本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可抑制生物浸出過程中黃鉀鐵礬生成的寡營養(yǎng)細菌組合。

背景技術(shù)：

根據(jù)現(xiàn)有研究知道，黃銅礦難用于生物浸出的原因不僅是其具有較高的晶格能，更重要的是在浸出過程中礦物表面會生成一層致密的鈍化膜，從而阻礙營養(yǎng)物質(zhì)、微生物和反應(yīng)產(chǎn)物在礦物表面與溶液之間的傳遞，并抑制銅的持續(xù)浸出。而這層鈍化膜的成分及其生成機制與礦物表面的吸附微生物、胞外多聚物、礦物分解產(chǎn)物和溶液中生成產(chǎn)物等有著密切的聯(lián)系。一般認為，浸礦微生物吸附到礦物表面后，通過產(chǎn)生胞外多聚物富集三價鐵離子，從而氧化分解黃銅礦。黃銅礦分解釋放的單質(zhì)硫會附著在胞外多聚物上面，成為影響礦物浸出的一部分。隨著反應(yīng)的進行，溶液中的氧化還原地位和三價鐵離子濃度逐步升高，各種鐵礬沉淀會隨之產(chǎn)生。另外，由于浸礦系統(tǒng)中胞外多聚物一旦生成，很難降解或溶解，它們會一直覆蓋在礦物表面，從而介導(dǎo)各類沉淀物質(zhì)覆蓋于礦物表面。因此，可以認為鈍化膜就是指存在于礦物表面與溶液之間，阻礙礦物持續(xù)分解的一層致密的由無機物和有機物共同組成的物質(zhì)，它們主要包括礦物分解過程中產(chǎn)生的單質(zhì)硫和非溶性硫化合物，浸出系統(tǒng)中生成的各種鐵礬沉淀(主要指黃鉀鐵礬)，吸附微生物本身及其分泌的胞外多聚物，部分浸出副產(chǎn)物如硫酸鉛等。

黃鉀鐵礬(KFe₃(OH)₆(SO₄)₂)是生物冶金過程中一種常見的浸出產(chǎn)物，并覆蓋于礦物表面。當浸出系統(tǒng)中黃鉀鐵礬較多時，它們會在礦物表面結(jié)合其他物質(zhì)形成一層致密的鈍化膜，從而抑制黃銅礦的持續(xù)浸出。有研究表明，浸礦系統(tǒng)中黃鉀鐵礬一旦生成，比較難以去除。因此，減少或阻礙黃鉀鐵礬沉淀的形成對黃銅礦生物浸出尤其重要。

生物浸出體系以及酸性礦坑水中的有機碳濃度往往低于20mg/l，是典型的寡營養(yǎng)環(huán)境，其中生長著豐富的寡營養(yǎng)微生物。在硫化礦的生物浸出體系中，寡營養(yǎng)細菌的主要作用是分解具有浸礦功能的細菌產(chǎn)生的有機代謝物，從而消除有機廢物對浸礦微生物的毒害，并進而促進礦物的浸出效果。到目前為止，科學(xué)研究者已經(jīng)從該環(huán)境中分離出了許多寡營養(yǎng)微生物，例如Alicyclobacillus spp.、Acidocella spp.、Acidisphaera spp.、Picrophilus spp.、Acidobacterium spp.、 Thermoplasma spp.、Acidomonas spp.等。

Alicyclobacillus(脂環(huán)酸芽孢桿菌屬細菌)是一類嗜酸耐熱、細胞膜中往往含有ω-環(huán)狀脂肪酸結(jié)構(gòu)的芽孢桿狀細菌，由Wisotzkey等在1992年命名成立。該屬細菌廣泛存在于酸性果汁飲料、礦山、熱泉和火山附近土壤等酸熱環(huán)境中。目前對該屬細菌的研究主要集中在食品防腐領(lǐng)域中。多項研究表明該屬細菌具有廣泛的底物利用特性，可以氧化Fe²⁺、元素硫以及硫化礦等，在厭氧或微氧的條件下可以還原Fe(OH)₃以及針鐵礦等鐵的沉淀物中的Fe³⁺，因此該屬細菌在生物冶金中具有巨大應(yīng)用潛力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于，提供一個寡營養(yǎng)細菌組合。該菌組合可以利用外加碳源，還原體系中的三價鐵離子，從而抑制黃鉀鐵礬的生成。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種可以分離培養(yǎng)寡營養(yǎng)細菌組合的培養(yǎng)基。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種可以富集培養(yǎng)寡營養(yǎng)細菌組合的培養(yǎng)基。

