本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，更具體地涉及一種抗PD-1抗體及其治療用途。
背景技術(shù)：
：程序性細(xì)胞死亡蛋白質(zhì)1(PD-1)，也被稱為CD279，是表達(dá)于免疫細(xì)胞，包括T細(xì)胞的細(xì)胞表面受體。PD-1結(jié)合兩個(gè)配體PD-L1和PD-L2。PD-1與其配體的結(jié)合觸發(fā)PD-1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，這被認(rèn)為是免疫應(yīng)答負(fù)調(diào)控。PD-1是免疫球蛋白(Ig)的超家族成員，其包括CD28，和CTLA-4。PD-1和其它家族成員是I型跨膜糖蛋白,含有負(fù)責(zé)配體結(jié)合和胞質(zhì)尾結(jié)合信令介體分子的胞外Ig結(jié)構(gòu)域(KeirME等.AnnuRevImmunol.2008；26:677-704)。PD-1的胞質(zhì)尾包含兩個(gè)基于酪氨酸的信號基序，一個(gè)ITIM(免疫受體酪氨酸的抑制基序)和ITSM(免疫受體基于酪氨酸開關(guān)基序)。刺激后，PD-1募集酪氨酸磷酸酶SHP-2到ITSM基序，導(dǎo)致T細(xì)胞的效應(yīng)分子激活，例如CD3ζ，PKCtheta和ZAP70的脫磷酸化。PD-1敲除小鼠發(fā)展自發(fā)自體免疫疾病，包括狼瘡樣增生性關(guān)節(jié)炎(NishimuraH.等.,1998,Int.Immunol.10:1563-1572)，致死性心肌病(NishimuraH.等.,2001,Science291:319-322)和I型糖尿病(WangJ.等.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A,2005,102:11823-11828)?？傮w而言，基因敲除動(dòng)物的分析已經(jīng)導(dǎo)致我們理解PD-1的功能主要是在誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)外周免疫耐受。因此，對PD-1途徑的治療阻斷可能對克服免疫耐受很有幫助。這種選擇性阻斷可能會(huì)使用在癌癥或感染的治療，以及在接種疫苗(無論是預(yù)防性或治療性)期間升高免疫力。腫瘤通過創(chuàng)建免疫抑制微環(huán)境逃避免疫監(jiān)視。許多原發(fā)腫瘤活檢已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PD-1和PD-L1在腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，并且參與免疫逃避(RibasA.CancerDiscov.2015,5(9):915-9).。這樣的組織包括肺，肝，卵巢癌，宮頸癌，皮膚癌，結(jié)腸癌，神經(jīng)膠質(zhì)瘤，膀胱癌，乳腺癌，腎癌，食道癌，胃癌，口腔鱗狀細(xì)胞癌，膀胱上皮細(xì)胞癌和胰腺以及頭部和頸部的腫瘤(BrownJ.A.等.,J.Immunol.,2003，170:1257-1266；DongH.等.,Nat.Med.,2003,8:793-800；Wintterle等.,CancerRes.,2003,63:7462-7467；StromeS.E.等.,CancerRes.,2003,63:6501-6505；ThompsonR.H.等.,CancerRes.,2006,66:3381-5；Thompson等.,Clin.CancerRes.,2007,13:1757-61；NomiT.等.,Clin.CancerRes.,2007,13:2151-7)。PD-1，充當(dāng)免疫檢查站，起著重要的調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)作用。PD-1防止T細(xì)胞的活化失控，從而降低自身免疫及促進(jìn)自身耐受調(diào)節(jié)。PD-1的抑制效果是通過促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞細(xì)胞凋亡，同時(shí)降低調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的凋亡，這一雙重機(jī)制 來完成的。鑒于其免疫抑制作用，PD-1的抑制劑被認(rèn)為能激活免疫系統(tǒng)來攻擊腫瘤，因此用于治療癌癥和其它免疫相關(guān)疾病。阻斷PD-1與其配體之間的相互作用以增強(qiáng)腫瘤特異性CD8T細(xì)胞免疫是能夠殺滅腫瘤細(xì)胞(TopalianS.等.CurrOpinImmunol.2012,24(2):207-12)。近年來，抗PD-1的抗體已成為治療黑色素瘤和肺癌的臨床藥物。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明是基于抗PD-1抗體，SHB-617，它表現(xiàn)出結(jié)合PD-1高親和力，并成功地阻斷PD-1介導(dǎo)的信號和增強(qiáng)的T細(xì)胞的活化。因此，本公開的一個(gè)方面提供了分離的抗PD-1抗體，它與SHB-617抗體的重鏈及輕鏈可變區(qū)的互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)相同。這樣抗體包含：(i)重鏈可變區(qū)(VH)包含重鏈互補(bǔ)決定區(qū)(HCCDR)1所列為GFSLSTSGT(按ChothiaCDR定義,下同)，一個(gè)HCCDR2規(guī)定為CWEDS，以及HCCDR3規(guī)定為EDSGYFWFPY；和(ii)輕鏈可變區(qū)(VL)其包含的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)(LCCDR)1所列為KAGQNVNNYLA，一個(gè)LCCDR2闡述為NANSLQT；和LCCDR3規(guī)定為QQYNSWTT。在一些實(shí)施方案中，本文所描述的分離的抗PD-1抗體包含為VH鏈，其包含的氨基酸序列至少80％(例如，85％，90％，95％，97％，或其以上)相同于QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO.:9)。