本發(fā)明涉及環(huán)肽領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)肽類抗真菌化合物及其制備方法。

背景技術(shù)：

棘白菌素(echinocandin)為寬范圍的一組抗真菌劑，其典型的包括環(huán)狀六肽和親脂性尾端，后者通過酰胺鍵附接于六肽核心。盡管天然存在的棘白菌素具有某種程度的抗真菌活性，但它們并不適合作為治療劑，這主要是由于差的水溶性、不充分的功效，和/或溶血作用。通過全合成或者通過對天然存在或天然產(chǎn)生的前體進行合成修飾或酶法改性獲得的棘白菌素化合物被稱為半合成棘白菌素化合物。

已批準(zhǔn)上市的半合成類棘白菌素化合物，包括：阿尼芬凈(anidulafungin)、卡泊芬凈(caspofungin)和米卡芬凈(micafungin)，它們可用于治療真菌感染，特別是由曲霉菌(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、假絲酵母(Candida)、球孢子菌(Coccidioides) 和組織胞漿菌(Histoplasma) 引起的真菌感染。其維持或改善對葡聚糖合酶的抑制作用，但不引起溶血作用。

阿尼芬凈、米卡芬凈和卡泊芬凈都是由天然存在的棘白菌素（例如棘白菌素B、紐莫康定A0 或紐莫康定B0）通過半合成得到。作為治療劑，它們在其全身的半衰期、大的治療窗口、安全特性，及與其它藥物的相互作用的相對缺乏的方面是有吸引力的化合物。但由于這些化合物水溶性差，腸道吸收率低，只能通過靜脈內(nèi)給藥。并且臨床上關(guān)于這類產(chǎn)品種類相對較少。開發(fā)半衰期長、抗菌譜廣的新的棘白菌素類藥物，提高患者用藥依從性，擴大臨床用藥品種，具有顯著的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的環(huán)六肽類抗真菌藥物，其具有增加的水溶性，并且在體內(nèi)半衰期長，治療指數(shù)高，具有對抗一種或多種真菌種類或?qū)俚幕钚?，具有靜脈內(nèi)給藥適應(yīng)性。

具體的，本發(fā)明提供了一種式1化合物：

，

或其藥學(xué)上可接受的鹽。

另一方面，本發(fā)明還提供了一種藥用組合物，其包含本發(fā)明所提供的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽，和藥學(xué)上可接受的賦形劑。

在具體的實施方案中，藥用組合物包含本發(fā)明的化合物的乙酸鹽或鹽酸鹽。本發(fā)明的藥用組合物可被配制為單位劑量形式或本文描述的任何其它劑型，供靜脈內(nèi)、局部或口服給藥。

本領(lǐng)域熟知的用于制備制劑的方法例如在“Remington: 藥物科學(xué)或?qū)嵺`(The Science and Practice of Pharmacy)”(第20版, ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins)中發(fā)現(xiàn)。胃腸外給藥的制劑，例如含有賦形劑、無菌水或鹽水，聚亞烷基二醇如聚乙二醇、植物來源的油，或氫化萘。供吸入的制劑可包含賦形劑，例如，乳糖，或可以是包含例如，聚氧乙烯-9-十二烷基醚、羥乙酸鹽和去氧膽酸鹽的水性溶液，或可以是以滴鼻劑形式給藥的油性溶液，或作為凝膠劑。

用于口服利用的制劑包括片劑，本發(fā)明提供的化合物和至少一種藥學(xué)上可接受的賦形劑。這些賦形劑可以是，例如惰性稀釋劑或填充劑（如，蔗糖和山梨醇）、潤滑劑、助流劑和抗結(jié)合劑（如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化硅、氫化植物油或滑石粉）。用于口服利用的制劑也是咀嚼片、片劑、糖衣片，或膠囊（即，作為硬明膠膠囊，其中的活性成分與惰性固體稀釋劑混合，或作為軟明膠膠囊）。

制劑中的本發(fā)明提供的化合物的濃度將根據(jù)多種因素，包括要給予的藥物劑量，以及給藥途徑而變化。

本發(fā)明所述化合物藥學(xué)上可接受的鹽，包括但不限于，酸加成鹽；通過用金屬，如堿金屬或堿土金屬鹽（如，鈉、鋰、鉀、鎂或鈣鹽）；或常用于制藥工業(yè)的金屬復(fù)合物替代酸性質(zhì)子而形成的金屬鹽。酸加成鹽的實例包括有機酸如乙酸、乳酸、撲酸、馬來酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲烷磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸；聚合酸如丹寧酸，和羧甲基纖維素；和無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸。金屬復(fù)合物包括鋅，和鐵，及其它等。

