本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及DT1蛋白在調(diào)控植物氣孔密度和提高植物抗旱性中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

干旱是影響作物產(chǎn)量的一個(gè)重要原因。當(dāng)植物根系所吸收的水分不夠蒸騰所需時(shí)，就會(huì)使得植物缺水。植物缺水會(huì)降低細(xì)胞膨壓，限制細(xì)胞膨大，減小葉面積和光合源，因此降低生物量和產(chǎn)量。

降低植物的蒸騰速率可以減少土壤水分的消耗，是一種有效的提高植物抗旱性的方法。

氣孔開(kāi)度和氣孔密度都可以調(diào)控水分的蒸騰和利用。降低氣孔密度能提高水分利用效率和植物抗旱性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供DT1蛋白在調(diào)控植物氣孔密度和提高植物抗旱性中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：將編碼DT1蛋白的基因?qū)氤霭l(fā)植物，得到抗旱能力高于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物；

所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱能力相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：將編碼DT1蛋白的基因?qū)氤霭l(fā)植物，得到葉片氣孔密度低于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物；

所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱能力相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，包括如下步驟：將編碼DT1蛋白的基因?qū)氤霭l(fā)植物，得到葉片蒸騰速率低于所述出發(fā)植物的轉(zhuǎn)基因植物；

所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱能力相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

以上任一所述“編碼DT1蛋白的基因”具體可為如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：

(1)編碼區(qū)如序列表的序列2自5’末端第5至1162位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表的序列2所示的DNA分子；

(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗旱相關(guān)蛋白的DNA分子；

(4)與(1)或(2)限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且編碼植物抗旱相關(guān)蛋白的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件可為：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO4和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。上述嚴(yán)格條件也可為：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

所述“編碼DT1蛋白的基因”可通過(guò)重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述出發(fā)植物。所述重組表達(dá)載體可為將所述“編碼DT1蛋白的基因”插入表達(dá)載體得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體具體可為將所述“編碼DT1蛋白的基因”插入質(zhì)粒pMDC32的AttR位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。

本發(fā)明還保護(hù)一種提高植物抗旱性的方法，是通過(guò)提高所述植物中編碼DT1蛋白的基因的表達(dá)來(lái)提高所述植物的抗旱性。

本發(fā)明還保護(hù)一種降低植物葉片氣孔密度的方法，是通過(guò)提高所述植物中編碼DT1蛋白的基因的表達(dá)來(lái)降低所述植物的葉片氣孔密度。

本發(fā)明還保護(hù)一種降低植物葉片蒸騰速率的方法，是通過(guò)提高所述植物中編碼DT1蛋白的基因的表達(dá)來(lái)降低植物葉片的蒸騰速率。

本發(fā)明還保護(hù)DT1蛋白的應(yīng)用，為如下(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)：(Ⅰ)降低植物葉片的氣孔密度；(Ⅱ)降低植物葉片的蒸騰速率；(Ⅲ)提高植物的抗旱能力。

本發(fā)明還保護(hù)編碼DT1蛋白的基因的應(yīng)用，為如下(Ⅰ)和/或(Ⅱ)和/或(Ⅲ)：(Ⅰ)降低植物葉片的氣孔密度；(Ⅱ)降低植物葉片的蒸騰速率；(Ⅲ)提高植物的抗旱能力。

以上任一所述DT1蛋白是如下(a)或(b)：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；

(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱能力相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

以上任一所述“編碼DT1蛋白的基因”具體可為如下(1)或(2)或(3)或(4)的DNA分子：

(1)編碼區(qū)如序列表的序列2自5’末端第5至1162位核苷酸所示的DNA分子；

(2)序列表的序列2所示的DNA分子；

(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼植物抗旱相關(guān)蛋白的DNA分子；

(4)與(1)或(2)限定的DNA分子至少具有90％以上同源性且編碼植物抗旱相關(guān)蛋白的DNA分子。

上述嚴(yán)格條件可為：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO4和1mM EDTA的混合溶液中雜交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗。上述嚴(yán)格條件也可為：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交,然后用2×SSC,0.1％SDS和1×SSC,0.1％SDS各洗膜一次。