本發(fā)明的第四個目的是提供一種寡營養(yǎng)細菌的富集、分離培養(yǎng)方法。

本發(fā)明的第五個目的是提供一種利用寡營養(yǎng)細菌組合體系抑制黃銅礦生物浸出過程中黃鉀鐵礬生成的應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種寡營養(yǎng)細菌組合，由脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A，脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-B和脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-AP-AC組成；

其中，脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A的保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為：2012年12月26日，保藏編號為：CGMCC No.7038；

脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-B的保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為：2012年12月26日，保藏編號為：CGMCC No.7039；

脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-AP-AC的保藏單位為：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為：2012年12月26日，保藏編號為：CGMCC No.7040。

優(yōu)選地，所述脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A，脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-B和脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-AP-AC的比例為1：1：1。

本發(fā)明還提供用于分離培養(yǎng)上述寡營養(yǎng)細菌組合的培養(yǎng)基為：0.25g酵母粉；0.5g蛋白胨；0.25g NaCl和1000ml蒸餾水，混勻后添加吉蘭膠30g/L，調(diào)pH至3.0，121℃滅菌25分鐘。

本發(fā)明還提供用于富集培養(yǎng)上述寡營養(yǎng)細菌組合的培養(yǎng)基為：0.25g酵母粉，0.5g蛋白胨，0.25g NaCl和1000ml蒸餾水，調(diào)pH至3.0，121℃滅菌25分鐘。

本發(fā)明還提供所述的寡營養(yǎng)細菌組合的培養(yǎng)方法為：將寡營養(yǎng)細菌組合接種入上所述的培養(yǎng)基中，在30-55℃的溫度下，100rpm搖床培養(yǎng)3-20天。

如上所述的寡營養(yǎng)細菌，其獲得方法為：

所述寡營養(yǎng)細菌組合的樣品來自江西德興銅礦采集礦堆浸礦堆，經(jīng)過富集、培養(yǎng)、純化步驟獲得純菌，采用分子生物學(xué)技術(shù)確定菌種的系統(tǒng)發(fā)育地位，技術(shù)路線為：總DNA提取→16S rDNA片段擴增→測定序列→Blast比較分析；

本發(fā)明通過對照試驗進行了Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC按1：1：1組合對黃銅礦的的生物浸出的影響實驗研究，利用X-射線衍射光譜(XRD)分析技術(shù)，探索Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC在黃銅礦生物浸出中對黃鉀鐵礬的影響。

具體方法為：向200mL普通自來水中加入5-10w/v％黃銅礦礦粉和0.05-0.5w/v％酵母粉，酸平衡至pH1.6-1.75；待礦物進行酸平衡之后，開始進行生物浸出實驗，設(shè)置4組生物浸出實驗，分別為空白對照組，不接種任何細菌培養(yǎng)物；自養(yǎng)菌群組，接種已經(jīng)馴化好的自養(yǎng)菌群Acidithiobacillus caldus OY(CCTCC NO：M2010356)；寡營養(yǎng)細菌組，接種Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC(1：1：1)；4，混合菌組，同時接種數(shù)量比例為1:1的自養(yǎng)菌群Acidithiobacillus caldus OY(CCTCC NO：M2010356)和Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC(1：1：1)。每組實驗設(shè)置3個平行重復(fù)。4種浸礦體系的礦渣進行了X-射線衍射光譜(XRD)分析。

其中所用Acidithiobacillus caldus OY為可用于黃銅礦的浸礦微生物，該菌已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址：中國武漢武漢大學(xué)，保藏時間：2010年12月17日，保藏編號：CCTCC NO：M2010356。

本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明提供一種寡營養(yǎng)細菌組合，及其培養(yǎng)基和富集、分離培養(yǎng)方法，以 及該寡營養(yǎng)菌組合在抑制生物浸出過程中黃鉀鐵礬生成中的應(yīng)用。該菌組合可以利用外加碳源，還原體系中的三價鐵離子，從而抑制黃鉀鐵礬的生成總量，并且即使形成黃鉀鐵礬也不是包裹于礦石表面，而是成為絮狀顆粒聚集在一起形成團塊狀，不影響黃銅礦礦石的生物浸出，提高了黃銅礦的生物浸出效率，解決了黃銅礦難于生物浸出的問題。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的寡營養(yǎng)細菌組合培養(yǎng)時所用抽濾裝置。

