本發(fā)明涉及微生物體外培養(yǎng)的具體領(lǐng)域，具體涉及一種幽門(mén)螺桿菌的分離培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
幽門(mén)螺桿菌(Helicobacter Pylori，HP)是一種定植在胃粘膜上皮與粘液之間的革蘭氏陰性螺旋狀桿菌，大量研究表明，其與慢性胃炎、消化道潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)，在病原學(xué)上具有重要的意義。自1983年首次被分離以來(lái)，檢測(cè)幽門(mén)螺桿菌的技術(shù)有了很大的進(jìn)展，主要分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是侵入式檢測(cè)技術(shù)，包括活組織切片染色法、快速尿素酶法、細(xì)菌培養(yǎng)法以及PCR的方法，另一類(lèi)是非侵入式檢測(cè)技術(shù)，包括13C或14C-尿素酶呼氣試驗(yàn)、血清免疫學(xué)檢驗(yàn)以及糞便抗原(HPSA)檢測(cè)等。其中細(xì)菌培養(yǎng)法是最準(zhǔn)確可靠的檢測(cè)技術(shù)，被認(rèn)為是診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”，同時(shí)它也是后續(xù)研究的先決條件，可以開(kāi)展像致病性、藥敏實(shí)驗(yàn)、不同株的毒力等級(jí)分型以及其他研究，進(jìn)而篩選出有效的抗幽門(mén)螺桿菌治療方案。因此，對(duì)幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行研究，并且提高從臨床標(biāo)本中分離的幽門(mén)螺桿菌的陽(yáng)性檢出率就顯得尤為重要。
但是幽門(mén)螺桿菌是一種挑剔的微需氧菌，在體外培養(yǎng)時(shí)除了對(duì)氣體環(huán)境有嚴(yán)苛的要求外，對(duì)于培養(yǎng)基的要求也相當(dāng)嚴(yán)格，培養(yǎng)基不僅要滿(mǎn)足幽門(mén)螺桿菌的營(yíng)養(yǎng)需求，還要提供局部的微需氧條件以及合適的pH耐受范圍。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)基并不能適應(yīng)幽門(mén)螺桿菌的分離培養(yǎng)要求，常用的培養(yǎng)基如哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基和改良Skirrow瓊脂培養(yǎng)基等在培養(yǎng)幽門(mén)螺桿菌上均沒(méi)有優(yōu)勢(shì)，且陽(yáng)性檢出率極低。
另外，在實(shí)際工作中，培養(yǎng)基的質(zhì)量?jī)?yōu)劣對(duì)檢測(cè)結(jié)果的可靠程度有著直接 的影響，因此需要嚴(yán)格控制干燥培養(yǎng)基的質(zhì)量。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的主要目的是提供一種適合于幽門(mén)螺桿菌的分離和傳代培養(yǎng)的培養(yǎng)基。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是要研制出幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)的專(zhuān)用培養(yǎng)基，盡量創(chuàng)造出接近幽門(mén)螺桿菌體內(nèi)生長(zhǎng)繁殖的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件，模擬胃粘膜組織環(huán)境，以提高臨床胃粘膜標(biāo)本中幽門(mén)螺桿菌檢出率。
本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：在干燥培養(yǎng)基中加入幽門(mén)螺桿菌快速生長(zhǎng)添加劑，蒸餾水，新鮮羊血。
所述幽門(mén)螺桿菌的分離培養(yǎng)基，每1000ml培養(yǎng)基含有以下成分：58.55g干燥培養(yǎng)基，100ml幽門(mén)螺桿菌快速生長(zhǎng)添加劑，蒸餾水加入定容至950ml，最后加入50ml新鮮羊血。
進(jìn)一步的，每58.55g干燥培養(yǎng)基含有：蛋白胨20.0g、多胨3.50g、牛肉浸膏粉5.00g、酵母浸膏粉1.00g、氯化鈉7.00g、碳酸氫鈉0.80g、葡萄糖5.00g、不溶性玉米淀粉2.00g、尿素2.00g、重亞硫酸鈉0.25g、瓊脂12.0g。