以上任一所述植物可為如下①、②或③：①單子葉植物；②雙子葉植物；③擬南芥。

所述氣孔密度減少具體體現(xiàn)為葉片氣孔數(shù)目減少。

所述氣孔具體為所述植物葉片表皮的氣孔。

本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在擬南芥中提高DT1基因的表達(dá)水平能夠有效的降低葉片表皮的氣孔密度，從而降低轉(zhuǎn)基因植株的蒸騰速率，進(jìn)而提高了植物的抗旱性。本發(fā)明對(duì)于控制植物葉片的氣孔密度及提高植物抗旱能力有重要作用。

附圖說(shuō)明

圖1為部分T1代抗性植株的PCR鑒定結(jié)果。

圖2為部分T3代植株中DT1基因和eIF4a基因的表達(dá)量。

圖3為提高DT1基因表達(dá)能降低擬南芥子葉氣孔密度。

圖4為提高DT1基因表達(dá)能降低擬南芥真葉氣孔密度。

圖5為提高DT1基因表達(dá)能降低擬南芥離體葉片失水速率。

圖6為提高DT1基因表達(dá)能降低擬南芥蒸騰速率。

圖7為提高DT1基因表達(dá)能提高擬南芥抗旱能力。

具體實(shí)施方式

以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。

質(zhì)粒pMDC32：參考文獻(xiàn)：Zhang,M.,Henquet,M.,Chen,Z.,Zhang,H.,Zhang,Y.,Ren,X.,van der Krol,S.,Gonneau,M.,Bosch,D.,and Gong,Z.(2009).LEW3,encoding a putative alpha-1,2-mannosyltransferase(ALG11)in N-linked glycoprotein,plays vital roles in cell-wall biosynthesis and the abiotic stress response in Arabidopsis thaliana.Plant J 60,983-999.。

哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0，在附圖中用Col表示)：參考文獻(xiàn)：Wang,L.,Hua,D.,He,J.,Duan,Y.,Chen,Z.,Hong,X.,and Gong,Z.(2011).Auxin Response Factor2(ARF2)and its regulated homeodomain gene HB33mediate abscisic acid response in Arabidopsis.PLoS genetics 7,e1002172.；在文獻(xiàn)中的名稱為“Arabidopsis thaliana，Columbia ecotype”。

根癌農(nóng)桿菌C58：參考文獻(xiàn)：Steven J.Clough and Andrew F.Bent(1998)Floral dip:a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.The Plant Journal 16(6),735–743.。

Gateway克隆入門試劑盒(pENTR^TM/TEV/D-Cloning Kit)：Life Technologies公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為k2525-20。

Gateway克隆表達(dá)試劑盒(LRII Enzyme mix)：Life Technologies公司，產(chǎn)品目錄號(hào)為11791-020。

DT1蛋白如序列表的序列1所示，其編碼序列如序列表的序列2自5’末端第5位至第1162位核苷酸所示。

實(shí)施例1、重組質(zhì)粒的構(gòu)建

一、引物的設(shè)計(jì)和合成

F1：5'-CACCATGATACATTACGAACAAAACA-3'；

R1：5'-TCACTCGCATTCTCCTTCAGT-3'。

1、提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

2、以步驟1得到的cDNA為模板，采用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(經(jīng)測(cè)序，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如序列表的序列2所示)。

3、取步驟2得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用Gateway克隆入門試劑盒并按試劑盒說(shuō)明書操作，得到入門克隆(將所述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物導(dǎo)入了所述試劑盒中的pENTR/TEV/D-vector，得到入門克隆)。

4、取入門克隆，采用Gateway克隆表達(dá)試劑盒并按試劑盒說(shuō)明書操作，將序列2所示的DNA分子插入質(zhì)粒pMDC32的attR1位點(diǎn)和attR2位點(diǎn)之間，得到表達(dá)克隆，將其命名為重組質(zhì)粒pMDC32-DT1。

實(shí)施例2、DT1基因過(guò)表達(dá)植株的獲得

一、DT1基因過(guò)表達(dá)植株的獲得

1、將重組質(zhì)粒pMDC32-DT1導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌C58，得到重組農(nóng)桿菌。