另一方面，本發(fā)明還提供了包含本發(fā)明的化合物的藥物組合物在治療哺乳動物真菌感染中的用途。進一步的，所述真菌感染選自頭皮癬、體癬、腳癬、甲癬、甲周癬、變色性皮癬、陰道念珠菌病、呼吸道念珠菌病、膽道念珠菌病、食道念珠菌病、尿道念珠菌病、全身性念珠菌病、粘膜與皮膚念珠菌病、曲霉病、毛霉病、副球孢子菌病、北美芽生菌病、組織胞漿菌病、球孢子菌病、真菌性鼻竇炎或慢性副鼻炎。

本發(fā)明的化合物I，如在實施例中所述，通過在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件下，使棘白菌素類化合物與合適的酰基、烷基、羥基和/或氨基基團的偶合官能化或非官能化來合成。例如，棘白菌素B ( Echinocandin B，簡稱ECB)可由構(gòu)巢曲霉(Aspergilus nidulans)代謝產(chǎn)生，其結(jié)構(gòu)如下：

。

棘白菌素B經(jīng)脫酰酶作用，得到環(huán)肽母核(Echinocandin B Nucleus，ECBN)，環(huán)肽母核再經(jīng)過化學(xué)修飾可制備得到阿尼芬凈。美國專利US7785826B2詳細(xì)介紹了ECB 轉(zhuǎn)化ECBN 的工藝。此工藝主要流程包括：將ECB 發(fā)酵完成以后，離心獲得菌絲體，把菌絲體重新懸浮于水中然后加入純化的脫酰酶。CN102618606B、EP0561639B1等文獻也公開了ECB轉(zhuǎn)化ECBN的方法。

ZL95196643.X說明書部分實施例156公開了化合物1側(cè)鏈MFE的制備方法；US7199248B2也公開了化合物I側(cè)鏈MFE及其活化形式的制備方法，

。

化合物1母核(ANL)的制備可采用ECBN與MFE或其活化物反應(yīng)制備獲得，反應(yīng)式如下：

；

其中，ECBN與MFE活化物反應(yīng)條件類似US7199248B2中公開的FR179642與MFE活化物反應(yīng)的條件進行操作（在本發(fā)明具體實施例中也有舉例說明）。

對于本發(fā)明的化合物的半合成途徑，化合物的立體化學(xué)通過起始原料確定。因此，半合成的棘白菌素衍生物的立體化學(xué)具有與其從中衍生的天然存在的棘白菌素構(gòu)型相同的立體化學(xué)。

因此，本發(fā)明的棘白菌素類化合物可衍生自環(huán)狀肽抗真菌劑，如棘白菌素B、棘白菌素B母核（ECBN）、阿尼芬凈。

另一方面，本發(fā)明還提供了化合物ANM的新晶型，其具有基本如圖3所示的X-射線粉末衍射（XRPD）譜圖。

其中XRPD 測試使用Panalytical（帕納科）公司的XPERT-3型X射線衍射儀。測試方法是，將約10 毫克樣品均勻平鋪在單晶硅樣品盤上，用以下描述參數(shù)進行XRPD 測試：

。

本發(fā)明提供的帶有獨特兩親性基團的環(huán)六肽化合物，特別能增強抗真菌效力，尤其是體內(nèi)抗菌活性。

本發(fā)明的化合物在水中與阿尼芬凈相比較具有增加的溶解性；本發(fā)明化合物最低抑菌濃度優(yōu)于阿尼芬凈，并且體內(nèi)半衰期顯著長于阿尼芬凈，另外，與阿尼芬凈相比，本發(fā)明化合物體內(nèi)分布體積較大。

附圖說明

圖1顯示的是化合物1對系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠腎臟載菌量的影響。

圖2顯示的是化合物ANM的紅外譜圖。

圖3顯示的是化合物ANM的X-射線粉末衍射譜圖。

具體實施例：

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則所有的百分?jǐn)?shù)、比率、比例、或份數(shù)按重量計，除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。

實施例1：化合物ANL的制備

將化合物ANA（5g），化合物MFE1(3.1g)，磷酸氫二鉀（1.8g）加入至丙酮和純化水（4:1，v/v）的混合溶液（50ml），反應(yīng)液升溫至55℃±5℃反應(yīng)2h后，趁熱過濾，濾液旋干，真空干燥得7.0g目標(biāo)化合物ANL。