進(jìn)一步的，所述培養(yǎng)基pH為7.4～7.6。
前述幽門(mén)螺桿菌的分離培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：
(1)將氯化鈉、碳酸氫鈉、尿素、重亞硫酸鈉、瓊脂分別用不繡鋼裝，置于干燥箱內(nèi)，烘烤至恒重；不溶性玉米淀粉為干燥玉米去皮，研磨成細(xì)顆粒，再用100目細(xì)篩過(guò)篩后置于干燥箱內(nèi)，烘烤至恒重；
(2)稱(chēng)取蛋白胨3240g、多胨567g、牛肉浸膏粉810g、酵母浸膏粉162g、氯化鈉1134g、碳酸氫鈉129.6g、葡萄糖810g、不溶性玉米淀粉324g、尿素324g、重亞硫酸鈉40.5g、瓊脂1944g；
(3)將步驟(2)稱(chēng)量的材料裝入球磨桶內(nèi)，球磨6小時(shí)，轉(zhuǎn)速控制在每分鐘100 轉(zhuǎn)；
(4)將干燥培養(yǎng)基裝在干燥、清潔的塑料瓶?jī)?nèi)密封，干粉呈淡黃色粉未，無(wú)潮解結(jié)塊；
(5)依據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)干燥培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量鑒定，按分值法定量檢定培養(yǎng)基的質(zhì)量；
(6)稱(chēng)取步驟(4)分裝的干燥培養(yǎng)基58.55g，置于1000ml三角燒瓶中，加入幽門(mén)螺桿菌快速生長(zhǎng)添加劑100ml，蒸餾水定容至950ml；
(7)將步驟(6)中的三角燒瓶置于壓力蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121℃滅菌20分鐘；
(8)將步驟(7)中的滅菌物冷卻至45～50℃，加入新鮮羊血50ml，充分混勻，傾注入已滅菌的平皿，凝固后，即為幽門(mén)螺桿菌的分離培養(yǎng)基。在此過(guò)程中，本發(fā)明注重對(duì)應(yīng)用于幽門(mén)螺桿菌的培養(yǎng)基進(jìn)行品質(zhì)檢定。
進(jìn)一步的，所得幽門(mén)螺桿菌的分離培養(yǎng)基置于干燥的室溫環(huán)境內(nèi)貯存。
本發(fā)明研制的幽門(mén)螺桿菌專(zhuān)用分離培養(yǎng)基，其組成配方發(fā)揮著各自的作用，能達(dá)到培養(yǎng)幽門(mén)螺桿菌的最佳環(huán)境。其中蛋白胨、多胨、牛肉浸膏粉、酵母浸膏粉、葡萄糖等物質(zhì)提供給幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)繁殖必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)；氯化鈉的量為0.7％，為幽門(mén)螺桿菌最佳滲透壓濃度；碳酸氫鈉的用量為使培養(yǎng)基的酸堿度達(dá)到7.4～7.6；不溶性玉米淀粉是經(jīng)過(guò)100目細(xì)篩過(guò)篩后的顆粒物質(zhì)，其作用是吸收幽門(mén)螺桿菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中有害的代謝產(chǎn)物；尿素能分解成胺，中和酸性物質(zhì)，使培養(yǎng)基的局部保持微堿性環(huán)境；重亞硫酸鈉的水溶液呈酸性，還原性較強(qiáng)，使幽門(mén)螺桿菌生長(zhǎng)繁殖的局部環(huán)境為微需氧；幽門(mén)螺桿菌快速生長(zhǎng)添加劑能縮短細(xì)菌在體外生長(zhǎng)繁殖時(shí)的遲緩期時(shí)間和世代時(shí)間，使細(xì)菌生長(zhǎng)的數(shù)量增加，表現(xiàn)為菌落形成時(shí)間提前，菌落直徑增大；新鮮羊血能提供細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖的必要的生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和形成類(lèi)似組織內(nèi)的環(huán)境。
對(duì)近35萬(wàn)份胃粘膜組織中分離幽門(mén)螺桿菌，使用本發(fā)明的分離培養(yǎng)基，幽門(mén)螺桿菌的陽(yáng)性率能從3～5％上升到46％左右。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此。
本發(fā)明的實(shí)施例1：
一、幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)基的制備
