本發(fā)明涉及有機化學和藥物化學領域，具體為一種鬼臼毒素與去甲斑蝥素的拼合物，以及這種化合物的制備方法和用途。

背景技術：

在腫瘤的治療過程中，基于單一生物靶標或途徑的抗腫瘤藥物在臨床上已經得到廣泛的應用(Nature.2004,432,294–297)。它們對特定的生物靶點或作用途徑表現出較好的藥效，并降低了藥物副作用的風險(Nat.Rev.Drug Discov.2006,5,993–996)。然而，腫瘤是一種具有多種病因網絡的復雜疾病。在很多情況下，當一種特定的靶標或路徑被完全阻斷后，腫瘤細胞會通過其它潛在的作用途徑補償這種改變，使作用效果大大降低，甚至消失。故現在普遍認為，作用于多個作用靶點的藥物要比作用單一的藥物在臨床上對疾病有更好的治療效果(Nat.Rev.Cancer.2009,9,508–516)。對于多因素多靶點疾病的治療，一是通過多種單一靶點藥物的聯(lián)合用藥來實現，還可以用一種同時作用于多個與疾病相關因素的多個靶點藥物來治療。盡管聯(lián)合用藥在臨床對腫瘤的治療已經廣泛在使用，但是這些藥物在使用過程中表現復雜的藥代動力學性質、藥物相互作用和毒理學特征(Drug Discov.Today.2007,12,34–42)。因此，在癌癥的治療過程中人們更加傾向于發(fā)現能夠同時作用于多個作用靶點的藥物。

依托泊苷(VP-16)作為一種重要的抗腫瘤藥物，被國際衛(wèi)生組織推薦為抗腫瘤特別是肺癌的首選藥物之一，也是我國抗腫瘤基本藥物之一，廣泛應用于小細胞肺癌、急性白血病及前列腺癌等多種癌癥的治療。它主要通過抑制拓撲異構酶Ⅱ(TOP-Ⅱ)起作用(Curr.Med.Chem.Anti-Cancer Agents 2005,5,363–372)。VP-16通過捕獲由TOP-Ⅱ介導的DNA斷裂復合物來形成三重穩(wěn)定復合物，誘導的細胞死亡。這類表鬼臼類化合物的作用是使DNA不能正常重組，從而激活表達致死性蛋白酶。但該藥仍存在耐藥性、水溶性差、嚴重的骨髓抑制和胃腸道反應、生物利用度低以及可能誘發(fā)繼發(fā)性急性髓細胞白血病等缺點(Pharmacogenet.Genom.2009,19,552–553)。

斑蝥素是昆蟲綱鞘翅目(Coleoptera)芫菁科(Meloidae)斑芫菁屬(Mylabris)昆蟲斑蝥的主要成分，在臨床上主要用于肝癌、肺癌以及是消化道癌的治療，但是由于斑蝥素具有嚴重的腎毒性和炎癥副作用，從而限制其在臨床上的廣泛使用(Toxicol.Pathol.2006,34,319；Biochem.Pharmacol.2014,87,399)。去甲斑蝥素(NCTD),是抗腫瘤藥物斑蝥素去甲基衍生物，與斑蝥素相比可以有效的降低對腎臟的毒性作用以及炎癥等副作用，在體外對多種腫瘤細胞株具有明顯的抑制作用，在臨床上主要用于肝癌的治療(Eur.J.cancer.1995,31A,953；Bioorg.Med.Chem.Lett.2000，10，1687)。

因此，本發(fā)明利用多靶點物設計的藥效團結合法,設計合成一種鬼臼毒素與去甲斑蝥素的拼合物，體外實驗結果表明這種化合物對癌細胞具有較好的細胞毒活性、較低的毒性和適當的脂水分配系數，是一種具有開發(fā)為新型抗癌藥物的化合物；在制備方法上，本發(fā)明通過簡單方法高效地合成了關鍵中間體及其目標化合物。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的之一在于，將兩個具有不同抗癌作用機理的化合物拼合成為一種新的化合物，期望通過多靶點作用機制實現提高所設計化合物的抗癌效果及降低其毒性。細胞毒性實驗發(fā)現本發(fā)明化合物對多種癌細胞具有較強的體外抑制作用，同時對正常細胞的毒性較小。

