM；將表3中編號(hào)為31-33的分型檢測(cè)引物混合，得到混合引物6，混合引物6中編號(hào)為31-33的分型檢測(cè)的濃度分別為8.73μM、11.09μM和12.06μM。表2.各SNP位點(diǎn)的PCR引物表3.各SNP位點(diǎn)的分型檢測(cè)引物編號(hào)SNP位點(diǎn)引物名稱引物序列(5’-3’)序列表中的位置23T14577C14577UEPGACCACACCGCTAACAA序列表中的序列4424T14709C14709UEPAACCACGACCAATGATA序列表中的序列4325G3337A3337UEPTTGCGATTAGAATGGGTA序列表中的序列3426T3264C3264UEPCCCGGTAATCGCATAAAAC序列表中的序列3827A3243G3243UEPTTATGCGATTACCGGGC序列表中的序列3728A1555G1555UEPCTTACCATGTTACGACTTG序列表中的序列3629A8296G8296UEPATGCTAAGTTAGCTTTACAG序列表中的序列4130T14674C14674UEPACAGAAACAAAGCATACATCAT序列表中的序列3531T3271C3271UEPTTGAACCTCTGACTGTAA序列表中的序列3932T4291C4291UEPATGTCTGATAAAAGAGTTACTT序列表中的序列4033C12258A12258UEPTGTTATCCTTTAAAAGTTGAGAAA序列表中的序列42三、質(zhì)譜法進(jìn)行基因分型檢測(cè)下述實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。1、PCR擴(kuò)增按照表4中的試劑組分配制PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，在384孔板中進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃2min；94℃20s，56℃30s，72℃1min，45個(gè)循環(huán)；72℃3min。組分中模板為模板1、模板2、模板3、模板4、模板5、模板6、模板7、模板8、模板9、模板10、模板11或模板12，0.5μMPrimerMix為混合引物1、混合引物2或混合引物3，10×PCRBufferwith15mMMgCl2、MgCl2和dNTPMix均為Agenabioscience公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為10711521、10359033和10767222。HotStarTaq為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。將上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中的PrimerMix替換為等量超純水，其它組分均不變，在384孔板中進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。作為空白對(duì)照。表4.PCR擴(kuò)增反應(yīng)液的組分組分在PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中的終濃度反應(yīng)組分體積(μL)超純水n/a1.810×PCRBufferwith15mMMgCl21××PCRBuffer(1.5mMMgCl2)0.5MgCl2(25mM)2mM0.4dNTPMix(25mM)500μM0.1PrimerMix(0.5μM)0.1μM(單條引物)1HotStarTaq(5U/μl)1Unit0.2模板n/a1Totalvolume(μL)n/a5注：n/a表示不存在。2、SAP反應(yīng)完成步驟1后，向384孔板中的每個(gè)孔加入2μLSAP混合液(按照表5中的組分配置)進(jìn)行SAP反應(yīng)，去除體系中游離的dNTP。反應(yīng)程序?yàn)椋?7℃、40min，85℃、5min，4℃維持。10×SAPBuffer和SAPEnzyme均為Agenabioscience公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為為0000020182和0000008336。表5.SAP混合液的組分組分在SAP混合液中的終濃度反應(yīng)組分體積(μl)超純水n/a1.5310×SAPBuffer0.24×0.17SAPEnzyme(1.7U/μl)0.4U0.3Totalvolume(μL)n/a2注：n/a表示不存在。3、單堿基延伸反應(yīng)完成步驟2后，向384孔板中的每個(gè)孔加入2μL單堿基延伸反應(yīng)液(按照表6中的組分配置)進(jìn)行延伸反應(yīng)，得到延伸產(chǎn)物。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃30s；94℃5s、52℃5s、80℃5s、52℃5s、80℃5s、52℃5s、80℃5s、52℃5s、80℃5s、52℃5s、80℃5s，40個(gè)循環(huán)；72℃3min。10×iPLEXBufferPlus、iPLEXTerminationmix和iPLEXEnzyme為Agenabioscience公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號(hào)分別為0000008212、0000008329和0000008333。iPLEXExtendPrimerMix為步驟二制備的混合引物4、混合引物5或混合引物6。表6.單堿基延伸反應(yīng)液的組分組分反應(yīng)組分體積(μl)超純水0.61910×iPLEXBufferPlus0.2iPLEXTerminationmix0.2iPLEXExtendPrimerMix0.94iPLEXEnzyme0.041TotalVolume(μL)24、質(zhì)譜檢測(cè)(1)芯片點(diǎn)樣：將步驟3獲得的延伸產(chǎn)物去鹽(每孔加入6mg樹脂，上下翻轉(zhuǎn)30min，讓延伸產(chǎn)物與樹脂充分混合，離心3000prm,5min待用)，啟動(dòng)MassARRAYNanodispenserRS1000點(diǎn)樣儀，然后將去鹽后的產(chǎn)物384樣品點(diǎn)樣至384孔SpectroCHIP(Sequenom)芯片上(2)質(zhì)譜檢測(cè)：將步驟(1)點(diǎn)樣后的SpectroCHIP芯片使用基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，檢測(cè)結(jié)果使用TYPER4.0軟件(sequenom)分型并輸出結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，本發(fā)明所提供的PCR引物和分型檢測(cè)引物均可特異的檢測(cè)相應(yīng)的SNP位點(diǎn)。實(shí)施例3、利用實(shí)施例1的SNP位點(diǎn)輔助診斷線粒體糖尿病本實(shí)施例中的4個(gè)待測(cè)患者為已經(jīng)根據(jù)臨床特征(如發(fā)病年齡早，母系遺傳，不伴有肥胖，常伴有耳聾和神經(jīng)肌肉損害，胰島素分泌明顯不足，容易出現(xiàn)糖尿病并發(fā)癥)判斷為患有線粒體糖尿病的患者。分別抽取4個(gè)待測(cè)患者的空腹靜脈血3mL，用血液基因組提取試劑盒(北京博邁德基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品)提取靜脈血的基因組DNA，然后按照實(shí)施例2中步驟二和步驟三的方法進(jìn)行檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表7，可見本發(fā)明所提供的SNP位點(diǎn)和檢測(cè)方法可以輔助診斷線粒體糖尿病，具有較高的準(zhǔn)確率。表7.待測(cè)患者線粒體基因組中含有的SNP位點(diǎn)的基因型當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3