2、取步驟1得到的重組農(nóng)桿菌，采用花序浸泡法將重組質(zhì)粒pMDC32-DT1導(dǎo)入哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，收獲種子。

3、將步驟2得到的種子播種于含60mg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基，篩選抗性植株(T1代植株)。

4、提取T1代植物的基因組DNA，進(jìn)行PCR鑒定。

PCR鑒定的引物對(duì)如下(F2對(duì)應(yīng)載體骨架，R1對(duì)應(yīng)DT1基因)：

F2：5'-AAGTTCATTTCATTTGGAGAGGACC-3'；

R1：5'-TCACTCGCATTCTCCTTCAGT-3'。

如果PCR鑒定為陽(yáng)性(PCR擴(kuò)增得到約1266bp的擴(kuò)增產(chǎn)物)，該植株即為轉(zhuǎn)基因植株。部分T1代植物的PCR鑒定結(jié)果見(jiàn)圖1。每個(gè)植株的后代即為一個(gè)株系。

5、將步驟4中PCR鑒定為陽(yáng)性的植株自交并收獲種子(T2代種子)。

6、將步驟5得到的種子培育為植株(T2代植株)并單株收種子(T3代種子)。

7、將T3代種子播種到含60mg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基，篩選抗性不分離的純合單株(即篩選其T3代種子不發(fā)生抗性分離的T2代植株，該植株為純合的轉(zhuǎn)基因植株)，將其種子(T3代種子)進(jìn)行實(shí)施例3的各項(xiàng)檢測(cè)和鑒定。

二、轉(zhuǎn)空載體植株的獲得

用質(zhì)粒pMDC32代替重組質(zhì)粒pMDC32-DT1進(jìn)行步驟一，得到轉(zhuǎn)空載體植株。

實(shí)施例3、DT1基因過(guò)表達(dá)植株的鑒定

一、DT1基因表達(dá)水平檢測(cè)

待測(cè)種子如下：L4株系(30粒T3代種子)、L6株系(30粒T3代種子)、L9株系(30粒T3代種子)、L10株系(30粒T3代種子)、L11株系(30粒T3代種子)、L13株系(30粒T3代種子)、L14株系(30粒T3代種子)，L15株系(30粒T3代種子)、L16株系(30粒T3代種子)和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(30粒種子)。

在MS固體培養(yǎng)基上播種待測(cè)種子并培養(yǎng)，種子萌發(fā)8天后提取RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用F1和R1組成的引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)DT1基因的表達(dá)量。采用eIF4a基因?yàn)閮?nèi)參基因。

DT1基因和eIF4a基因的表達(dá)量如圖2所示。結(jié)果表明，哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中，DT1基因的本底表達(dá)非常低。與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因株系L4、L6、L9、L11、L13和L15中DT1基因的表達(dá)量都顯著增高。

二、DT1基因?qū)χ参餁饪酌芏鹊挠绊?/p>

1、DT1過(guò)表達(dá)植株的子葉氣孔密度統(tǒng)計(jì)

待測(cè)種子如下：L4株系(30粒T3代種子)、L6株系(30粒T3代種子)、L9株系 (30粒T3代種子)、L10株系(30粒T3代種子)、L11株系(30粒T3代種子)、L13株系(30粒T3代種子)、L14株系(30粒T3代種子)，L15株系(30粒T3代種子)、L16株系(30粒T3代種子)、轉(zhuǎn)空載體植株(30粒T3代種子)和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(30粒種子)。

在MS固體培養(yǎng)基上播種待測(cè)種子并培養(yǎng)，種子萌發(fā)8天后測(cè)量子葉下表皮的氣孔密度。結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，L4株系、L6株系、L9株系、L11株系、L13株系、L15株系植株的子葉下表皮的氣孔密度均顯著降低。轉(zhuǎn)空載植株與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥沒(méi)有顯著差異。

2、DT1過(guò)表達(dá)植株的真葉氣孔密度統(tǒng)計(jì)

待測(cè)種子如下：L4株系(30粒T3代種子)、L15株系(30粒T3代種子)、轉(zhuǎn)空載體植株(30粒T3代種子)和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(30粒種子)。

