本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)和藥物化學(xué)領(lǐng)域，具體為一種穩(wěn)定氮氧自由基標(biāo)記的2,4-二胺基嘧啶類(lèi)極光激酶A抑制劑，以及這種抑制劑的制備方法和用途。

背景技術(shù)：

激光激酶(Aurora kinase)是一類(lèi)新型的蘇氨酸/絲氨酸蛋白激酶，在中心體復(fù)制、兩極紡錘體形成、染色體重排和染色體檢查點(diǎn)監(jiān)測(cè)等重要的有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用(Cancer Metastasis Rev.2003,22,451)。Aurora激酶家族有三種結(jié)構(gòu)和功能高度相關(guān)的亞群:即Aurora-A、Aurora-B和Aurora-C。它們的蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)均含有一個(gè)N-端調(diào)控區(qū)和一個(gè)C-端催化區(qū)，且酶結(jié)構(gòu)域序列相似度達(dá)71％，ATP腺嘌呤環(huán)結(jié)合位點(diǎn)的殘基也相同；但在細(xì)胞分裂中它們具有完全不同且互不重疊的功能。Aurora A從有絲分裂的S期末至下一個(gè)分裂周期的G期開(kāi)始，影響中心體的分離、成熟以及兩極紡錘體的形成(Nat.Rev.Cancer 2005,5,42)。Aurora B在有絲分裂早期位于染色體的著絲粒區(qū)域，分裂后期則從著絲粒移動(dòng)到微管。目前對(duì)Aurora C功能的研究相對(duì)較少。1998年，美國(guó)學(xué)者Bischoff等首次發(fā)現(xiàn)Aurora激酶在多種癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，且與染色體的不穩(wěn)定性、癌變、腫瘤增殖和化學(xué)抗性等過(guò)程密切相關(guān)(EMBO J.1998,17,3052)。由于Aurora激酶獨(dú)特的藥理作用機(jī)制，以Aurora激酶為靶點(diǎn)的藥物開(kāi)發(fā)已成為抗癌藥物研究的熱點(diǎn)之一(Expert Opin.Drug Discovery 2011,6,291)。

迄今為止，還沒(méi)有Aurora激酶抑制劑用于臨床治療，僅有數(shù)個(gè)Aurora激酶抑制劑在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，如VX-680、PHA-739358、AZD-1152、MLN8054、SNS-314、ENMD-2076等(藥學(xué)進(jìn)展2008,32,337；中國(guó)抗生素雜志2010,35(9),641)。但是，這些小分子都存在著不同程度的毒副作用，盡管藥物治療前景光明，還有待進(jìn)一步化學(xué)修飾研究，減少其副作用。

相對(duì)于Aurora-B而言，Aurora-A在結(jié)腸癌、卵巢癌、胃癌以及乳腺癌等許多腫瘤中均過(guò)量表達(dá)。Aurora-A的過(guò)度表達(dá)使細(xì)胞有絲分裂檢測(cè)點(diǎn)的監(jiān)測(cè)功能失控，導(dǎo)致分裂異常，癌基因擴(kuò)增，正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞(J.Cell Sci.2007,120,2987)。Aurora-A能更加有效地引起細(xì)胞有絲分裂停滯并快速誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因而，以Aurora-A為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物治療在一定程度上將優(yōu)于Aurora-B(Curr.Opin.Invest.Drugs 2006,7,1044)。就報(bào)道的選擇性Aurora-A激酶抑制劑而言，目前只有加拿大Millennium公司研制的MLN8237在進(jìn)行Ⅰ期臨床試驗(yàn)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2007,104,4106)。最近，美國(guó)學(xué)者Cochran和Lwerence分別報(bào)道了一類(lèi)2,4-二苯環(huán)取代的單嘧啶環(huán)類(lèi)化合物，有些化合物對(duì)Aurora-A的選擇性較Aurora-B高達(dá)1000倍，但由于它們的溶解性和/或膜穿透能力較差，致使其抗腫瘤活性較低，失去了進(jìn)一步開(kāi)發(fā)的價(jià)值 (J.Med.Chem.2012,55,7392)。另外，挪威學(xué)者Prime M.E.報(bào)道的一類(lèi)新型吡唑取代的酞嗪酮類(lèi)化合物，對(duì)Aurora-A激酶抑制的選擇性大于1000，目前是否進(jìn)入臨床前研究尚不清楚(J.Med.Chem.2011,54,312)。