(1)將氯化鈉、碳酸氫鈉、尿素、重亞硫酸鈉、瓊脂分別用不繡鋼裝，置于干燥箱內(nèi)，烘烤至恒重；不溶性玉米淀粉為干燥玉米去皮，研磨成細(xì)顆粒，再用100目細(xì)篩過(guò)篩后置于干燥箱內(nèi)，烘烤至恒重；
(2)稱(chēng)取蛋白胨3240g、多胨567g、牛肉浸膏粉810g、酵母浸膏粉162g、氯化鈉1134g、碳酸氫鈉129.6g、葡萄糖810g、不溶性玉米淀粉324g、尿素324g、重亞硫酸鈉40.5g、瓊脂1944g；
(3)將步驟(2)稱(chēng)量的材料裝入球磨桶內(nèi)，球磨6小時(shí)，轉(zhuǎn)速控制在每分鐘100轉(zhuǎn)；
(4)將干燥培養(yǎng)基裝在干燥、清潔的塑料瓶?jī)?nèi)密封；
(5)依據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)干燥培養(yǎng)基進(jìn)行質(zhì)量鑒定。a.質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)：培養(yǎng)基干粉呈淡黃色粉未，無(wú)潮解結(jié)塊；培養(yǎng)基pH為7.4～7.6；培養(yǎng)基溶解制備的平板呈淡黃色透明，無(wú)顆粒雜質(zhì)；基礎(chǔ)培養(yǎng)基的質(zhì)量總分值≥41.11分；幽門(mén)螺桿菌在血瓊脂平板上的菌落直徑≥0.5mm；b.按照分值法定量檢定培養(yǎng)基的質(zhì)量，檢定方法和判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)”定量鑒定幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)基的方法”；
(6)稱(chēng)取步驟(4)分裝的干燥培養(yǎng)基58.55g，置于1000ml三角燒瓶中，加入幽門(mén)螺桿菌快速生長(zhǎng)添加劑100ml，蒸餾水定容至950ml；
(7)將步驟(6)中的三角燒瓶置于壓力蒸汽滅菌鍋內(nèi)，121℃滅菌20分鐘；
(8)將步驟(7)中的滅菌物冷卻至45～50℃，加入新鮮羊血50ml，充分混勻，傾注入已滅菌的平皿，凝固后，即為幽門(mén)螺桿菌的分離培養(yǎng)基。所得幽門(mén)螺桿菌的分離培養(yǎng)基置于干燥的室溫環(huán)境內(nèi)貯存。
二、幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)培養(yǎng)基的質(zhì)量檢定
(一)物理性能鑒定：
1、感觀性狀：培養(yǎng)基干粉呈淡黃色粉未，無(wú)潮解結(jié)塊；
2、pH：應(yīng)符合7.4～7.6；
3、水份：應(yīng)控制在7％以下；
4、澄清：制備的培養(yǎng)基平板呈淡黃色，透明，無(wú)顆粒沉定和絮狀物雜質(zhì)；
5、軟硬度：制備的培養(yǎng)基平板用接種環(huán)劃線時(shí)，手感適宜，以不劃破培養(yǎng)基為宜。必要時(shí)可采用測(cè)定凝膠強(qiáng)度(g/cm2)表示。
(二)生物學(xué)性能鑒定(分值法計(jì)算)：
1、材料：
(1)指示菌：
金黃色葡萄球菌ATCC 25922；
奈瑟氏淋球菌ATCC 29106；
(2)培養(yǎng)基：
①被檢定培養(yǎng)基：幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)基；
②對(duì)照培養(yǎng)基：對(duì)照培養(yǎng)基2號(hào)；
(3)器材：
15×150中試管(滅菌)、凍溶管(滅菌)、1mL移液管(滅菌)、5mL移液管(直徑為9cm，滅菌)、L棒、燒杯、平皿(滅菌)、95％乙醇、混勻 器、游標(biāo)卡尺、接種環(huán)、酒精燈、250mL三角燒杯、250mL鹽水瓶；
2、操作方法：
(1)培養(yǎng)基配制：
①被檢定培養(yǎng)基：
稱(chēng)取干燥培養(yǎng)基23.42g，置于三角燒瓶中，加入幽門(mén)螺桿菌快速生長(zhǎng)添加劑40ml，加蒸餾水定容至380mL，經(jīng)121℃20分鐘滅菌后冷卻至45-50℃，添加脫纖維綿羊血20mL，充分混勻，傾注平皿，每只平皿20mL，備用。
②對(duì)照培養(yǎng)基：
稱(chēng)取對(duì)照2號(hào)培養(yǎng)基17.9g，置于三角燒瓶中，加蒸餾水至400mL，加溫溶解，經(jīng)121℃20分鐘滅菌后冷卻至45-50℃，傾注平皿，每只平皿20mL(直徑為9cm)，備用。
③菌株：
取已復(fù)蘇的金黃色葡萄球菌和奈瑟氏淋球菌，分離接種在培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)48小時(shí)。