本發(fā)明的目的之二在于，提供一種制備上述鬼臼毒素與去甲斑蝥素拼合物的方法。

一種具有抗癌活性的結構如式Ⅰ的化合物，

其中：

R為氫，或甲基，或異丙基，或新丁基，或異丁基，或甲硫亞甲基，或苯基，或芐基，或羥甲基，或2-羥基乙基，或對羥基芐基，或2-苯并吡咯亞甲基。

一種具有抗癌活性的結構如式Ⅱ的化合物，

其中：

n是2，或3。

一種具有抗癌活性的結構如式Ⅲ的化合物，

本發(fā)明中式Ⅰ所示化合物的制備方法，其特征是以去甲斑蝥素為原料，首先和甘氨酸，或L-丙氨酸，或L-纈氨酸，或L-亮氨酸，或L-異亮氨酸，或L-甲硫氨酸，或L-苯氨酸，或L-苯丙氨酸，或L-色氨酸反應生成甘氨酸去甲斑蝥酰亞胺，或L-丙氨酸去甲斑蝥酰亞胺，或L-纈氨酸去甲斑蝥酰亞胺，或L-亮氨酸去甲斑蝥酰亞胺，或L-異亮氨酸去甲斑蝥酰亞胺，或L-甲硫氨酸去甲斑蝥酰亞胺，或L-苯氨酸去甲斑蝥酰亞胺，或L-苯丙氨酸去甲斑蝥酰亞胺，或L-色氨酸去甲斑蝥酰亞胺(化學試劑.2010,32(2),111–113；化學研究與應用2009,21(2),254–257)；同時以去甲鬼臼毒素為原料，通過其4-位疊氮化并還原制得4β-胺基-4′-去甲表鬼臼毒素(Bioorg.Med.Chem.Lett.2007,17,2091–2095)；最后在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和1-羥基苯并三唑(HOBT)存在的條件下上述制得的兩類化合物發(fā)生反應得到式Ⅰ所代表的目標化合物。

本發(fā)明中式Ⅱ所示化合物的制備方法，其特征是以去甲斑蝥素為原料，首先和β-氨基丙酸，或γ-氨基丁酸反應生成β-氨基丙酸去甲斑蝥酰亞胺，或γ-氨基丁酸去甲斑蝥酰亞胺。然后與4β-氨基-4′-去甲表鬼臼毒素在EDCI和HOBT存在的條件下反應得到式Ⅱ所代表的目標化合物。

本發(fā)明中式Ⅲ所示化合物的制備方法，其特征是以去甲斑蝥素為原料，首先和對氨基苯甲酸反應生成對氨基苯甲酸去甲斑蝥酰亞胺，然后與4β-氨基-4′-去甲表鬼臼毒素在EDCI和HOBT存在的條件下反應得到式Ⅲ所代表的目標化合物。

本發(fā)明中式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所述的化合物的制備方法，其特征是反應中4β-氨基-4′-去甲表鬼臼毒素與相應去甲斑蝥酰亞胺反應的物質量比為1:1.05-1.20，反應溫度為20–40℃，催化劑為EDCI和HOBT。

本發(fā)明中式Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ所述的化合物對A-549、HepG2、HeLa和HCT-8四種癌細胞生長有顯著的抑制作用，其中的部分化合物對這些癌細胞增殖的抑制作用明顯強于臨床抗癌藥物VP-16，且對正常人胚胎肺成纖維細胞WI-38的毒性較低。因此本發(fā)明的化合物可用于制備抗癌藥物。

下面通過實施例進一步說明本發(fā)明的方法。應理解的是，本發(fā)明實施例的制備方法僅僅 是用于說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構思前提下對本發(fā)明制備方法的簡單改進都屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

附圖說明

圖1化合物Ⅱb對TOP-Ⅱ的影響

線1:超螺旋pBR322質粒DNA；線2:Topo-Ⅱ對照(Topo-Ⅱ+DNA)；線3:50μMⅡb+DNA+Topo-Ⅱ；線4:100μMⅡb+DNA+Topo-Ⅱ；線5:100μM V-P16+DNA+Topo-Ⅱ