實施例2：化合物ANP的制備

（1）化合物（ANL苯硼酸脂）制備

室溫氮氣保護下，將化合物ANL(7.0g)加入至無水四氫呋喃（35ml）中，然后加入苯硼酸（0.98g），攪拌1h，室溫脫溶至干，加入無水四氫呋喃（42ml）攪拌0.5h后，脫溶，除水，反復(fù)兩次。加入無水四氫呋喃（21ml）和無水乙腈（42ml）溶解攪拌0.5h，脫溶，除水，固體真空干燥過夜。

（2）氯化膽堿的反應(yīng)前處理

室溫氮氣保護下，將氯化膽堿（25.97g）加入至無水乙腈（210ml）中，超聲溶解，然后室溫脫溶，重復(fù)加入無水乙腈（210ml），超聲，脫溶。固體真空干燥過夜。

（3）化合物ANP的制備

室溫氮氣保護下，將步驟（2）制備的干燥的氯化膽堿加入至無水乙腈（70ml）中，加入三氟乙酸（17.5ml），攪拌至溶清，快速加入步驟（1）制備的干燥的ANL苯硼酸脂，室溫氮氣保護下攪拌2.5h。反應(yīng)液滴加純化水（175ml），得到含化合物ANP的無色澄清溶液。

實施例3：化合物ANM的制備

將實施例2制備的含化合物ANP的無色澄清溶液通過0.45μm有機膜過濾，濾液通過C18，10μm填料制備柱制備純化，制備方法如下表1所述：流動相分別為乙腈、1‰醋酸/水，

表1：制備方法

，

分段收集洗脫液，得到化合物ANM，凍干得目標(biāo)產(chǎn)物1.5g，收率：30%，HPLC：97.3%?；衔顰NM的紅外譜圖如圖2所示，其X-射線粉末衍射譜圖如圖3。

實施例4：化合物1的制備

用膽堿氯化物(13 mg，0.093 mmol) 和HCl (4M在1,4- 二氧六環(huán)中，1.0μL，0.004mmol) 處理溶于無水DMSO (0.2 mL)中的化合物ANL(4.5mg ；0.004 mmol)。將生成的溶液于室溫下攪拌2天并于40℃加熱約8小時，然后用水和乙腈稀釋并經(jīng)制備型RP HPLC 純化，用水(0.1% TFA)/CH₃CN (0.1% TFA) 洗脫。產(chǎn)物經(jīng)凍干分離，得到2.4mg化合物1。ESI⁺ m/z：1216.58 [M]⁺。

實施例5 化合物X的制備

用膽堿氯化物（13 mg；0.093 mmol）和HCl（4M在1,4-二氧六環(huán)中；1.0μL；0.004mmol）處理溶于無水DMSO（0.2 mL）中的阿尼芬凈（5 mg；0.004 mmol）。將生成的溶液于室溫下攪拌2天并于40℃加熱約8小時，然后用水和乙腈稀釋并經(jīng)制備型RP HPLC 純化，用水（0.1% TFA）/CH3CN（0.1% TFA）洗脫。產(chǎn)物經(jīng)凍干分離，得到2.0 mg 化合物X，為白色固體。HPLC T_R 10.84 min (90%)。LC/MS，ESI⁺ m/z 1225.60 [M]⁺。

實施例6體外對念珠菌屬的最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration, MIC）的測定

按照臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)品研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute) M27-A3文件所述的程序進行。取無菌96孔板，于每排1號孔加 RPMI 1640培養(yǎng)液200μl作空白對照；96孔板每排3～12號孔各加RPMI 1640培養(yǎng)液100 μl；2號孔分別加RPMI 1640培養(yǎng)液180μl 和640μg/ml 抗真菌化合物溶液20 μl，充分混勻；每排為1個待篩選化合物；最后一排為質(zhì)控氟康唑；2～11號孔10 級倍比稀釋，使各孔的最終藥物濃度分別為64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％；12號孔不含藥物，作陽性對照；將受試菌株于SDA平皿上活化2次，以保證其活力；將活化菌株劃線接種于SDA平皿，35℃培養(yǎng)24小時；挑取直徑>1mm的菌落5個，將其溶解于滅菌三蒸水中，于振蕩器上震蕩15秒制備成菌懸液；用血細(xì)胞計數(shù)板將菌懸液濃度用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整至1×10⁶~5×10⁶(相當(dāng)于麥?zhǔn)蠞岫?.5)CFU/ml將上述已經(jīng)配置好的菌懸液用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋1000倍(首先稀釋50倍，然后稀釋20倍)，使其濃度介于1×10³~5×10³ CFU/ml之間。菌懸液稀釋至1×10³~5×10³ CFU/ml之間后，用多道移液器將菌液接終至96孔板第2~12號孔，最終接種濃度為0.5×10³~2.5×10³ CFU/ml；96孔板最后一排為質(zhì)控菌株近平滑念珠菌ATCC22019。新型隱球菌孵箱中孵箱中35℃培養(yǎng)72小時后觀察結(jié)果，其他念珠菌35℃培養(yǎng)24小時后觀察結(jié)果。