在MS固體培養(yǎng)基上播種待測(cè)種子并培養(yǎng)，種子萌發(fā)30天后，測(cè)量第六片蓮座葉上表皮的氣孔密度和下表皮的氣孔密度。

結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，L4株系和L15株系真葉上表皮及真葉下表皮氣孔密度均顯著降低。轉(zhuǎn)空載植株與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥沒(méi)有顯著差異。

三、DT1基因過(guò)表達(dá)對(duì)植物葉片蒸騰速率及抗旱性的影響

1、DT1基因過(guò)表達(dá)對(duì)植物葉片失水速率的影響

待測(cè)種子如下：L4株系(30粒T3代種子)、L15株系(30粒T3代種子)、轉(zhuǎn)空載體植株(30粒T3代種子)和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(30粒種子)。

在裝有土的花盆中播種待測(cè)種子并培養(yǎng)，種子萌發(fā)35天后，取蓮座葉并測(cè)定離體葉片失水速率(檢測(cè)葉片失水速率的參考文獻(xiàn)：Xiao Feng Zhou,Yin Hua Jin,Chan Yul Yoo,Xiao-Li Lin,Woe-Yeon Kim,Dae-Jin Yun,Ray A.Bressan,Paul M.Hasegawa,and Jing Bo Jin(2009).CYCLIN H；1Regulates Drought Stress Responses and Blue Light-Induced Stomatal Opening by Inhibiting Reactive Oxygen Species Accumulationin Arabidopsis.Plant PhysiolVol162,1030-41.)。

結(jié)果見(jiàn)圖5。結(jié)果表明，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，L4株系和L15株系的失水速率均顯著降低。轉(zhuǎn)空載植株與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥沒(méi)有顯著差異。

2、DT1基因過(guò)表達(dá)對(duì)植物蒸騰速率的影響

待測(cè)種子如下：L15株系(30粒T3代種子)、轉(zhuǎn)空載體植株(30粒T3代種子)和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(30粒種子)。

在裝有土的花盆中播種待測(cè)種子并培養(yǎng)，種子萌發(fā)35天后，用保鮮膜包裹花盆，在天平上連續(xù)測(cè)定蒸騰速率(將所有花盆放到天平上連續(xù)記錄72小時(shí)，每五分鐘記錄 一次重量，減少的重量即為蒸騰失水量)。檢測(cè)植物蒸騰速率的參考文獻(xiàn)：Chan Yul Yoo,Heather E.Pence,Jing Bo Jin,Kenji Miura,Michael J.Gosney,Paul M.Hasegawa and Michael V.Mickelbart(2010).The Arabidopsis GTL1Transcription Factor Regulates Water Use Efficiency and Drought Tolerance by Modulating Stomatal Density via Transrepression of SDD1.Plant Cell 2010；22；4128-4141.)。

結(jié)果見(jiàn)圖6(縱坐標(biāo)中的cm^-2指的是每平方厘米葉片)。結(jié)果表明，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，L15株系的蒸騰速率顯著降低。轉(zhuǎn)空載植株與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥沒(méi)有顯著差異。

3、DT1基因過(guò)表達(dá)對(duì)植物抗旱性的影響

待測(cè)種子如下：L4株系(100粒T3代種子)、L15株系(100粒T3代種子)、轉(zhuǎn)空載體植株(100粒T3代種子)和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(100粒種子)。

在裝有相同重量土的花盆中播種待測(cè)種子并培養(yǎng)，從播種開(kāi)始計(jì)時(shí)，第1至14天正常管理，第15至25天干旱處理(干旱處理即持續(xù)不澆水)，第26天開(kāi)始正常管理(恢復(fù)澆水，簡(jiǎn)稱復(fù)水)。分別于第24天結(jié)束時(shí)、第25天結(jié)束時(shí)、第26天結(jié)束時(shí)(復(fù)水1天后)、第28天結(jié)束時(shí)(復(fù)水3天后)拍照，第28天結(jié)束時(shí)(復(fù)水3天后)統(tǒng)計(jì)存活率。

照片見(jiàn)圖7。

哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的存活率為5％，轉(zhuǎn)空載植株的存活率為6％，L4株系的存活率為100％，L15株系的存活率為100％。結(jié)果表明，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相比，L4株系和L15株系的抗旱性顯著增加。