具體實施方式

本發(fā)明提供以下的實施例：

實施例1：去甲斑蝥酰亞胺甘氨酸的制備

將去甲斑蝥素(336mg，2.0mmol)和甘氨酸(150mg，2.0mmol)置于小型研缽中，研磨均勻后將其轉移至50mL圓底燒瓶中，氮氣保護，油浴加熱至160-170℃，反應40mins后，反應物呈黃色油狀物，且不再有氣泡產生，即可終止反應，降至室溫，用丙酮重結晶得到白色結晶產物去甲斑蝥酰亞胺甘氨酸。¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆)δ4.63(s,2H),4.00(s,2H),3.10(s,2H),1.60–1.58(m,4H)。

用L-丙氨酸，或L-纈氨酸，或L-亮氨酸，或L-異亮氨酸，或L-甲硫氨酸，或L-苯氨酸，或L-苯丙氨酸，或L-色氨酸，或β-氨基丙酸，或γ-氨基丁酸，或對氨基苯甲酸分別代替甘氨酸，同法可制備去甲斑蝥酰亞胺L-丙氨酸，或去甲斑蝥酰亞胺L-纈氨酸，或去甲斑蝥酰亞胺L-亮氨酸，或去甲斑蝥酰亞胺L-異亮氨酸，或去甲斑蝥酰亞胺L-甲硫氨酸，或去甲斑蝥酰亞胺L-苯氨酸，或去甲斑蝥酰亞胺L-苯丙氨酸，或去甲斑蝥酰亞胺L-色氨酸，或β-N-(去甲斑蝥酰亞胺)-氨基丙酸，或γ-N-去甲斑蝥酰亞胺氨基丁酸，或對氨基-去甲斑蝥酰亞胺-苯甲酸。

實施例2：4β-氨基-4′-去甲表鬼臼毒素的制備

將4′-去甲表鬼臼毒素(4g,0.01mol)溶于干燥的二氯甲烷50mL中，然后向反應體系加入疊氮酸/苯溶液15mL，將反應體系冷卻至-15℃，然后開始緩慢滴加三氟化硼乙醚2.4mL，反應完全后加入吡啶淬滅反應。有機層后分別用水、稀鹽酸、碳酸氫鈉以及飽和食鹽水洗滌，干燥，過濾，蒸除溶劑，進一步純化得4β-N₃-4′-去甲表鬼臼毒素，產率85％。

4β-N₃-4′-去甲表鬼臼毒素(18g,0.042mol)溶于干燥的乙酸乙酯200mL中，然后加入10％Pd/C，在壓力為4MPa的氫氣氛下反應過夜，停止反應后，濾除鈀碳，蒸除溶劑，得白色固體4β-NH₂-4′-去甲表鬼臼毒素，產率90％。

實施例3：去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

將去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸(113mg，0.5mmol)溶于二氯甲烷中，冰浴攪拌下加入縮合劑EDCI，待其溶解后加入HOBt，再加入4β-氨基-4′-去甲表鬼臼毒素(210mg，0.53mmol)，繼續(xù)室溫反應過夜，待反應基本完全后停止反應，反應液用水并用無水Na₂SO₄干燥，蒸除濾 液得淡黃色粗產物，柱層析得白色固體純品,收率:68％。mp:201-203℃；IR(KBr cm^–1)3348,2953,1775,1705,1613,1516,1484,1393,1229,1112,1036,999,938；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ6.75(s,1H),6.50(s,1H),6.40(d,J＝7.2Hz,1H),6.27(s,1H),5.97(d,J＝5.4Hz,2H),5.24-5.21(m,1H),4.79(d,J＝4.8Hz,1H),4.61(d,J＝4.8Hz,1H),4.53(d,J＝4.8Hz,1H),4.33(t,J＝8.4Hz,1H),4.25(d,J＝16.2Hz,1H),4.16(d,J＝16.2Hz,1H),3.82(t,J＝9.6Hz,1H),3.75(s,6H),2.99-2.96(m,2H),2.92–2.90(m,1H),2.80(dd,J＝14.4,4.8Hz,1H),1.84-1.79(m,2H),1.63-1.61(m,2H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ176.3,176.2,174.5,165.5,148.2,147.4,146.4(2C),133.9,132.4,130.2,128.5,109.9,109.1,107.7(2C),101.5,79.8(2C),68.6,56.3(2C),49.9(2C),49.8,48.0,43.5,41.6,36.8,28.4,28.2；MS-ESI:629.1861([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)629.1731for[M+Na]⁺(calcd 629.1742for C₃₁H₃₀N₂O₁₁Na).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅰ a。