考慮到穩(wěn)定氮氧自由基作為有效的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，能提高藥物的溶解性，并促使藥物優(yōu)先穿過(guò)癌變細(xì)胞膜(Science 2001,291,266；J.Med.Chem.2005,48,6393)。本發(fā)明設(shè)計(jì)合成一種穩(wěn)定氮氧自由基標(biāo)記的嘧啶類(lèi)化合物，體外實(shí)驗(yàn)表明這種化合物對(duì)癌細(xì)胞具有較好的細(xì)胞毒性，且對(duì)Aurora A較Aurora B有選擇性抑制作用，同時(shí)這種化合物具有適當(dāng)?shù)闹峙湎禂?shù)，是一種具有開(kāi)發(fā)為新型抗癌藥物的化合物；在制備方法上，本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單方法高效地合成了關(guān)鍵中間體及其目標(biāo)化合物。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于利用穩(wěn)定氮氧自由基作為有效的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體，期望提高化合物的溶解性，并促使化合物優(yōu)先穿過(guò)癌變細(xì)胞膜，發(fā)揮抗癌效果。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明化合物對(duì)多種癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的體外抑制作用，同時(shí)對(duì)Aurora A較Aurora B有選擇性抑制作用。

一種具有抗癌活性的結(jié)構(gòu)如式Ⅰ的穩(wěn)定氮氧自由基標(biāo)記的極光激酶A抑制劑，

其中：

R為鄰位氯，或間位氯，或?qū)ξ宦?，或鄰位羥基，或間位羥基，或?qū)ξ涣u基。

X為硝基，或氟，或氯，或溴。

一種具有抗癌活性的結(jié)構(gòu)如式Ⅱ的穩(wěn)定氮氧自由基標(biāo)記的極光激酶A抑制劑，

其中：

R為鄰位氯，或間位氯，或?qū)ξ宦取?/p>

X為硝基，或氟，或氯，或溴。

本發(fā)明中式Ⅰ所示化合物的制備方法，其特征是以2,4-二氯-5-硝基嘧啶，或2,4-二氯-5-氟嘧啶，或2,4,5-三氯嘧啶，或2,4-二氯-5-溴嘧啶為原料，首先和鄰氯苯胺，或間氯苯胺，或?qū)β缺桨?，或鄰羥基苯胺，或間羥基苯胺，或?qū)αu基苯胺反應(yīng)生成2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-間氯苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-對(duì)氯苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-鄰羥基苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-間羥基苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-對(duì)羥基苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-鄰氯苯胺-5-氟嘧啶，或2,5-二氯-4-鄰氯苯胺嘧啶，或2-氯-4-鄰氯苯胺-5-溴嘧啶(J.Med.Chem.2012,55,7392)；同時(shí)以叔丁氧羰基保護(hù)的對(duì)氨基苯甲酸為原料，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和1-羥基苯并三唑(HOBT)存在的條件下與4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(TMPO)縮合，再在三氟乙酸的二氯甲烷溶液中脫除保護(hù)基即得對(duì)氨基苯甲酰4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(J.Med.Chem.2001,44,441)；最后上述制得的兩種化合物在強(qiáng)酸催化下在嘧啶環(huán)的2-位發(fā)生取代反應(yīng)得到式Ⅰ所代表的目標(biāo)化合物。

本發(fā)明中式Ⅱ所示化合物的制備方法，其特征是以2,4-二氯-5-硝基嘧啶，或2,4-二氯-5-氟嘧啶為原料，首先和對(duì)氨基苯甲酰鄰氯苯胺，或?qū)Π被郊柞ｉg氯苯胺，或?qū)Π被郊柞?duì)氯苯胺反應(yīng)生成N-(2-氯-5-硝基-嘧啶-4)-氨基苯甲酰鄰氯苯胺，或N-(2-氯-5-硝基-嘧啶-4)-氨基苯甲酰間氯苯胺，或N-(2-氯-5-硝基-嘧啶-4)-氨基苯甲酰對(duì)氯苯胺，或N-(2-氯-5-氟-嘧啶-4)-氨基苯甲酰鄰氯苯胺(J.Med.Chem.2012,55,7392)；同時(shí)以叔丁氧羰基保護(hù)的對(duì)氨基苯甲酸為原料，在1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)和1-羥基苯并三唑(HOBT)存在的條件下與4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(TMPO)縮合，再在三氟乙酸的二氯甲烷溶液中脫除保護(hù)基即得對(duì)氨基苯甲酰4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(J.Med.Chem.2001,44,441)；最后上述制得的兩種化合物在強(qiáng)酸催化下在嘧啶環(huán)的2-位發(fā)生取代反應(yīng)得到式Ⅱ所代表的目標(biāo)化合物。