圖2A為本發(fā)明的寡營養(yǎng)細菌Biometek-A的掃描電鏡照片。

圖2B為本發(fā)明的寡營養(yǎng)細菌Biometek-B的掃描電鏡照片。

圖2C為本發(fā)明的寡營養(yǎng)細菌Biometek-AP-AC的掃描電鏡照片。

圖3為本發(fā)明的寡營養(yǎng)細菌的DNA提取電泳圖。

圖4為本發(fā)明的寡營養(yǎng)細菌的16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖譜。

圖5A-圖5D為浸出體系的浸渣XRD圖譜，其中圖5A為空白對照組，圖5B為本發(fā)明的寡營養(yǎng)細菌組合組，圖5C為自養(yǎng)菌Acidithiobacillus caldus OY組，圖5D為寡營養(yǎng)細菌組合和Acidithiobacillus caldus OY的混合菌組。

圖6A-圖6E為不同浸出體系中黃銅礦浸出前后的掃描電鏡照片，其中，圖6A為浸出前，圖6B為空白對照，圖6C為本發(fā)明的寡營養(yǎng)細菌組合組，圖6D為自養(yǎng)菌Acidithiobacillus caldus OY組，圖6E為寡營養(yǎng)細菌組合和Acidithiobacillus caldus OY的混合菌組。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，以下所舉實施例是為便于更好地理解本發(fā)明，但并不用來限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的實驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到。

本發(fā)明所涉及的寡營養(yǎng)細菌組合，由脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-A，脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-B和脂環(huán)酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus sp.)Biometek-AP-AC組成。均保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期均為：2012年12月26日，保藏編號分別為：CGMCC No.7038，CGMCC No.7039和CGMCC No.7040。該三種寡營養(yǎng)細菌按1：1：1比例組成。

實施例1：寡營養(yǎng)細菌的獲得

步驟1、富集

本發(fā)明所獲得的含寡營養(yǎng)細菌的水樣取自江西德興銅礦采集礦坑水。按照100ml水樣加入0.3g酵母粉比例，在不同溫度(30℃、45℃、55℃)下平行培養(yǎng)三組，100rpm搖床輕輕震蕩培養(yǎng)1周。利用顯微鏡檢測判斷細菌生長情況，發(fā)現(xiàn)在45℃下細菌生長情況最好，收集45℃溫度下寡營養(yǎng)菌培養(yǎng)液。

步驟2、培養(yǎng)基配制

分離培養(yǎng)基基本配制方法為：稱取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25g NaCl和1000mL蒸餾水，混合均勻加人吉蘭膠30g/L。按比例配制100mL培養(yǎng)基，調(diào)pH為3.0，121℃滅菌25分鐘，滅菌后每10mL倒一塊平板，備用。

富集培養(yǎng)基基本配制方法為：稱取0.25g酵母粉、0.5g蛋白胨、0.25g NaCl和1000mL蒸餾水，調(diào)pH為3.0，121℃滅菌25分鐘。

步驟3、培養(yǎng)

使用如圖1所示抽濾裝置，采用膜過濾法(0.2μm)將上述步驟1中收獲的寡營養(yǎng)細菌培養(yǎng)液過濾，并將細菌用20mL無菌水洗下。以5v/v％的接種量接種于100mL富集培養(yǎng)基中，45℃搖床100rpm進行培養(yǎng)，并設(shè)有不接種對照即空白對照(CK)。培養(yǎng)兩周后觀察細菌生長情況。

步驟4、分離純化

將步驟3培養(yǎng)的寡營養(yǎng)細菌進行梯度稀釋(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5)，分別取100μL稀釋液涂步驟2制作的分離培養(yǎng)基平板，45℃培養(yǎng)三天。得到部分單菌落。

將單菌落按上述梯度稀釋法依次進行純化，共純化4次，得到3株菌落形態(tài)稍有差異的純菌菌落，分別命名為Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC。