實施例4：去甲斑蝥酰亞胺基-L-丙氨酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基-L-丙氨酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:52％。mp:169-170℃；IR(KBr cm^–1)3379,2943,1774,1704,1614,1515,1484,1391,1228,1114,1035,998,931；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ6.71(s,1H),6.48(s,1H),6.27(s,2H),5.99-5.98(m,2H),5.91(d,J＝7.8Hz,1H),5.43(s,1H),5.31-5.27(m,1H),4.76-4.74(m,3H),4.54(d,J＝4.8Hz,1H),4.34(t,J＝8.4Hz,1H),3.94(t,J＝9.9Hz,1H),3.76(s,6H),2.96-2.90(m,3H),2.81(dd,J＝14.4,4.8Hz,1H),1.87-1.85(m,2H),1.63-1.61(m,2H),1.59(d,J＝7.2Hz,3H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ176.6,176.3,174.6,168.1,148.3,147.5,146.4(2C),133.9,132.3,130.3,128.8,110.0,109.0,107.7(2C),101.5,80.2,80.0,68.5,56.4(2C),49.6(2C),49.5,49.4,48.0,43.5,41.4,36.6,30.9,28.4,28.1,13.7；MS-ESI:643.2007([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)643.1887for[M+Na]⁺(calcd643.1898for C₃₂H₃₂N₂O₁₁Na).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅰ b。

實施例5：去甲斑蝥酰亞胺基-L-纈氨酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基-L-纈氨酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:57％。mp:163-165℃；IR(KBr cm^–1) 3368,2966,1775,1705,1613,1505,1484,1386,1228,1114,1037,999,930；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ6.68(s,1H),6.53(d,J＝7.2Hz,1H),6.50(s,1H),6.28(s,2H),5.98(d,J＝3.6Hz,2H),5.30(s,1H),5.18-5.15(m,1H),4.86(d,J＝4.2Hz,1H),4.78(d,J＝3.6Hz,1H),4.56(d,J＝4.8Hz,1H),4.36(t,J＝8.4Hz,1H),4.25(d,J＝10.2Hz,1H),3.85(t,J＝9.9Hz,1H),3.76(s,6H),2.96-2.90(m,3H),2.84(dd,J＝14.4,4.8Hz,1H),2.77–2.74(m,1H),1.89-1.86(m,2H),1.62-1.60(m,2H),1.11(m,3H),0.79-0.77(m,3H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ177.4,177.2,174.5,168.0,148.3,147.4,146.4(2C),134.0,132.5,130.3,128.7,110.1,108.9,107.7(2C),101.5,79.6(2C),68.7,62.0,56.4(2C),49.6,49.3,48.2,43.5,41.6,37.0,28.5,28.4,26.3,20.6,19.0；MS-ESI:671.2226([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)649.2382for[M+H]⁺(calcd 649.2392for C₃₄H₃₇N₂O₁₁).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅰ c。

實施例6：去甲斑蝥酰亞胺基-L-亮氨酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基-L-亮氨酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:52％。mp:171-173℃；IR(KBr cm^–1)3378,2959,1775,1700,1614,1506,1484,1388,1228,1114,1037,999,933；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ6.71(s,1H),6.48(s,1H),6.27(s,2H),6.04(d,J＝8.4Hz,1H),5.98(s,2H),5.43(s,1H),5.30-5.25(m,1H),4.76-4.71(m,3H),4.53(d,J＝4.8Hz,1H),4.34(t,J＝4.4Hz,1H),3.89(t,J＝9.9Hz,1H),3.76(s,6H),2.96-2.88(m,3H),2.82(dd,J＝14.4,5.4Hz,1H),1.98-1.93(m,1H),1.88-1.83(m,2H),1.64-1.61(m,3H),1.37-1.36(m,1H),0.93-0.89(m,6H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ176.8,176.7,174.6,168.2,148.3,147.5,146.3(2C),133.9,132.3,130.3,128.8,110.0,109.0,107.6(2C),101.5,80.2,80.0,68.5,56.3(2C),52.8,49.5(2C),48.0,43.5,41.5,36.7,35.6,28.5,28.1,24.8,23.1,21.1；MS-ESI:685.1986([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)685.2354for[M+Na]⁺(calcd 685.2368for C₃₅H₃₈N₂O₁₁Na).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅰ d。