本發(fā)明中式Ⅰ、Ⅱ所述的化合物的制備方法，其特征是反應(yīng)中對(duì)氨基苯甲酰4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物與相應(yīng)N-(2-氯-5-取代-嘧啶-4)-氨基苯甲酰氯苯胺反應(yīng)的物質(zhì)量比為1:1.05-1.20，反應(yīng)溫度為70–110℃，催化劑為鹽酸。

本發(fā)明中式Ⅰ、Ⅱ所述的化合物對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A-549、人肝癌細(xì)胞HepG2和人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo四種癌細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的抑制作用，其中絕大部分化合物對(duì)這些癌細(xì)胞增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于陽(yáng)性對(duì)照VX-680，尤其化合物Ⅰg和Ⅱd對(duì)這四種癌細(xì)胞都有較強(qiáng)的活性，并且對(duì)極光激酶A(Aurora A)較極光激酶B(Aurora B)顯示明顯的選擇性抑制。因此本發(fā)明的化合物可用于制備抗癌藥物。

下面通過(guò)實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的方法。應(yīng)理解的是，本發(fā)明實(shí)施例的制備方法僅僅是用于說(shuō)明本發(fā)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制，在本發(fā)明的構(gòu)思前提下對(duì)本發(fā)明制備方法的簡(jiǎn) 單改進(jìn)都屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供以下的實(shí)施例：

實(shí)施例1：2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶的制備

取2,4-二氯-5-硝基嘧啶(205mg，1.05mmol)溶于干燥的二氯甲烷，室溫下加入鄰氯苯胺(125mg，1.0mmol)并繼續(xù)反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后蒸除溶劑，殘?jiān)苯又鶎游龅卯a(chǎn)物2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶。收率:89％；黃色固體；¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ10.68(s,1H),9.22(s,1H),8.34-8.32(m,1H),7.51-7.21(m,3H)。

用間氯苯胺，或?qū)β缺桨?，或鄰羥基苯胺，或間羥基苯胺，或?qū)αu基苯胺分別代替鄰氯苯胺反應(yīng)制備2-氯-4-間氯苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-對(duì)氯苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-鄰羥基苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-間羥基苯胺-5-硝基嘧啶，或2-氯-4-對(duì)羥基苯胺-5-硝基嘧啶。

用2,4-二氯-5-氟嘧啶，或2,4,5-三氯嘧啶，或2,4-二氯-5-溴嘧啶代替2,4-二氯-5-硝基嘧啶反應(yīng)制備2-氯-4-鄰氯苯胺-5-氟嘧啶，或2,5-二氯-4-鄰氯苯胺嘧啶，或2-氯-4-鄰氯苯胺-5-溴嘧啶。

實(shí)施例2：對(duì)氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

取1.8g Boc保護(hù)的對(duì)氨基苯甲酸溶解于干燥的二氯甲烷中，依次加入1.8g EDC，1.22g HOBt和1.53g化合物TMPO。室溫?cái)嚢柚练磻?yīng)完全。有機(jī)相加水洗滌，并用無(wú)水硫酸鎂干燥；蒸除溶劑并柱層析，得粉色固體2.52g，收率90％。MS(ESI)392.15[M+2H]⁺。

稱取上述反應(yīng)所得產(chǎn)物2.5g溶于15ml二氯甲烷中，滴加6ml三氟乙酸，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)0.5h后，減壓蒸除溶劑，所得固體柱層析，得白色固體1.74g，收率94％。MS(ESI)292.15[M+2H]⁺。

實(shí)施例3：N-(5-硝基-4-鄰氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

將2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶(280mg，1mmol)和對(duì)氨基苯甲酰4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(430mg，1.5mmol)溶于乙醇中，再加入鹽酸的二氧六環(huán)溶液2ml，加熱回流。待反應(yīng)基本完全后停止反應(yīng)，蒸除溶劑，直接柱層析得黃色固體,收率:62％。

m.p.:208-210℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝65:35,0.8ml/min,t＝21.23min,95.0％；IR(KBr,cm^-1)3362,3015,1629,1536,1506,1422,1332,1195,1025,836,726；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.96,△H(G)＝2.95；HRMS(ESI)540.2111for[M+2H]⁺(calcd 540.2121for C₂₆H₃₁N₇O₄Cl).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅰa。