備選地或另外，抗PD-1抗體包含為VL鏈，其包含的氨基酸序列至少80％(例如，85％，90％，95％，97％，或其以上)相同于NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKR(SEQIDNO.:7)。在一些實(shí)例中，本文所描述的分離的抗PD-1抗體包含為VH，其包括氨基酸序列QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS(SEQIDNO.:9)；和/或?yàn)閂L鏈，其包括NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKR(SEQIDNO.:7)氨基酸序列。在一些實(shí)例中，本文描述的抗PD-1抗體包含為VH鏈，其包括QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTCVSWIRQPSGKGLEWLATICWEDSKGYNPSLKNRLTISKDTSNNQAFLKITSVDTADSAIYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVSVS(SEQIDNO.:10)的氨基酸序列；和/或?yàn)閂L鏈，其包括氨基酸序列NIQMTQSPSLLSASVGDRVTLSCKAGQNVNNYLAWYQQKLGEPPKVLIFNANS LQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCQQYNSWTTFGAGTKLELKR(SEQIDNO.:8)。在一些實(shí)施方案中，本文描述的抗PD-1抗體可以抗體SSI-361都結(jié)合于相同的表位或相競爭SHB-617結(jié)合PD-1。本文所述的任何抗PD-1抗體可以是全長抗體(例如，IgG分子)或其抗原結(jié)合片段(例如，F(xiàn)ab或F(ab’)或單鏈抗體scFv)。在一些實(shí)例中，抗體可以是嵌合抗體或人源化抗體或多特異性抗體。在其它實(shí)例中，本文描述的抗體可以是多特異性抗體，其結(jié)合PD-1和一個(gè)或多個(gè)其它靶抗原的一部分。在又其它實(shí)施例中，本文中描述的抗體綴合與合適的試劑，例如治療劑或診斷劑，以形成綴合物，例如，抗體藥物偶聯(lián)物(ADC)。在本發(fā)明的另一方面，提供了一種抗體重鏈，所述抗體重鏈具有以下CDR：CDR1：SEQIDNO.:17；CDR2：SEQIDNO.:18；CDR3：SEQIDNO.:19。本發(fā)明還提供了一種抗體輕鏈，所述抗體輕鏈具有以下CDR：CDR1：SEQIDNO.:20；CDR2：SEQIDNO.:21；CDR3：SEQIDNO.:22。本發(fā)明還提供了含有上述抗體重鏈和/或抗體輕鏈的抗體，例如人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、單鏈抗體、或其組合。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供特定的核酸或一組核酸，其共同編碼本文所描述的抗PD-1抗體。這樣的核酸可以是一個(gè)載體或一組載體，例如其中的核苷酸序列編碼VH或VL是或兩者連接到合適的啟動(dòng)子的表達(dá)載體。在一些實(shí)例中，所述的載體是表達(dá)載體。在一些實(shí)例中，所述分離的核酸編碼抗PD-1抗體包含VH編碼在第一核苷酸序列，VL在第二核苷酸序列的。在其它實(shí)例中，VH的編碼序列和VL鏈位于不同的核酸。在一些實(shí)例中，所述核酸包含第一核酸，所述第一核酸包含編碼VH的第一核苷酸序列；和第二核酸，所述第二核酸包含編碼VL的第二核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的第一核苷酸序列和第二核苷酸序列相互融合或各自獨(dú)立。在另一個(gè)方面，本公開提供了一種載體或載體組(例如，含有兩個(gè)載體)，其共同包含核酸(多個(gè))編碼任何抗PD-1本文中所描述的抗體。在一些實(shí)例中，所述載體或載體組是表達(dá)載體(多個(gè))。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的載體或載體組。這樣的宿主細(xì)胞可以在合適的條件，允許所述抗體的表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。所述宿主細(xì)胞可以被收集由此產(chǎn)生的抗體的分離。此外，本公開內(nèi)容提供了一種藥物組合物，其包含如本文所述的或如本文描述的抗PD-1抗體(例如，游離形式或綴合與如本文所述合適的試劑)，或任何核酸/核酸的設(shè)置，和藥學(xué)上可接受的載體組成。這樣的藥物組合物可以用于治療與PD-1 信號相關(guān)的疾病(如癌癥，感染性疾病如病毒感染(如，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎或C),以及其它免疫相關(guān)疾病)。本發(fā)明提供了一種用于制備抗PD-1抗體的方法，所述方法包括：(i)在能夠表達(dá)抗體的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含本發(fā)明的載體或載體組合；和(ii)收集所述宿主細(xì)胞或培養(yǎng)基用于純化所述抗體。在另一優(yōu)選例中，所述的抗PD-1抗體是抗體SSI-361。在另一個(gè)方面，本公開內(nèi)容提供了用于治療與PD-1信號(通路)相關(guān)疾病的方法，所述方法包括給需要的對象施用有效量的本發(fā)明所述的藥物組合。在一些實(shí)例中，所述藥物組合物的作為單一藥劑或組合。在一些實(shí)例中，所述方法還包括給需要的對象其他治療劑。在一些實(shí)例中，所述的與PD-1信號(通路)相關(guān)的疾病包括癌癥、感染性疾病、或其它免疫相關(guān)疾病。也在本公開的范圍內(nèi)是使用任何抗PD-1抗體，編碼核酸(多個(gè))，抗體偶聯(lián)物(例如ADC)，或藥物組合物，治療本文所述的任何目標(biāo)疾病的用途。本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施方案的細(xì)節(jié)闡述于以下說明中。其它特征或本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在從以下附圖和幾個(gè)實(shí)例詳細(xì)描述，以及從所附的權(quán)利要求將是顯而易見的。