實施例7：去甲斑蝥酰亞胺基-L-異亮氨酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基-L-異亮氨酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:53％。mp:177-179℃；IR(KBr cm^–1)3463,2966,1775,1704,1615,1506,1484,1385,1227,1114,1037,999,931；¹H NMR(600MHz, CDCl₃)δ6.68(s,1H),6.60(d,J＝7.2Hz,1H),6.51(s,1H),6.28(s,2H),5.98(d,J＝5.4Hz,2H),5.43(s,1H),5.16-5.13(m,1H),4.87(d,J＝4.8Hz,1H),4.79(d,J＝4.8Hz,1H),4.58-4.56(m,1H),4.38(t,J＝4.5Hz,1H),4.33(d,J＝11.4Hz,1H),3.83(t,J＝9.9Hz,1H),3.77(s,6H),2.95-2.88(m,3H),2.84(dd,J＝14.4,4.8Hz,1H),2.61-2.59(m,1H),1.90-1.87(m,2H),1.63-1.59(m,3H),1.28-1.24(m,1H),1.06-0.91(m,3H),0.82-0.76(m,3H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ177.7,177.2,174.6,168.3,148.3,147.4,146.4(2C),133.9,132.5,130.3,128.6,110.1,108.9,107.7(2C),101.5,79.6(2C),68.8,61.2,56.4(2C),49.6,49.3,48.3,43.5,41.6,37.1,31.6,28.5,28.4,24.9,16.5,10.1；MS-ESI:685.1986([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)685.2362for[M+Na]⁺(calcd 685.2368for C₃₅H₃₈N₂O₁₁Na).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅰ e。

實施例8：去甲斑蝥酰亞胺基-L-甲硫氨酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基-L-甲硫氨酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:67％。mp:158-160℃；IR(KBr cm^–1)3371,2917,1775,1705,1613,1505,1484,1386,1227,1113,1037,999,931；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ6.71(m,1H),6.48(m,1H),6.27(m,2H),5.96(m,2H),5.95(d,J＝8.4Hz,1H),5.26(m,1H),4.87-4.84(m,1H),4.77-4.75(m,1H),4.54(m,1H),4.34(t,J＝8.4Hz,1H),3.91(t,J＝10.2Hz,1H),3.75(s,6H),2.98-2.87(m,3H),2.81(dd,J＝14.4,5.4Hz,1H),2.59-2.33(m,4H),2.08-2.05(m,3H),1.88-1.82(m,2H),1.65-1.59(m,3H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ176.8,176.7,174.6,167.4,148.3,147.5,146.4(2C),133.9,132.3,130.3,128.7,110.0,109.0,107.7(2C),101.6,80.2,80.1,68.4,56.4(2C),53.1,49.6,49.5,48.0,43.5,41.4,36.6,28.4,28.1,25.9(2C),15.4；MS-ESI:703.1952([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)703.1923for[M+Na]⁺(calcd703.1932for C₃₄H₃₆N₂O₁₁SNa).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅰ f。

實施例9：去甲斑蝥酰亞胺基-L-苯氨酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基-L-苯氨酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:63％。mp:184-185℃；IR(KBr cm^–1)3416,2912,1775,1707,1613,1504,1484,1387,1228,1113,1037,1000,941；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ6.72(s,1H),6.45(s,1H),6.26(s,2H),5.97(m,2H),5.76(s,1H),5.24-5.22(m,1H), 4.89(d,J＝5.4Hz,1H),4.67(d,J＝4.8Hz,1H),4.49(d,J＝4.2Hz,1H),4.38(t,J＝8.7Hz,1H),4.10(t,J＝10.2Hz,1H),3.76(s,6H),2.98-2.93(m,3H),2.66-2.63(m,1H),1.86-1.80(m,2H),1.64-1.60(m,2H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ176.5,176.2,174.4,166.7,148.3,147.5,146.4(2C),134.0,133.1,132.6,130.2,129.3,129.2(2C),129.1(2C),128.2,110.1,108.9,107.8,107.7,101.6,79.6,79.4,68.9,58.3,56.4(2C),49.9(2C),48.9,43.5,41.8,37.2,28.5,28.4；MS-ESI:705.1467([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)705.2040for[M+Na]⁺(calcd 705.2055for C₃₇H₃₄N₂O₁₁Na).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅰ g。