實驗結(jié)果如下表1和2所示。

表1：對念珠菌（國際標(biāo)準(zhǔn)株）的MIC值

，

由上述結(jié)果可看成，本發(fā)明化合物1對國際標(biāo)準(zhǔn)株念珠菌和臨床分離株的念珠菌具有較好的抑菌效果，其與阿尼芬凈相比體外具有類似的抗念珠菌譜和較優(yōu)的抗念珠菌活性。

表2：對念珠菌（臨床分離株）的MIC值

。

實施例7體外對絲狀菌的最低抑菌濃度(MIC)/最低有效濃度（MEC）的測定

按照臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)品研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute) M38-A2文件所述的程序進行。取無菌 96 孔板，于每排 1 號孔加 RPMI 1640培養(yǎng)液200 μl 作空白對照；96孔板每排3～12 號孔各加RPMI 1640培養(yǎng)液100 μl；96孔板每排2 號孔分別加RPMI 1640培養(yǎng)液180μl 和640μg/ml 抗真菌化合物溶液20 μl，充分混勻；每排為1個待篩選化合物；最后一排為質(zhì)控伏立康唑；2～11 號孔10 級倍比稀釋，使各孔的最終藥物濃度分別為 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125 μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％；12 號孔不含藥物，作陽性對照；將受試菌株于PDA平皿上活化7天，以誘導(dǎo)分生孢子以及孢囊孢子的形成；在孵育7天的菌落上加入含有0.01ml吐溫20（1滴）的0.85%鹽水1ml，制備菌懸液；菌懸液靜置3～5 min 后,大顆粒沉于底部,取上層均質(zhì)液體(含孢囊孢子或分生孢子以及菌絲片段)；用血細(xì)胞計數(shù)板將菌懸液濃度用RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整至1×10⁶~5×10⁶CFU/ml將上述已經(jīng)配置好的菌懸液用RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋250倍(首先稀釋25倍，然后稀釋10倍)，使其濃度介于0.4×10⁴~2×10⁴ CFU/ml之間。菌懸液稀釋至0.4×10⁴~2×10⁴ CFU/ml之間后，用多道移液器將菌液接終至96孔板第2~12號孔，最終接種菌懸液濃度為0.2×10⁴~1×10⁴CFU/ml。孵箱中35℃培養(yǎng)48小時后觀察結(jié)果（皮膚癬菌7天后觀察結(jié)果）。