附圖說明圖1是一系列曲線圖，顯示抗PD-1嵌合抗體在刺激記憶T細(xì)胞應(yīng)答情況。其中，圖1A、1B、1C和1D分別顯示了抗人PD-1抗體SHB-128、SHB-152、SHB-168和SHB-617刺激記憶T細(xì)胞應(yīng)答的情況。圖1E和1F分別顯示了抗PD-L1和人IgG的應(yīng)答情況，分別用作陽性和陰性對照。圖2是SHB-617VL(SEQIDNO.:1)(ChothiaCDR的定義和編號)和所述人源化受體構(gòu)架VK1-L1(SEQIDNO.:2)和JH4(SEQIDNO.:3)。圖3是SHB-617VH(SEQIDNO.:4)(ChothiaCDR的定義和編號)和所述人源化人受體構(gòu)架VH2-2-70(SEQIDNO.:5)和JH4(SEQIDNO.:6)。圖4是人源化的SHB-617VL(SEQIDNO.:7)和親代鼠VL域(SEQIDNO.:8)。圖5是人源化的SHB-617VH(SEQIDNO.:9)和親代鼠VH域(SEQIDNO.:10)。圖6顯示人源化抗體與人和猴子PD-1蛋白結(jié)合ELISA一個(gè)圖表。其中，圖6A：人PD-1結(jié)合ELISA。圖6B：Rehsus猴子PD-1結(jié)合ELISA。圖6C：食蟹猴PD-1結(jié)合ELISA。圖7是表示通過FACS檢測抗體和細(xì)胞表面人類PD-1的曲線圖。圖8描繪抗體阻斷人類配體PD-L1及PD-L2結(jié)合到細(xì)胞的人類PD-1。其中，圖8A和圖8B分別顯示了抗體阻斷配體PD-L1、PD-L2結(jié)合的情況。圖9顯示抗體增強(qiáng)人類T細(xì)胞活化。其中，圖9A顯示了人T細(xì)胞TT活化分析，圖9B顯示了人MLR分析。圖10是SSI-361在食蟹猴的藥代動(dòng)力學(xué)曲線圖。序列的簡要說明SEQIDNO.:1是SHB-617VL的氨基酸序列，與圖2相關(guān)聯(lián)。SEQIDNO.:2是人VK1-L1的氨基酸序列，與圖2相關(guān)聯(lián)。SEQIDNO.:3是人JK4的氨基酸序列，與圖2相關(guān)聯(lián)。SEQIDNO.:4是鼠SHB-617VH的氨基酸序列，與圖3相關(guān)聯(lián)。SEQIDNO.:5是人VH2-2-70的氨基酸序列，與圖3相關(guān)聯(lián)。SEQIDNO.:6是人JH4的氨基酸序列，與圖3相關(guān)聯(lián)。SEQIDNO.:7是人源化的SHB-617的VL的氨基酸序列顯示在圖4。SEQIDNO.:8是鼠SHB-617的VL的氨基酸序列顯示在圖4。SEQIDNO.:9是人源化的SHB-617的VH的氨基酸序列示于圖5。SEQIDNO.:10是鼠SHB-617的VH的氨基酸序列示于圖5。SEQIDNO.:11是SSI-361(人源化的SHB-617)的LC的氨基酸序列。SEQIDNO.:12是SSI-361(人源化的SHB-617)的HC的氨基酸序列。SEQIDNO.:13是SHB-617的重鏈的全長氨基酸序列。SEQIDNO.:14是SHB-617的重鏈的全長編碼基因序列。SEQIDNO.:15是SHB-617的輕鏈的全長氨基酸序列。SEQIDNO.:16是SHB-617的輕鏈的全長編碼基因序列。SEQIDNO.:17是SSI-361的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)HCCDR1。SEQIDNO.:18是SSI-361的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)HCCDR2。SEQIDNO.:19是SSI-361的重鏈互補(bǔ)決定區(qū)HCCDR3。SEQIDNO.:20是SSI-361的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)HCCDR1。SEQIDNO.:21是SSI-361的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)HCCDR2。SEQIDNO.:22是SSI-361的輕鏈互補(bǔ)決定區(qū)HCCDR3。具體實(shí)施方式本專利描述抗PD-1抗體，核酸編碼這樣抗體，其激活T細(xì)胞增強(qiáng)的免疫應(yīng)答功能，和應(yīng)用于治療與PD-1的信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病包括癌癥?？筆D-1抗體PD-1是表達(dá)于免疫細(xì)胞，包括T細(xì)胞和B細(xì)胞的細(xì)胞表面受體，負(fù)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。人PD-1被PDCD1基因編碼。作為一個(gè)例子，一個(gè)人PD-1的氨基酸序列是根據(jù)GenBank登錄號NP_005009中公開?？筆D-1抗體(復(fù)數(shù)形式可互換使用)是免疫球蛋白分子，其能夠特異性結(jié)合的PD-1蛋白質(zhì)或其片段的，通過至少一個(gè)抗原識別位點(diǎn)，位于免疫球蛋白分子的可變區(qū)。如本文所用，術(shù)語“抗體”不僅包括完整的(即，全長)多克隆或單克隆抗體， 而且還包括抗原結(jié)合片段(例如Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2，F(xiàn)V)，單鏈(單鏈抗體)，其突變體，融合蛋白包含抗體部分，人源化抗體，嵌合抗體，雙抗體，線性抗體，單鏈抗體，多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和免疫球蛋白分子，其包含的任何其他修飾構(gòu)抗原識別位點(diǎn)所需特異性的，包括抗體的糖基化的變體，氨基酸的抗體的氨基酸序列變體和共價(jià)修飾的抗體。抗體包括任何一類，如IgD的，IgE的，IgG的，IgA或IgM抗體(或子類物)的抗體，以及該抗體不必是任何特定種類的。取決于其重鏈的恒定結(jié)構(gòu)域的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可歸入不同的類。免疫球蛋白有五大類：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中有些可進(jìn)一步分為亞類(同種型)，例如，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA。對應(yīng)于不同類的免疫球蛋白的重鏈恒定域分別稱作α，δ，ε，γ和μ的亞基結(jié)構(gòu)和不同類的免疫球蛋白的三維構(gòu)型是眾所周知的。要使用在本文描述的方法的抗體可以是小鼠，大鼠，人或任何其他來源(包括嵌合或人源化抗體)。在一些實(shí)例中，所述抗體包含修飾的恒定區(qū)，如一個(gè)恒定區(qū)是免疫惰性，例如不觸發(fā)補(bǔ)體介導(dǎo)的裂解，或者不刺激抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)。ADCC活性可使用在美國專利5,500,362號中公開的方法進(jìn)行評估。在其他實(shí)施方案中，恒定區(qū)包括改順序(歐洲免疫學(xué)雜志(1999)29：2613-2624；PCT申請PCT/GB99/01441；和/或英國專利申請9809951.8號)。任何本文描述的抗體的可以是單克隆或多克隆的?！皢慰寺】贵w”是指均質(zhì)抗體群，“多克隆抗體”是指異源抗體群。這兩個(gè)術(shù)語不限制抗體的來源或者其所用的方法。在一些實(shí)例中，本文公開的特異性抗體結(jié)合的靶的PD-1抗原。認(rèn)為“特異性結(jié)合”(在本文可互換使用)到目標(biāo)或的表位是本領(lǐng)域公知的術(shù)語和方法，以確定這種特異性結(jié)合也是本領(lǐng)域中公知的。分子被認(rèn)為顯示出“特異性的抗體結(jié)合”，如果它與靶點(diǎn)反應(yīng)更頻繁，更迅速，更大的持續(xù)時(shí)間?？贵w“特異性結(jié)合”于靶抗原，如果它以更大的親和力，親合力，更容易和/或以比其結(jié)合其他物質(zhì)的更大的持續(xù)時(shí)間結(jié)合。例如，抗體特異(或優(yōu)先)地結(jié)合到PD-1的表位是結(jié)合本PD-1的表位具有更大的親和力，親合力，更容易和/或以比其結(jié)合其它PD-1的表位或非PD-1表位更大的持續(xù)時(shí)間的抗體。還應(yīng)當(dāng)理解通過閱讀該定義，例如，抗體特異性結(jié)合第一靶抗原可以或可以不特異性或優(yōu)先結(jié)合第二靶抗原。因此，“特異性結(jié)合”或“優(yōu)先結(jié)合”不一定需要(雖然其可包括)專一結(jié)合。通常，但不一定，結(jié)合就是優(yōu)先結(jié)合?？筆D-1抗體是抗體能夠結(jié)合PD-1抗原并抑制PD-1介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑，從而增強(qiáng)免疫應(yīng)答，例如T細(xì)胞的活化。在一些實(shí)例中，本文中所描述的抗PD-1抗體至少20％抑制PD-1的信號傳導(dǎo)途徑，至少40％，至少50％，至少75％，至少90％，至少100％，或由至少2倍，至少5倍，至少10倍，至少20倍，至少50倍，至少100倍，或至少1000倍?？筆D-1抗體與PD-1抗原的結(jié)合親和力可以小于約100nM，約50nM，約10nM，約1nM，約500PM，約100pM，約50pM，約2pM。結(jié)合親和力可表示為：KD解離常數(shù)，KD越小結(jié)合親力越大。確定抗體PD-1的結(jié)合親和力的一種方式是通過表面復(fù)共振來測定(BIAcore3000TM表面等離子共振(SPR)系統(tǒng)，的BIAcore，INC，Piscaway新澤西州)。動(dòng)力學(xué)結(jié)合速率(kon)和分解率(koff)一般在25℃獲得；平衡解離常數(shù)(KD)值的計(jì)算方法：KD＝koff/kon本文所描述的抗PD-1抗體可以結(jié)合到相同于SHB-617的表位，其VH氨基酸序列和VL氨基酸序列在圖2，3，4和5中提供。或者是可競爭SHB-617結(jié)合到PD-1靶抗原的抗體。這樣的抗體可以表現(xiàn)出至少相對于SHB-617的20％(例如，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，或更高)抑制由PD-1介導(dǎo)的活性。這種抗PD-1抗體可以包括重鏈CDRs和/或輕鏈CDRs相同于SHB-617CDRs，例如，圖2和圖3所顯示CDR區(qū)(跟據(jù)Chothia編號方案所決定?？商娲鼗蛄硗獾?，本文描述的抗PD1抗體可以包含為VH的CDR1，CDR2和CDR3的至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同SHB-617，和/或?yàn)閂L的CDR1，CDR2，和CDR3至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同于SHB-617的對應(yīng)的CDRs。“互補(bǔ)決定區(qū)”或“CDR”是本領(lǐng)域中已知為是指抗體可變區(qū)中的非鄰接的氨基酸的序列，其賦予抗原特異性和結(jié)合親和力。在一般情況下，有在每條重鏈可變區(qū)的三(3)個(gè)CDR和在每一個(gè)輕鏈可變區(qū)的三(3)的CDR。一個(gè)給定的CDR的精確氨基酸序列的邊界可以使用任意數(shù)量的公知的方案中，包括那些由Kabat等人所述來確定。這些文獻(xiàn)包括Kabat(1991),5thEd.PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(theKabat"numberingscheme),Al-Lazikanietal.,(1997)JMB273,927-948(theChothia"numberingscheme),MacCallumetal.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996)(theContactnumberingscheme),LefrancMPetal.,DevCompImmunol,2003January；27(1):55-77(theIMGTnumberingscheme),andHoneggerAandPluckthunA,JMolBiol,2001Jun.8；309(3):657-70,(theAHonumberingscheme).一個(gè)給定的CDR的邊界可以根據(jù)用于識別該方案而有所不同。例如，所述的Kabat方案是基于結(jié)構(gòu)比，而Chothia方案基于結(jié)構(gòu)信息。