實施例10：去甲斑蝥酰亞胺基-L-苯丙氨酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基-L-苯丙氨酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:56％。mp:175-177℃；IR(KBr cm^–1)3387,2955,1775,1704,1613,1505,1484,1387,1228,1113,1037,999,931；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.26-7.10(m,5H),6.71(s,1H),6.48(s,1H),6.27(s,2H),5.98(d,J＝4.2Hz,2H),5.95(d,J＝8.4Hz,1H),5.43(s,1H),5.32-5.29(m,1H),4.96-4.93(m,1H),4.71(d,J＝4.8Hz,1H),4.68(d,J＝4.8Hz,1H),4.54(d,J＝4.8Hz,1H),4.35(t,J＝8.4Hz,1H),3.91(t,J＝9.9Hz,1H),3.77(s,6H),3.58(dd,J＝14.4,5.4Hz,1H),3.43-3.38(m,1H),2.92-2.90(m,1H),2.80-2.67(m,3H),1.85-1.78(m,2H),1.56-1.25(m,2H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ176.9,176.1,174.6,167.2,148.3,147.5,146.4(2C),136.4,134.0,132.2,130.3,128.8,128.7(2C),128.6(2C),127.0,110.0,109.0,107.7(2C),101.5,80.1,79.9,68.4,56.4(2C),55.1,49.3(2C),47.9,43.5,41.4,36.6,33.0,28.3,28.1；MS-ESI:719.2307([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)697.2389for[M+H]⁺(calcd 697.2392for C₃₈H₃₇N₂O₁₁).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅰ h。

實施例11：去甲斑蝥酰亞胺基-L-色氨酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基-L-色氨酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:58％。mp:195-196℃；IR(KBr cm^–1)3384,2910,1773,1701,1616,1506,1483,1389,1227,1112,1036,998,932；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ8.14(s,1H),7.50(d,J＝7.8Hz,1H),7.34(d,J＝7.8Hz,1H),7.20-7.17(m,1H),7.10-7.04(m,2H),6.72(s,1H),6.46(s,1H),6.26(s,2H),6.01-5.98(m,3H),5.43(s,1H), 5.30-5.26(m,1H),5.04-5.01(m,1H),4.74(d,J＝4.8Hz,1H),4.69(d,J＝4.8Hz,1H),4.46-4.45(m,1H),4.32-4.29(m,1H),3.81-3.77(m,1H),3.76(s,6H),3.70(dd,J＝15.0,6.0Hz,1H),3.57-3.52(m,1H),2.88-2.84(m,1H),2.76(d,J＝6.6Hz,1H),2.62(d,J＝6.6Hz,1H),2.50(dd,J＝14.4,4.8Hz,1H),2.18-1.77(m,2H),1.63(s,1H),1.57-1.48(m,2H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ177.0,176.4,174.5,167.4,148.3,147.5,146.4(2C),136.0,133.9,132.2,130.3,128.7,127.0,122.6,122.4,119.8,118.2,111.4,110.7,110.0,109.0,107.6(2C),101.5,79.9,79.8,68.4,56.4(2C),54.9,49.5,49.4,47.8,43.5,41.3,36.6,28.4,28.1,23.1；MS-ESI:758.2207([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)758.2310for[M+Na]⁺(calcd 758.2320for C₄₀H₃₇N₃O₁₁Na).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅰ i。