④方法：
a.取滅菌中試管1支，加入已滅菌的稀釋液1mL。用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落(直徑約2mm菌落)，置于1mL稀釋液中，研磨均勻，菌液濃度約為106CFU/mL。
b.取滅菌中試管6支，用5mL移液管各加入稀釋液4.5mL。取上述菌懸液0.5mL，置于第1管中，丟棄移夜管，另取一支1mL移液管，置于第1管中吹打均勻(或用混勻器振蕩均勻)，稀釋度為10-1，并吸取0.5mL菌懸液置于第2管中，丟棄移液管。重復(fù)上述操作，第6管菌懸液為10-6。
c.取被檢定培養(yǎng)基平板和對(duì)照培養(yǎng)基平板各三只，每只平皿中各加入10-4的 稀釋度的菌懸液0.1mL，用L棒涂布均勻(將菌懸液推干)。
d、分別用10-5、10-6的稀釋度的菌懸液重復(fù)③的操作。
e、將平板置于37℃環(huán)境中培養(yǎng)24小時(shí)。
⑤結(jié)果：
a.計(jì)數(shù)菌落；計(jì)數(shù)每只平板上的菌落數(shù)。
b.測(cè)量菌落直徑：用游標(biāo)卡尺測(cè)量單個(gè)菌落的直徑。
⑥計(jì)算：
(1)被檢定培養(yǎng)基平板上菌落平均數(shù)：
(2)對(duì)照2號(hào)培養(yǎng)基上的菌落平均數(shù)：
(3)幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)專(zhuān)用培養(yǎng)基血平板上的檢出率(P)：
(4)被檢定培養(yǎng)基平板上的菌落平均直徑
(5)對(duì)照2號(hào)培養(yǎng)基上的菌落平均直徑
⑦分值計(jì)算：
按下列公式計(jì)算各種菌株的分值：
實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：
表1生長(zhǎng)率、菌落直徑結(jié)果
⑧質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)和判定標(biāo)準(zhǔn)：
金黃色葡萄球菌在幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)專(zhuān)用培養(yǎng)基血平板上的質(zhì)控參數(shù)為：μ＝1.943 σ＝0.378 π＝98.39 δρ＝5.68。
奈瑟氏淋球菌在幽門(mén)螺桿菌分離培養(yǎng)專(zhuān)用培養(yǎng)基血平板上的質(zhì)控參數(shù)為：μ＝2.03 σ＝0.149 π＝99.99 δρ＝2.514。
質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)及其判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2所示：
表2判定標(biāo)準(zhǔn)
應(yīng)用定量檢測(cè)的方法來(lái)檢定培養(yǎng)基或培養(yǎng)基添加劑，是以計(jì)算每毫升溶液中含有細(xì)菌集落數(shù)，在合適的溫度條件和規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間測(cè)定菌落直徑，作為評(píng)價(jià)品質(zhì)的依據(jù)。由于幽門(mén)螺桿菌在最適宜的相對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)基上不能形成單個(gè)菌落，也就無(wú)法用定量數(shù)據(jù)來(lái)判斷培養(yǎng)基的質(zhì)量。必須用培養(yǎng)時(shí)營(yíng)養(yǎng)要求高，在37℃溫度環(huán)境中，培養(yǎng)24小時(shí)的條件下可形成菌落特點(diǎn)明顯的菌株作為檢定培養(yǎng)基的指示菌，金黃色葡萄球菌和奈瑟氏淋球菌等能達(dá)到這個(gè)要求。所以，我們采用金黃色葡萄球菌和奈瑟氏淋球菌等作為指示菌，檢定獲得的數(shù)據(jù)，作為評(píng)價(jià)培養(yǎng)基添加劑品質(zhì)的參考依據(jù)。
上述的具體實(shí)施方式只是示例性的，是為了更好的使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解本發(fā)明，不能理解為是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制；只要是根據(jù)本發(fā)明所揭示精神所作出的任何等同變更或修飾，均落入本發(fā)明保護(hù)的范圍。