聯(lián)系人方案基于復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)的分析，并在許多方面與Chothia編號方案類似。因此，除非另有規(guī)定，術(shù)語“互補(bǔ)決定區(qū)”或一個(gè)給定的抗體的“CDR”應(yīng)被理解通過任何以上描述的已知的方案所限定為包括互補(bǔ)決定區(qū)。如果，用相同的編號方案確定的，抗體具有相同的VH和/或VL的CDR作為SHB-617，這樣的抗體被視為具有相同的CDR作為SHB-617和本公開的范圍之內(nèi)。例如，這樣的抗體可具有相同的VH和/或VL的CDR作為克隆SHB-617如由Chothia編號方案所決定。在另一實(shí)例中，本公開的范圍內(nèi)的抗PD-1抗體可具有相同的VH和/或VL的CDR作為克隆SHB-617如通過Kabat編號方案來確定?？商娲?，本文描述的抗PD-1抗體可以包含VH至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同SHB-617VH(成熟或前體)和/或VL至少75％(例如，80％，85％，90％，95％，或98％)相同于SHB-617VL(成熟前體的)。兩個(gè)氨基酸序列的“同一性百分比”是使用Karlin和Altschul的算法來確定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:2264-68,1990,modifiedasinKarlinandAltschulProc.Natl.Acad.Sci.USA90:5873-77,1993)。這樣的算法并入NBLAST和XBLAST程序Altschul(版本2.0)，J.Mol.Biol.215:403-10,1990.BLAST蛋白質(zhì)檢索可以用XBLAST程序進(jìn)行，得分＝50，字長＝3，以獲得同源的氨基酸序列與感興趣的蛋白質(zhì)分子。當(dāng)兩個(gè)序列之間存在的一些間隙，空位BLAST可以如Altschul描述被利用(NucleicAcidsRes.25(17):3389-3402,1997)。當(dāng)利用BLAST和GappedBLAST程序時(shí)，可以使用各自程序的默認(rèn)參數(shù)(例如，XBLAST和NBLAST)。在其它實(shí)例中，本文所描述的抗PD-1抗體可以包含VH變種，其包括多達(dá)5個(gè)(例如，1，2，3，4或5)在VHCDR區(qū)的氨基酸殘基變化(VHCDR1，CDR2和/或CDR3)相比SHB-617的CDR，和/或VL變種，其包括多達(dá)5個(gè)(例如，1，2，3，4或5)在VLCDR區(qū)的氨基酸殘基變化(VLCDR1，CDR2和/或CDR3)相比SHB-617的CDRs。如本文所描述的抗PD-1抗體可以是從SHB-617衍生的嵌合抗體，這樣的嵌合抗體可以包括來自SHB-617衍生為VH和VL(本文描述的那些)和重恒定區(qū)和輕恒定區(qū)來自人抗體。嵌合抗體是指具有從第一物種來自第二物種的可變區(qū)或可變區(qū)的一部分，和恒定區(qū)的抗體。典型地，在這些嵌合抗體，包括輕鏈和重鏈模擬的可變區(qū)的抗體的可變區(qū)是來自于哺乳動(dòng)物(例如，非人哺乳動(dòng)物，如小鼠，兔和大鼠)中的一個(gè)物種，而恒定部分的序列與另一個(gè)哺乳動(dòng)物衍生的諸如人的抗體中的序列。在一些實(shí)施方案中，氨基酸修飾可以在可變區(qū)和/或恒定區(qū)來制備。在其它實(shí)例中，本文所描述的抗PD-1抗體是SHB-617“人源化抗體”。人源化抗體可以改變非人類抗體，以人序列取代某些抗體片段(例如，構(gòu)架區(qū))，從而減少在人體中免疫原性。本文所描述的人源化抗體可以是任何抗體形式。在一些實(shí)施方案中，它們是完整的免疫球蛋白分子(全長抗體)，包括IgG，IgA的，IgD的，IgE和IgM抗體。在其他實(shí)施方案中，人源化抗體的抗原結(jié)合片段，例如，F(xiàn)ab，F(xiàn)(ab’)2，scFv和Fv。在某些情況下，它們也可以是單鏈抗體或雙特異性抗體。人源化抗體可設(shè)計(jì)如下。首先對非人抗體VH及VL各可變區(qū)進(jìn)行三維分子建模，分析按照本領(lǐng)域中已知的方法，例如，Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:10029-10033(1989)。接著，使用鑒定相同的分子建模分析預(yù)測框架氨基酸殘基對正確的CDR結(jié)構(gòu)的形成起非常重要作用。同時(shí)，從人抗體基因數(shù)據(jù)庫搜索查詢與非人類抗體氨基酸序列具有高同源抗體基因，從而選擇人VH及VL受體基因。所選擇的人受體基因CDR區(qū)可以替換為從非人抗體或其功能變體CDR區(qū)。在必要時(shí)，被預(yù)測為與CDR區(qū)相互作用重要母體鏈的框架區(qū)內(nèi)的殘基(見上面的描述)可以被用于替代在人受體基因的相應(yīng)殘基。本文所述提供從SHB-617而來的嵌合體和人源化抗PD-1抗體氨基酸序列及抗體基因列于下方(也參見圖2-5；和實(shí)施例1-3)：SHB-617序列(鼠/人IgG4/卡帕嵌合體)重鏈的全長氨基酸序列(448AA)SEQIDNO.:13QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLSTSGTCVSWIRQPSGKGLEWLATICWEDSKGYNPSLKNRLTISKDTSNNQAFLKITSVDTADSAIYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVSVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK重鏈全長編碼基因序列SEQIDNO.:14CAGGTGACACTCAAGGAAAGCGGACCTGGAATCCTCCAACCTTCCCAGACTCTTTCCCTGACCTGTAGCTTCTCCGGGTTCTCCTTGTCCACCTCTGGCACATGCGTGTCATGGATCAGACAGCCATCTGGGAAGGGCTTGGAGTGGCTGGCAACAATTTGCTGGGAGGATTCAAAGGGGTACAACCCCAGTCTGAAGAACAGGCTGACCATTAGCAAGGACACCAGCAACAATCAGGCCTTCCTGAAAATTACTAGCGTCGATACAGCTGACAGCGCCATCTACTACTGCGCCCGCCGGGAGGACAGCGGGTACTTTTGGTTTCCCTATTGGGGCCAGGGCACTCTCGTCTCCGTGAGCAGTgctagcactaaggggccatcagtgttccccctggccccatgcagccggagtacaagcgaatccactgccgcccttggatgcctcgtgaaggattacttccccgagcccgtgaccgtgagttggaacagcggagccttgacaagcggcgtccacacattccccgccgtcctccagtctagcgggctttacagcctcagctccgtcgtgaccgtccctagttcctccctcggaactaagacatacacttgcaacgtggatcataagccctcaaacacaaaggtcgataagcgggtcgagagcaaatacggcccaccatgcccaccttgtcccgcccccgagtttttggggggcccctctgtgttcctctttcctcctaagcctaaggacactctcatgattagccggacacccgaggtcacctgcgtcgtcgtggacgtgagccaggaggaccctgaagtgcagttcaattggtatgtggacggggtcgaggtccacaacgccaagacaaagccaagagaggagcagtttaacagtacctaccgggtcgtgagtgtgctgacagtgcttcaccaggactggctgaacgggaaggagtataagtgcaaggtgtccaacaagggcctcccctcaagcatcgagaagactatctctaaggccaaggggcagcccagagagccacaggtgtatacattgccccctagccaggaggagatgactaaaaaccaggtgtctctgacctgtctggtcaaaggcttctacccctccgatatcgctgtggagtgggagtccaacggacagccagaaaacaactacaagaccacacctcccgtcctggatagcgacggctcatttttcctatacagcaggctgaccgtggacaaatccagatggcaggagggcaacgtgttctcctgcagcgtgatgcatgaggccctgcacaaccactacactcagaagtccctgtccctgagcctgggcaaatag輕鏈全長氨基酸序列(213AA)SEQIDNO.:15NIQMTQSPSLLSASVGDRVTLSCKAGQNVNNYLAWYQQKLGEPPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYFCQQYNSWTTFGAGTKLELKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC輕鏈全長基因編碼序列：SEQIDNO.:16AATATCCAGATGACCCAGTCCCCTTCCCTCCTCAGCGCTTCCGTGGGAGATAGGGTGACACTCAGTTGCAAGGCAGGACAGAACGTGAACAACTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCTGGGCGAACCTCCAAAGGTCCTTATCTTCAACGCCAACAGCCTGCAGACCGGGGTGCCCTCACGGTTTTCTGGGTCTGGGAGCGGCACAGACTTTACTTTGACTATTAGCTCCTTGCAGCCCGAGGACGTCGCCACATATTTCTGTCAGCAATACAACAGCTGGACCACCTTCGGGGCCGGCACAAAGCTGGAGCTGAAAcgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag人源化的SHB-617(SSI-361)可變區(qū)VL氨基酸序列SEQIDNO.:7NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKRVH氨基酸序列SEQIDNO.:9QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSS人源化的SHB-617(人IgG4)，也稱為SSI-361重鏈全長序列(448AA)SEQIDNO.:11QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSGTCVSWIRQPPGKALEWLATICWEDSKGYNPSLKSRLTISKDTSKNQAVLTMTNMDPVDTATYYCARREDSGYFWFPYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK輕鏈全長序列(213AA)SEQIDNO.:12NIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKAGQNVNNYLAWYQQKPGKAPKVLIFNANSLQTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYNSWTTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC本文還描述了上述披露示例人源化抗PD-1抗體SSI-361的功能性變體。這樣的功能變體可以包括為VH，其包含的氨基酸序列至少85％(例如，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％)相同于SSI-361，和/或?yàn)閂L具有的氨基酸序列中的至少85％(例如，90％，92％，94％，95％，96％，97％，98％，或99％)相同于SSI-361.這些變體能夠結(jié)合到PD-1，特別是人的PD-1抗原。在一些實(shí)例中，所述變體具有抗原結(jié)合親和力相對于上述的示例性人源化抗體相似(例如，具有的Kd<100×10-9M)。在一些實(shí)施方案中，上述的功能性變體包含一個(gè)或多個(gè)突變(例如，保守取代)中的任一在VH或VL的FR(相比SSI-361)。優(yōu)選地，這樣的突變不會(huì)發(fā)生在被預(yù)測為與一種或多個(gè)CDRs相互作用氨基酸殘基(見實(shí)施例2下文)。正如本領(lǐng)域已知的，F(xiàn)R區(qū)中的突變是不太可能影響抗體的抗原結(jié)合活性。