實施例12：去甲斑蝥酰亞胺基-β-丙氨酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基-β-丙氨酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:65％。mp:238-240℃；IR(KBr cm^–1)3344,2955,1770,1691,1612,1524,1480,1396,1224,1116,1032,996,920；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ6.81(s,1H),6.51(s,1H),6.27(s,2H),6.20(d,J＝7.2Hz,1H),5.98(d,J＝7.2Hz,2H),5.21-5.18(m,1H),4.82(d,J＝4.2Hz,1H),4.72(d,J＝4.2Hz,1H),4.56(d,J＝4.2Hz,1H),4.38-4.35(m,1H),3.85-3.82(m,1H),3.81-3.73(m,8H),2.91-2.85(m,4H),2.58-2.55(m,2H),1.86-1.82(m,2H),1.60-1.58(m,2H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ177.1,177.0,174.6,169.8,148.3,147.5,146.4(2C),133.9,132.5,130.3,128.7,110.0,109.2,107.6(2C),101.6,79.1,79.0,68.9,56.3(2C),49.8(2C),48.2,43.5,41.6,37.0,35.2,34.1,28.5(2C)；MS-ESI:643.1505([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)643.1895for[M+Na]⁺(calcd 643.1898for C₃₂H₃₂N₂O₁₁Na).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅱ a。

實施例13：去甲斑蝥酰亞胺基丁酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基丁酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:68％。mp:178-179℃；IR(KBr cm^–1)3350,2952,1773,1698,1613,1516,1484,1404,1228,1113,1036,999,940；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ6.81(s,1H),6.52(s,1H),6.31-6.29(m,3H),5.99-5.97(m,2H),5.26-5.23(m,1H),4.83(d,J＝4.8Hz,1H),4.78(d,J＝4.2Hz,1H),4.59(d,J＝4.2Hz,1H),4.42-4.38(m,1H),3.93-3.89 (m,1H),3.78(s,6H),3.53-3.50(m,2H),2.98-2.95(m,2H),2.89-2.87(m,2H),2.17-2.12(m,2H),1.98-1.92(m,2H),1.85-1.82(m,2H),1.62-1.60(m,2H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ177.7,177.5,174.6,171.9,148.2,147.5,146.4(2C),133.9,132.4,130.3,129.1,110.0,109.0,107.7(2C),101.5,79.2(2C),69.0,56.4(2C),49.8(2C),48.0,43.6,41.7,38.0,37.1,32.8,28.5(2C),23.7；MS-ESI:657.1684([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)657.2043for[M+Na]⁺(calcd657.2055for C₃₃H₃₄N₂O₁₁Na).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅱ b。

實施例14：去甲斑蝥酰亞胺基苯甲酸4β-胺基-4′-去甲表鬼臼甲酰胺的制備

操作過程與實施案例3同，只是用去甲斑蝥酰亞胺基苯甲酸代替去甲斑蝥酰亞胺基甘氨酸，得白色固體純品，收率:72％。mp:220-221℃；IR(KBr cm^–1)3469,2961,1774,1712,1609,1503,1483,1383,1228,1113,1036,999,929；¹H NMR(600MHz,CDCl₃)δ7.82(d,J＝9.0Hz,2H),7.32(d,J＝8.4Hz,2H),6.79(s,1H),6.64(d,J＝7.8Hz,1H),6.53(s,2H),6.30(s,2H),5.98(d,J＝7.8Hz,1H),5.50(s,1H),5.41(m,1H),4.98(s,2H),4.58(d,J＝4.8Hz,1H),4.45(t,J＝8.1Hz,1H),3.83(t,J＝9.9Hz,1H),3.77(s,6H),3.05-2.97(m,4H),1.93-1.91(m,2H),1.69-1.67(m,2H)；¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)δ176.0,175.9,174.4,166.4,148.4,147.6,146.4(2C),134.9,134.0,133.1,132.7,130.1,128.6,127.9(2C),126.5(2C),110.0,109.1,107.7(2C),101.7,79.5(2C),69.1,56.4(2C),50.0(2C),48.6,43.6,41.8,37.3,28.6,28.5；MS-ESI:691.1542([M+Na]⁺,100％)；HRMS(ESI)691.1887 for[M+Na]⁺(calcd 691.1898for C₃₆H₃₂N₂O₁₁Na).