實(shí)施例4：N-(5-硝基-4-間氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-4-間氯苯胺-5-硝基嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黃色固體，收率:68％。

m.p.:217-219℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝72:28,0.8mL/min,t＝13.70min,98.0％；IR(KBr,cm^-1)3376,3281,3022,1636,1610,1584,1541,1526,1481,1414,1329,1202,1137,858,726；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.92,△H(G)＝2.75；HRMS(ESI)540.2117for[M+2H]⁺(calcd 540.2121for C₂₆H₃₁N₇O₄Cl).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅰb。

實(shí)施例5：N-(5-硝基-4-對(duì)氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-4-對(duì)氯苯胺-5-硝基嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黃色固體，收率:72％。

m.p.:225-227℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝72:28,0.8mL/min,t＝14.18min,96.5％；IR(KBr,cm^-1)3379,2995,1639,1616,1579,1529,1489,1404,1202,841,719；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.88,△H(G)＝2.85；HRMS(ESI)540.2117for[M+2H]⁺(calcd 540.2121for C₂₆H₃₁N₇O₄Cl).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅰc。

實(shí)施例6：N-(5-硝基-4-鄰羥基苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-4-鄰羥基苯胺-5-硝基嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黃色固體，收率:61％。

m.p.:126-128℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝80:20,0.8mL/min,t＝7.18min,95.6％；IR(KBr,cm^-1)3369,2940,1641,1624,1576,1411,1459,1327,1205,838,746；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.96,△H(G)＝2.95；HRMS(ESI)522.2463for[M+2H]⁺(calcd 522.2459for C₂₆H₃₂N₇O₅).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅰd。

實(shí)施例7：N-(5-硝基-4-間羥基苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-4-間羥基苯胺-5-硝基嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黃色固體，收率:52％。

m.p.:97-99℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝77:23,0.8mL/min,t＝8.41min,99.8％；IR(KBr,cm^-1)3324,2985,1678,1619,1591,1529,1422,1332,1207,853,786,724；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.86,△H(G)＝2.98；HRMS(ESI)522.2453for[M+2H]⁺(calcd 522.2459for C₂₆H₃₂N₇O₅).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅰe。

實(shí)施例8：N-(5-硝基-4-對(duì)羥基苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-4-對(duì)羥基苯胺-5-硝基嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黃色固體，收率:63％。

m.p.:234-236℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝68:32,0.6mL/min,t＝8.68min,98.5％；IR(KBr,cm^-1)3421,3281,2344,1686,1616,1579,1499,1394,1267,1200,841,744,699；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.94,△H(G)＝3.05；HRMS(ESI)522.2454for[M+2H]⁺(calcd522.2459for C₂₆H₃₂N₇O₅).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅰf。

實(shí)施例9：N-(5-氟-4-鄰氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-4-鄰氯苯胺-5-氟嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得白色固體，收率:50％。

m.p.:137-139℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝50:50,0.8mL/min,t＝34.94min,95.8％；IR(KBr,cm^-1)3384,3277,2980,2942,2628,2496,1678,1606,1574,1511,1494,1444,1399,1327,1190,1038,850,776；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.92,△H(G)＝2.85；HRMS(ESI)512.2090for[M+H]⁺(calcd 512.2097for C₂₆H₃₁N₆O₂FCl).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅰg。

實(shí)施例10：N-(5-氯-4-鄰氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-4-鄰氯苯胺-5-氯嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得白色固體，收率:42％。

m.p.:156-158℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝50:50,0.8mL/min,t＝32.93min,100％；IR(KBr,cm^-1)3381,3273,2980,2606,2501,1678,1611,1569,1501,1447,1329,1187,1033,853,776,751；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.90,△H(G)＝2.65；HRMS(ESI)513.1928for[M-14]⁺(calcd 527.1729for C₂₆H₂₉N₆O₂Cl).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅰh。

實(shí)施例11：N-(5-溴-4-鄰氯苯胺-嘧啶-2)-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-4-鄰氯苯胺-5-溴嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得白色固體，收率:46％。

m.p.:167-168℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝65:35,0.8mL/min,t＝11.36min,99.3％；IR(KBr,cm^-1)3366,2982,2940,2499,1609,1569,1509,1494,1444,1387,1324,1187,1033,851,768；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.96,△H(G)＝2.95；HRMS(ESI)557.1422for[M-14]⁺(calcd 571.1224for C₂₆H₂₉N₆O₂ClBr).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅰi。