步驟5、形態(tài)觀察

通過掃描電鏡觀察分離菌種的形態(tài)特征，菌體形態(tài)如圖2A至圖2C所示。

實施例2：寡營養(yǎng)細菌Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC的系統(tǒng)發(fā)育地位的確定

步驟1、DNA提取

分別使用如下方法提取Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC，獲得相應(yīng)的菌的總DNA：

在無菌條件下取1.5ml菌液加入Eppendorf離心管中；經(jīng)4℃、5000rpm離心5分鐘，收集菌體；以1×TES液懸浮菌體，經(jīng)5000rpm離心5分鐘，洗滌菌體2次；將菌體重新懸浮于435μl的TES液中，將菌體充分打散；加入溶菌酶(20mg/ml) 125ul，蛋白酶K(10mg/ml)2.5μl，37℃水浴輕輕振蕩保溫2小時，加入50μl 20％的SDS，于37℃水浴輕輕振蕩保溫，至溶液完全澄清；加入5M NaClO₄ 125μl，用等體積的酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)抽提4～5次，至界面無蛋白膜出現(xiàn)為止；加入Rnase 2～5μl(10mg/ml)，在37℃保溫30～60分鐘；用氯仿：異戊醇(24：1)抽提一次；吸取上層水相置于冰浴，加入1/10倍體積的3MNaAc-EDTA-Na₂，并加入2倍體積冷的無水乙醇，翻轉(zhuǎn)混勻，冰浴5分鐘；經(jīng)12000rpm離心20分鐘，使DNA沉淀；加入70％乙醇脫鹽，4℃過夜，離心，吸出乙醇；加入95％乙醇脫水，離心，吸出乙醇；風(fēng)干，加50μL蒸餾水溶解，獲得總DNA。

將提取獲得的Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC的總DNA分別標記為1、2、3。

步驟2、DNA提取結(jié)果

分別取三種菌的總DNA，各自按5μL DNA與1μL上樣緩沖液的比例混合，用0.8％的瓊脂糖凝膠進行電泳，90V電泳30min，然后取出，放入濃度為10mg/ml的EB中染色20min，再放入AlphaImager 2200凝膠成像系統(tǒng)，在波長為302nm的紫外光激發(fā)熒光，攝錄成像，結(jié)果如圖3，其中M為DNA marker。

由圖3可見三種菌分別提取的總DNA大小均在23KB左右，并且DNA均較完整，紫外分光光度計測定OD260/OD280為1.82，可見純度較高，沒有蛋白和RNA殘留，將三種菌的DNA濃度均調(diào)整為25μg/ml用于后續(xù)的實驗的模板DNA。

步驟3、PCR擴增16S rDNA部分序列

分別對三種菌擴增16S rDNA部分序列，反應(yīng)步驟如下：

A、設(shè)計通用引物：

27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'

1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'

B、PCR反應(yīng)體系(50μl)：

C、PCR反應(yīng)條件：

步驟4、16S rDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測

將三種菌的PCR產(chǎn)物使用2％瓊脂糖凝膠進行電泳，90V電泳30min，兩側(cè)條帶M為DNA marker。從圖4可看出，三種菌的PCR產(chǎn)物的大小均在1500bp左右，符合所用的引物，且條帶單一，亮度較大，說明PCR條件較好。

步驟5、PCR產(chǎn)物測序

將三種菌的PCR產(chǎn)物送上海生工測序。

步驟6、序列分析

所測得的序列經(jīng)Blast分析表明，3個分離菌種均屬于Alicyclobacillus屬，分別命名為Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC。送交中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心(CGMCC)進行保藏，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期：2012年12月26日，保藏編號分別為：CGMCC No.7038，CGMCC No.7039和CGMCC No.7040。

實施例3：寡營養(yǎng)細菌組合影響黃銅礦生物浸出體系中黃鉀鐵礬的生成實驗。

寡營養(yǎng)細菌組合是分別將鑒定保藏的Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC菌種接種到步驟2配置的200mL富集培養(yǎng)基中，45℃搖床100rpm培養(yǎng)一周，獲得三種細菌培養(yǎng)液。分別將培養(yǎng)液按照常規(guī)方法濃縮成菌泥，再根據(jù)菌量按照1:1:1的比例將三種菌混合。