實驗結(jié)果見表3。

表3：對絲狀菌（國際標(biāo)準(zhǔn)株）的MIC和MEC值

，

由上述結(jié)果可以看出化合物1對絲狀真菌也具有較好的抑菌效果，其與阿尼芬凈體外具有相似的抗菌譜和較優(yōu)的抗絲狀真菌活性

實施例8 化合物1在比格犬體內(nèi)藥代動力學(xué)研究

選取17~20月齡雄性比格犬9條（北京瑪斯生物技術(shù)有限公司），動物飼養(yǎng)在普通動物房內(nèi)。動物房通風(fēng)良好，裝備空調(diào)，溫度保持在18~26 °C，濕度保持在40%~70%。明暗照明各12小時，每只犬獨立飼養(yǎng)，可自由進食和飲水。經(jīng)獸醫(yī)檢驗合格后，入選本實驗。比格犬每只犬均用耳部紋身標(biāo)記，并在籠具上標(biāo)注試藥編號、劑量。實驗前一天，比格犬禁食過夜，給藥4 h后可恢復(fù)進食，實驗過程中可自由飲水。阿尼芬凈組比格犬分別進行10 min靜脈推注1 mg/kg 阿尼芬凈溶液，于給藥前及推注完成后5、15、30 min、1、2、4、8、12、24、48和72 h，由頸靜脈采血0.5 mL，置于含K₂-EDTA抗凝劑試管中。化合物X組比格犬分別進行10 min靜脈推注1 mg/kg 化合物X溶液，于給藥前及推注完成后5、15、30 min、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144和168 h，由頸靜脈采血0.5 mL，置于含K₂-EDTA抗凝劑試管中?；衔?組比格犬分別進行10 min靜脈推注1 mg/kg BG-10048溶液，于給藥前及推注完成后5、15、30 min、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144和168 h，由頸靜脈采血0.5 mL，置于含K₂-EDTA抗凝劑試管中。采集的全血樣品在離心前都置于冰上，同一時間點采集的全血樣品需在采集完成半小時內(nèi)離心完，低溫離心（5500 rpm）10 min后分離血漿，保存在-70 °C冰箱。建立測定比格犬血漿中阿尼芬凈、化合物X和化合物1濃度的LC-MS/MS分析方法，用于本實驗獲得的生物樣品的濃度測定。采用Pharsight Phoenix 6.3中的非房室模型計算藥代動力學(xué)參數(shù)，并計算絕對生物利用度。實驗結(jié)果見表4。

表4：

，

從上表可看出，比格犬靜脈注射給予阿尼芬凈、化合物X和化合物1后半衰期分別為17、65和71 h?；衔颴和化合物1具有較大的分布體積和較長的半衰期。這些藥代動力學(xué)特性可提供諸如降低的給藥量、減少的給藥頻率，和/或在治療/預(yù)防某些真菌感染中的改進的功效的優(yōu)點。

實施例9化合物1對系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠腎臟載菌量的影響

選取6~8周齡雄性C57小鼠20只，隨機分為5組。實驗動物飼養(yǎng)在SPF動物房內(nèi)。動物房通風(fēng)良好，裝備空調(diào)，溫度保持在20~25 °C，濕度保持在40%~70%，明暗照明各12小時，實驗動物能自由進食和飲水。正常喂養(yǎng)7天后，經(jīng)獸醫(yī)檢驗，體征狀況良好小鼠可入選本實驗。每只小鼠均用尾標(biāo)號標(biāo)記。動物分別于接菌前4天和1天腹腔注射150 mg/kg環(huán)磷酰胺。將受試白念珠菌SC5314于SDA平皿上活化2次，以保證其活力。將活化菌株劃線接種于SDA平皿，35℃培養(yǎng)24小時；挑取直徑>1mm克隆，將其接種于YPD培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)。將上述菌液調(diào)整至1×10⁴ CFU/ml用于系統(tǒng)性真菌感染動物模型復(fù)制。實驗動物尾靜脈注射1×10⁴ CFU/ml復(fù)制系統(tǒng)性真菌感染模型。模型復(fù)制后2小時，四組動物分別腹腔注射給予溶劑對照、4.5 mg/kg的阿尼芬凈、1.5 mg/kg的化合物X和4.5 mg/kg的化合物1。給藥12小時后，處死所有動物，取雙側(cè)腎臟，加入2ml PBS緩沖液進行勻漿，將勻漿液涂布于SDA平皿上，35℃培養(yǎng)48小時，計算單位重量腎臟組織內(nèi)的菌落數(shù)。實驗結(jié)果見下表5和圖1。

表5：化合物1對系統(tǒng)性念珠菌感染小鼠腎臟載菌量的影響

。

由表5可看出，模型對照組、阿尼芬凈組、化合物X組和化合物1組給藥12小時后腎臟載菌量分別為4.69、3.86、3.87和2.89 Log 10 CFU/g。給藥后阿尼芬凈與化合物X腎臟載菌量顯著低于模型組，表明阿尼芬凈和化合物X具有良好的體內(nèi)抗真菌活性。化合物1腎臟載菌量顯著低于阿尼芬凈組和化合物X組，表明化合物1比阿尼芬凈和化合物X具有更好的體內(nèi)抗真菌活性。

實施例10 化合物ANM的溶解性測試

在各種不同pH條件下測定化合物ANM和阿尼芬凈的溶解性，以評價該化合物在含水載體中的經(jīng)注射給藥（如靜脈內(nèi)或肌內(nèi)注射）的制劑的適應(yīng)性。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物ANM與阿尼芬凈相比，在較大pH范圍內(nèi)（pH 1~8）均具有更優(yōu)的溶解性。