在其他實(shí)施方案中，功能性變體本文所述的包含一個(gè)或多個(gè)突變(例如，1，2，或3)在一個(gè)CDR區(qū)的一個(gè)或多個(gè)。優(yōu)選地，這種功能性變體保持相同的區(qū)域/殘基負(fù)責(zé)抗原結(jié)合作為母體，如CDR的內(nèi)部相同的特異性決定殘基。任何抗PD-1抗體可以通過常規(guī)的方法，例如，重組技術(shù)來制備。見，例如，Green等,NatureGenetics7,13；和美國專利號5545806和5569825。當(dāng)制備一個(gè)全長抗體，編碼本文所述的任何抗PD-1抗體VH及VL的序列可以連接于人免疫球蛋白的Fc區(qū)和所得基因的編碼全的編碼序列全長抗體重和輕鏈可以表示并裝配在合適的宿主細(xì)胞，例如，植物細(xì)胞，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，酵母細(xì)胞，或昆蟲細(xì)胞?？乖Y(jié)合片段可通過常規(guī)方法制備。例如，F(xiàn)(ab’)2片段可通過胃蛋白酶消化的全長抗體分子；Fab片段可以通過還原F(ab’)2片段的二硫橋產(chǎn)生產(chǎn)生。或者，這樣的片段可通過重組技術(shù)通過表達(dá)在合適的宿主細(xì)胞中的重鏈和輕鏈片段制備(例如，大腸桿菌，酵母，哺乳動(dòng)物，植物，或昆蟲細(xì)胞)，并讓它們在體內(nèi)或體外組裝以形成所需的抗原結(jié)合片段。單鏈抗體可通過重組技術(shù)通過將一核苷酸序列編碼的重鏈可變區(qū)和核苷酸序列編碼的輕鏈可變區(qū)來制備。優(yōu)選地，柔性接頭結(jié)合兩個(gè)可變區(qū)之間。如上所述產(chǎn)生人源化抗PD-1抗體可以進(jìn)行檢查，以確定其性能，如抗原結(jié)合活性和生物功能，以下的常規(guī)方法，例如，實(shí)施例3下面描述的那些。本文還公開了編碼本文描述的任何抗PD-1抗體的核酸，載體如包含這些核酸的表達(dá)載體，和包含所述載體的宿主細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)例中，兩個(gè)重鏈和輕鏈編碼序列包含在一個(gè)表達(dá)載體，每個(gè)重鏈編碼序列和輕鏈編碼序列可以可操作地連接到合適的啟動(dòng)子?？商娲?，這兩個(gè)重鏈和輕鏈的表達(dá)可以由相同的啟動(dòng)子來驅(qū)動(dòng)。在另一實(shí)例中，每個(gè)抗體的重鏈和輕鏈克隆在給個(gè)體載體。在后一種情況下，編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體可以被共轉(zhuǎn)染到一個(gè)宿主細(xì)胞中的兩條鏈，其可以被組裝以形成完整的抗體在體內(nèi)或體外的表達(dá)。備選地，表達(dá)載體編碼重鏈和編碼輕鏈可引入不同宿主細(xì)胞中表達(dá)各重鏈和輕鏈，然后可以被純化和組裝以形成完整的抗體。合適的宿主細(xì)胞包括，但不限于，哺乳動(dòng)物細(xì)胞(例如，CHO細(xì)胞或293細(xì)胞)，植物細(xì)胞，昆蟲細(xì)胞，酵母細(xì)胞，或細(xì)菌細(xì)胞。本公開還提供一種免疫偶聯(lián)包含任何本文中所描述的抗PD-1抗體和合適的試劑，其可以是治療劑或診斷劑。在一些實(shí)例中，本文公開抗PD-1抗體連接到細(xì)胞毒性劑，放射性同位素，或藥物。制備這種免疫綴合物在本領(lǐng)域中是公知的。例如見，WO2014/160160,美國專利號5208020和5416064，及Chari等，1992癌癥研究。52：127-131。例如，可將抗體與雙功能試劑如N-琥珀酰亞胺-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)改性以引入活性二硫化物部分。如果需要的話，該代理也可以綴合到抗體可以被修飾，以引入硫醇基團(tuán)以下常規(guī)實(shí)踐。反應(yīng)與含硫醇試劑將產(chǎn)生其中抗體和試劑通過二硫鍵連接的免疫綴合物?？筆D-1抗體用途本文所描述的抗PD-1抗體(游離形式或作為免疫綴合物)可以用作治療劑和診斷劑，以及作為研究工具應(yīng)用于生物化學(xué)，分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究工作。因此，本文所公開的用于治療與PD-1的信號傳導(dǎo)有關(guān)的疾病的方法(例如，癌癥，感染性疾病如病毒感染(如，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎或C)，以及其它免疫相關(guān)疾病)，其包括給予需要所述治療的個(gè)體本文所述的任何抗PD-1抗體的有效量，這種抗體也可用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)，如T細(xì)胞的活化在需要治療的受試者。在一個(gè)實(shí)例中，需要?jiǎng)倓偺岬降闹委煹膶ο?例如，人類患者)是具有，懷疑具有，或有風(fēng)險(xiǎn)有癌癥發(fā)展的患者。如本文所用，“治療”一詞是指一種組合物，包括一種或多種活性劑對受試者的施用或給藥?；颊呔哂信cPD-1介導(dǎo)相關(guān)的病癥/疾病(例如，本文描述的那些)，癥狀的疾病/紊亂，或者向疾病/病癥的誘因，其宗旨是治療，治愈，減輕，解除，改變，矯正，緩解，改善或影響疾病/病癥，這種病的癥狀/病癥，或朝向該疾病/病癥的傾向。本文所用的“有效量”指的是賦予治療效果上的問題，無論是單獨(dú)或與一種或多種其它活性劑組合所需的每種活性劑的量。有效量而有所不同，所確認(rèn)的本領(lǐng)域技術(shù)人員在，根據(jù)特定的條件被治療的病癥的嚴(yán)重程度，個(gè)體患者參數(shù)，包括年齡，身體狀況，身高，性別和體重，治療的持續(xù)時(shí)間，所述并行治療的性質(zhì)(如果有的話)，管理和像的保健醫(yī)生的知識和經(jīng)驗(yàn)范圍內(nèi)的因素的具體路線。這些因素是公知的那些普通技術(shù)人員在本領(lǐng)域中，并且可以與不超出常規(guī)的實(shí)驗(yàn)來解決。它通常優(yōu)選的是其使用的各個(gè)組件或組合的最大劑量，也就是最高安全，根據(jù)劑量，以合理的醫(yī)學(xué)判斷。