自養(yǎng)菌Acidithiobacillus caldus OY的制備方法為：將自養(yǎng)菌Acidithiobacillus caldus OY接種到200mL 9K培養(yǎng)基(9K培養(yǎng)基配方：(NH₄)₂SO₄ 3.0g；KCl 0.1g；K₂HPO₄ 0.5g；MgSO₄·7H₂O 0.5g；Ca(NO₃)₂ 0.01g；FeSO₄·7H₂O 44.22g；蒸餾水1000.0ml；pH為1.8，按常規(guī)方法滅菌)中，45℃搖床100rpm培養(yǎng)一周。然后將菌液按照常規(guī)方法濃縮成菌泥。

反應(yīng)體系：取300mL的燒瓶，裝入200mL普通自來水，并加入10％黃銅礦礦 粉，0.1％酵母粉，用20％濃度的硫酸進行酸平衡至pH為1.7。

待礦物進行酸平衡之后，開始進行生物浸出實驗，設(shè)置4組生物浸出實驗，分別為：空白對照，不接種任何細菌培養(yǎng)物；寡營養(yǎng)細菌組，接種本發(fā)明的寡營養(yǎng)細菌Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC組合(三種菌比例1：1：1)；自養(yǎng)菌組，接種已經(jīng)馴化好的自養(yǎng)菌群Acidithiobacillus caldus OY；混合菌組，接種寡營養(yǎng)細菌Biometek-A，Biometek-B和Biometek-AP-AC組合和Acidithiobacillus caldus OY的混合菌，二者接種比例為1:1。保證每組總接菌量相同。每組實驗設(shè)置3個平行重復(fù)。

接種后，在45℃搖床100rpm培養(yǎng)一周，對4組浸礦體系中的礦渣進行了X-射線衍射光譜(XRD)分析。其結(jié)果如圖5A至圖5D所示。可以看到在寡營養(yǎng)細菌組(圖5B)和自養(yǎng)菌組(圖5C)的礦渣表面均檢測到黃銅礦CuFeS₂和黃鉀鐵礬KFe₃(SO₄)₂(OH)₆，在混合菌組(圖5D)中的礦渣表面檢測到了黃銅礦CuFeS₂和水合氫鐵礬的混合物(Fe,H₃O)Fe₃(SO₄)₂(OH)₆，在無菌的空白對照組(圖5A)的礦渣表面檢測到了黃銅礦CuFeS₂、黃鐵礦FeS₂和元素硫S⁰。

同時，對不同浸出體系中的黃銅礦的浸渣進行了掃描電鏡觀察和微區(qū)分析(SEM-EDS)，結(jié)果如圖6A至圖6E所示。在不同的浸礦體系中，黃鉀鐵礬等沉淀物在黃銅礦表面的賦存狀態(tài)不同。具體表現(xiàn)為，浸出前(圖6A)和無菌浸礦組(圖6B)中，鐵離子主要以Fe²⁺形式出現(xiàn)，沒有生成可觀測到的鐵沉淀物，更沒有觀察到黃鉀鐵礬的存在，圖6A中A表示浸礦前礦石的表面光滑。在寡營養(yǎng)細菌組(圖6C)中，黃銅礦表面沒有明顯的黃鉀鐵礬，僅有少量黃鉀鐵礬呈絮狀聚集在一起，圖中B所示落在礦石上的很松散的黃鉀鐵礬。自養(yǎng)菌組(圖6D)中，形成大量黃鉀鐵礬顆粒，并覆蓋在黃銅礦表面，形成一層厚厚的鐵礬層(如圖中C所示)。在混合菌組(圖6E)中，黃銅礦表面觀察到有少量的黃鉀鐵礬顆粒(如圖中D所示)，另有部分黃鉀鐵礬呈絮狀顆粒聚集在一起形成團塊狀。

從上述結(jié)果可以看出，在浸礦自養(yǎng)菌Acidithiobacillus caldus OY單獨存在的浸礦體系中，黃鉀鐵礬大量生成并包裹在黃銅礦表面，影響黃銅礦的進一步浸出；而在含有寡營養(yǎng)細菌組合的體系中，黃鉀鐵礬生成量下降，并且絮狀顆粒聚集在一起形成團塊狀，而沒有包裹在黃銅礦表面，使得黃銅礦的生物浸出過程基本不受影響。