進行后述對細胞增殖抑制實驗中，本實施例樣品編號為Ⅲa。

實施例15：去甲表鬼臼毒素與去甲斑蝥素拼合物對癌細胞的體外細胞毒活性

為了研究本次實驗中所合成的目標化合物抑制腫瘤細胞增殖的能力，我們測定了化合物對四種人類腫瘤細胞(人非小細胞肺癌細胞A-549、人肝癌細胞HepG2、人宮頸癌細胞HeLa和人結腸癌細胞HCT-8)和人胚胎肺成纖維細胞WI-38的體外細胞毒活性，并以VP-16和NCTD作為空白對照。實驗采用的檢測方法是標準的MTT法。實驗方法為：

取對數生長期的細胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制成細胞懸液，每孔6000個細胞接種到96孔板中，平板放入37℃，含5％CO₂空氣及100％濕度的孵育箱培養(yǎng)24h使其貼壁，后置換含有不同濃度藥物的含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(200μL/孔)，藥物 濃度分別為10^-4，2×10^-5，4×10^-6，8×10^-7，1.6×10^-7,3.2×10^-8mol/L，并設調零孔，空白組，陽性對照組VP-16，每組三復孔，孵育培養(yǎng)48小時后取出，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，再孵育培養(yǎng)4h，使MTT還原為甲臢，吸出上清液，每孔加入150μL DMSO，震蕩使甲臢晶體溶解，用酶標儀測量細胞液在570nm處的OD值，計算化合物各濃度的抑制率。由抑制率計算IC₅₀值，并取三次試驗的平均值。

化合物Ⅰ a–i、Ⅱ a–b和Ⅲa對人肺癌A-549、肝癌HepG2、宮頸癌HeLa和結腸癌HCT-8四種癌細胞及正常人胚胎肺成纖維細胞WI-38生長抑制的體外藥理試驗結果見表1。

表1化合物Ⅰ a–i、Ⅱ a–b和Ⅲa、VP-16以及NCTD的細胞毒性(IC₅₀,μM)

注：(1)實驗結果是三次平行實驗的統(tǒng)計結果；(2)作用時間：48小時

體外實驗證明，合成的12個化合物對人非小細胞肺癌細胞A-549、人肝癌細胞HepG2、人宮頸癌細胞HeLa和人結腸癌細胞HCT-8都有較好的體外抑制活性；且對人肝癌細胞HepG2的抑制活性較其它三種細胞的增殖抑制活性更強；另外，所有新合成的化合物對人胚胎肺成纖維細胞WI-38的毒性均比陽性對照VP-16低。整體而言，化合物Ⅰ a、Ⅱ b和Ⅲa較其它化合物表現出較高的腫瘤抑制活性。

實施例16：化合物Ⅱ b對拓撲異構酶-Ⅱ抑制活性試驗方法與結果

拓撲異構酶Ⅱ(TOP-Ⅱ)是抗腫瘤藥物的作用靶標之一。VP-16作為一種重要的抗腫瘤藥物，主要通過抑制TOP-Ⅱ起作用。為了確定該類化合物的作用機制，本專利進行了化合物Ⅱb對TOP-Ⅱ的活性抑制試驗。具體方法按照試劑盒(Topogen,Inc.,USA,Cat No.2000H)的方法進行操作。實驗結果見附圖1。

如附圖1所示，當藥物濃度為0μM時，由于TOP-Ⅱ的拓撲異構性會使超螺旋pBR322質粒DNA變?yōu)樗沙谛虳NA(線2)，低濃度時，化合物Ⅱb對TOP-Ⅱ的抑制作用較弱(線3)，但當化合物Ⅱb濃度為100μM時，可以明顯觀察到化合物Ⅱb對TOP-Ⅱ的抑制作用較強(線4)，且這種作用要強于陽性對照藥VP-16對TOP-Ⅱ的抑制作用(線5)。這一結果表明，化合物Ⅱb在體外可以抑制TOP-Ⅱ的活性。

該類化合物合成方法簡單，原料廉價易得，藥理活性顯著，有望成為擁有我國自主知識產權的一類治療癌癥的新型藥物。

對比例

療效對比

一類新型抗腫瘤活性化合物，它們與VP-16和NCTD對比，發(fā)明的化合物Ⅱ b對人非小細胞肺癌細胞A-549、人肝癌細胞HepG2、人宮頸癌細胞HeLa和人結腸癌細胞HCT-8四種腫瘤細胞生長抑制活性均強于VP-16，而且對WI-38細胞的毒性作用較小。其中化合物Ⅱ b對A-549、HepG2、HeLa和HCT-8四種癌細胞的抑制活性分別是VP-16的6、521、3和3倍，而對正常人胚胎肺成纖維細胞WI-38的毒性是VP-16的1/6以下。