實(shí)施例12：N-{5-硝基-4-氨基-(苯甲酰鄰氯苯胺)-嘧啶-2}-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-5-硝基-4-氨基-(苯甲酰鄰氯苯胺)-嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黃色固體，收率:72％。

m.p.:274-276℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝75:25,0.8mL/min,t＝9.47min,99.7％；IR(KBr,cm^-1)3404,2995,1656,1631,1539,1424,1332,1222,853,766；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.96,△H(G)＝2.92；HRMS(ESI)659.2490for[M+2H]⁺(calcd 659.2492for C₃₃H₃₆N₈O₅Cl).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅱa。

實(shí)施例13：N-{5-硝基-4-氨基-(苯甲酰間氯苯胺)-嘧啶-2}-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-5-硝基-4-氨基-(苯甲酰間氯苯胺)-嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黃色固體，收率:59％。

m.p.:248-249℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝75:25,0.8mL/min,t＝7.96min,98.7％；IR(KBr,cm^-1)3394,2980,2364,1668,1624,1531,1427,1334,1220,851,761；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.92,△H(G)＝2.90；HRMS(ESI)659.2507for[M+2H]⁺(calcd 659.2492for C₃₃H₃₆N₈O₅Cl).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅱb。

實(shí)施例14：N-{5-硝基-4-氨基-(苯甲酰對(duì)氯苯胺)-嘧啶-2}-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-5-硝基-4-氨基-(苯甲酰對(duì)氯苯胺)-嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得黃色固體，收率:65％。

m.p.:275-277℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝75:25,0.8mL/min,t＝9.80min,97.7％；IR(KBr,cm^-1)3401,2980,2379,1609,1536,1504,1414,1329,1210,853,788；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.94,△H(G)＝2.92；HRMS(ESI)659.2495for[M+2H]⁺(calcd 659.2492for C₃₃H₃₆N₈O₅Cl).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅱc。

實(shí)施例15：N-{5-氟-4-氨基-(苯甲酰鄰氯苯胺)-嘧啶-2}-氨基苯甲酸4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物酰胺的制備

操作過(guò)程與實(shí)施案例3同，只是用2-氯-5-氟-4-氨基-(苯甲酰鄰氯苯胺)-嘧啶代替2-氯-4-鄰氯苯胺-5-硝基嘧啶，得白色固體，收率:51％。

m.p.:213-215℃；HPLC:MeOH:H₂O(0.1％TFA)＝60:40,0.8mL/min,t＝21.46min,95.6％；IR(KBr,cm^-1)3424,2962,2925,2850,1614,1594,1509,1424,1322,1232,1182,848,759；ESR(DMSO):g＝2.006,An(G)＝15.96,△H(G)＝2.97；HRMS(ESI)632.2542for[M+2H]⁺(calcd632.2547for C₃₃H₃₆N₇O₃FCl).

進(jìn)行后述對(duì)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)施例樣品編號(hào)為Ⅱd。

實(shí)施例16：穩(wěn)定氮氧自由基標(biāo)記的2,4-二胺基嘧啶類(lèi)化合物對(duì)癌細(xì)胞的體外細(xì)胞毒活性

為了研究本次實(shí)驗(yàn)中所合成的目標(biāo)化合物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力，我們測(cè)定了化合物對(duì)四種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞(人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A-549、人肝癌細(xì)胞HepG2和人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo)的體外細(xì)胞毒活性，并以VX-680作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)采用的檢測(cè)方法是標(biāo)準(zhǔn)的MTT法。實(shí)驗(yàn)方法為：

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，每孔6000個(gè)細(xì)胞接種到96孔板中，平板放入37℃，含5％CO₂空氣及100％濕度的孵育箱培養(yǎng)24h使其貼壁，后置換含有不同濃度藥物的含10％胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(200μL/孔)，藥物濃度分別為10^-4，2×10^-5，4×10^-6，8×10^-7，1.6×10^-7,3.2×10^-8mol/L，并設(shè)調(diào)零孔，空白組，陽(yáng)性對(duì)照組VP-16，每組三復(fù)孔，孵育培養(yǎng)48小時(shí)后取出，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，再孵育培養(yǎng)4h，使MTT還原為甲臢，吸出上清液，每孔加入150μL DMSO，震蕩使甲臢晶體溶解，用酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞液在570nm處的OD值，計(jì)算化合物各濃度的抑制率。由抑制率計(jì)算IC₅₀值，并取三次試驗(yàn)的平均值。

化合物Ⅰa–i、Ⅱa–d對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A-549、人肝癌細(xì)胞HepG2和人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo四種癌細(xì)胞增殖抑制的體外藥理試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1化合物Ⅰa–i、Ⅱa–b及VX-680的細(xì)胞毒性(IC₅₀,μM)

注：(1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是三次平行實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；(2)作用時(shí)間：48小時(shí)

體外實(shí)驗(yàn)證明，合成的13個(gè)化合物對(duì)HeLa、A-549、HepG2和LoVo都比陽(yáng)性對(duì)照VX-680有較好的體外抑制活性；尤其是化合物Ⅱd對(duì)這四種癌細(xì)胞都表現(xiàn)出最高的抑制活性。

實(shí)施例16：化合物Ⅰg和Ⅱd對(duì)激光激酶A的選擇性抑制活性

激光激酶(Aurora kinase)在中心體復(fù)制、兩極紡錘體形成、染色體重排和染色體檢查點(diǎn)監(jiān)測(cè)等重要的有絲分裂過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。Aurora激酶在多種癌細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)，且與染色體的不穩(wěn)定性、癌變、腫瘤增殖和化學(xué)抗性等過(guò)程密切相關(guān)，是目前抗癌藥物研究的重要靶標(biāo)之一。為了研究化合物Ⅰg和Ⅱd抗腫瘤增殖作用的機(jī)理，同時(shí)為了探索其是否可以像其他嘧啶類(lèi)抑制劑一樣抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)Aurora激酶的表達(dá)，我們采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)試驗(yàn)對(duì)HepG2細(xì)胞中Aurora激酶的抑制活性進(jìn)行了研究。

具體方法：取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞置于微量滴定板中，向每個(gè)孔中加入不同濃度梯度的藥物，每孔10μL樣品，40μL的樣品稀釋液，空白孔只加樣品，稀釋液置于37℃恒溫箱，孵育30min，然后用洗滌液洗滌5次，拍干后，加酶標(biāo)抗體，每孔50μL(空白孔不加)再置于37℃恒溫箱孵育30min。最后向每個(gè)孔中加50μL TMB底物液，37℃恒溫箱孵育15～30min，取出后向每孔中加入終止液來(lái)終止反應(yīng)。之后細(xì)胞消化離心，然后PBS緩沖 液重懸，反復(fù)凍融3次，在2000～3000r/min離心20～30min，吸取上清液在450nm處檢測(cè)OD值。并由此計(jì)算化合物的抑制率和IC₅₀值，并取三次試驗(yàn)的平均值。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2化合物Ⅰg和Ⅱd對(duì)激光激酶A和B的抑制活性

注：(1)實(shí)驗(yàn)結(jié)果是三次平行實(shí)驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果；

由表2可見(jiàn)，化合物Ⅰg和Ⅱd對(duì)Aurora A的抑制活性比VX 680更強(qiáng)，分別為VX 680的20倍和32倍。同時(shí)，化合物Ⅰg和Ⅱd對(duì)Aurora A比Aurora B具有更加顯著的抑制活性，其中化合物Ⅰg對(duì)Aurora A的作用是對(duì)Aurora B的11倍，Ⅱd對(duì)Aurora A的作用是對(duì)Aurora B的67倍，而VX 680對(duì)Aurora A和Aurora B沒(méi)有選擇性。

該類(lèi)化合物合成方法簡(jiǎn)單，原料廉價(jià)易得，藥理活性顯著，有望成為擁有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的一類(lèi)治療癌癥的新型藥物。

對(duì)比例

療效對(duì)比

一類(lèi)新型抗腫瘤活性化合物，它們與VX-680對(duì)比，發(fā)明的化合物Ⅱb對(duì)人宮頸癌細(xì)胞HeLa、人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A-549、人肝癌細(xì)胞HepG2和人結(jié)腸癌細(xì)胞LoVo四種腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制活性均強(qiáng)于VX-680。其中化合物Ⅱd對(duì)HeLa、A-549、HepG2和LoVo四種癌細(xì)胞的抑制活性分別是VX-680的38、32、44和6倍。同時(shí)化合物Ⅰg和Ⅱd對(duì)Aurora A的抑制活性分別為VX 680的20倍和32倍。