但是像本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可理解的，患者可能跟據(jù)醫(yī)療原因，心理原因或幾乎任何其他原因堅(jiān)持要求較低劑量或可耐受的劑量。在一些實(shí)施方案中，抗PD-1抗體本文所述的量是有效地抑制了PD-1信號(例如，至少20％，30％，50％，80％，100％，200％，400降低PD1信號％，或500％相比，空白對照)。在其他實(shí)施方案中，抗PD-1抗體本文所述的量是有效的活化免疫應(yīng)答(例如，至少20％，30％，50％，80％，100％，200％，400％，或500％相比于空白對照)。通常，對于任何本文描述的抗體的施用，初始候選劑量可以是約2毫克/公斤。為了本公開的目的，典型的日劑量的范圍為約任何0.1微克/公斤至3微克/公斤到30微克/公斤至300微克/公斤至3毫克/公斤，30毫克/公斤至100毫克/公斤或更多，這取決于上述因素。對于持續(xù)數(shù)天或更長的重復(fù)施用，根據(jù)狀況，治療或持續(xù)直到不良癥狀發(fā)生。示例性的給藥方案包括施用初始劑量為約2毫克/公斤，隨后是約1毫克/公斤的抗體的每周維持劑量，或之后的約1毫克/公斤每隔一周的維持劑量。然而，其它劑量方案可能是有用的，這取決于藥物代謝動(dòng)力學(xué)衰變該醫(yī)生希望達(dá)到的圖案。例如，每周1-4次給藥是預(yù)期的。在一些實(shí)施方案中，劑量范圍從約3微克/公斤到約2毫克/公斤(約3微克/公斤，約30微克/公斤，約300微克/公斤，約3毫克/公斤)可被使用。在一些實(shí)施方案中，給藥頻率每周是一次，每2周，每4周，每5周，每6周，每7周，每8周，每9周，或每10周一次；或每月一次，每2個(gè)月，或每3個(gè)月，或更長的時(shí)間一次。此療法的進(jìn)展易于通過常規(guī)技術(shù)和測定法監(jiān)測。給藥方案(包括使用的抗體)可以隨時(shí)間變化。能夠?qū)嵺`本文所公開的處理中，任何抗PD-1抗體或編碼核酸的可與藥學(xué)上可接受的載體混合以形成用于給予需要該治療的受試者的藥物組合物。藥學(xué)上可接受的載體是與組合物中的活性成分(多個(gè))相容(和優(yōu)選地，能夠穩(wěn)定它的)，而不是有害于要治療的受試者。例如，增溶劑如環(huán)糊精，如本文所述其中形成具有抗PD-1抗體更可溶絡(luò)合物，或核酸編碼這樣，或多種增溶劑，可以用作藥 物載體用于遞送激動(dòng)劑/拮抗劑。其它載體的實(shí)例包括膠體二氧化硅，硬脂酸鎂，月桂基硫酸鈉，和D&C黃#10，例如，見Remington’sPharmaceuticalSciences,Edition16,MackPublishingCo.,Easton,Pa(1980)；andGoodmanandGilman’s"ThePharmacologicalBasisofTherapeutics",TenthEdition,Gilman,J.HardmanandL.Limbird,eds.,McGraw-HillPress,155-173,2001.配制為用于治療用途的藥物組合物，可用于存儲由混合的藥劑具有純度與任選的藥學(xué)上可接受的載體，賦形劑或穩(wěn)定劑在所希望的程度來制備(Remington’sPharmaceuticalSciences16thedition,Osol,A.Ed.(1980))，以凍干配制劑或水溶液的形式?？山邮艿妮d體，賦形劑，或穩(wěn)定劑是無毒的收件人在所采用的劑量和濃度，并且包括緩沖劑如磷酸鹽，檸檬酸鹽和其它有機(jī)酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑(如十八烷基氯化銨；氯化己烷雙胺；苯扎氯銨，芐索氯銨；苯酚，丁基或芐基醇；對羥基苯甲酸酯的烷基如甲基或?qū)αu基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環(huán)己醇；3-戊醇；和間甲酚)；低分子量(少于約10個(gè)殘基)多肽；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，組氨酸，精氨酸，或賴氨酸；單糖，二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑，如EDTA；糖，如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨醇；形成鹽的抗衡離子如鈉；金屬配合物(例如，Zn-蛋白質(zhì)復(fù)合物)；和/或非離子表面活性劑例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。治療目標(biāo)疾病，上面提到的藥物組合物的有效量可以通過合適的途徑給予受試者(例如人)。需要治療的受試者可以是有風(fēng)險(xiǎn)，或懷疑患有與PD-1介導(dǎo)有關(guān)病癥的患者。這樣的患者可以通過常規(guī)體檢來鑒定。本文所述的治療性多核苷酸或多肽可使用基因遞送載體被遞送。基因遞送載體可以是病毒或非病毒來源的(一般參見，Jolly,CancerGeneTherapy(1994)1:51；Kimura,HumanGeneTherapy(1994)5:845；Connelly,HumanGeneTherapy(1995)1:185；andKaplitt,NatureGenetics(1994)6:148)。這樣的編碼序列的表達(dá)可以使用內(nèi)源哺乳動(dòng)物的或異源啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子被誘導(dǎo)。編碼序列的表達(dá)可以是組成型或調(diào)節(jié)。遞送所需多核苷酸的表達(dá)在期望的細(xì)胞的病毒為基礎(chǔ)的載體是公知的現(xiàn)有技術(shù)。示例性的基于病毒的載體包括，但不限于，重組逆轉(zhuǎn)錄病毒(見，例如，PCTPublicationNos.WO90/07936；WO94/03622；WO93/25698；WO93/25234；WO93/11230；WO93/10218；WO91/02805；U.S.Pat.Nos.5,219,740and4,777,127；GBPatentNo.2,200,651；andEPPatentNo.0345242)，甲病毒為基礎(chǔ)的載體(例如，辛德畢斯病毒載體，塞姆利基森林病毒(ATCCVR-67；ATCCVR-1247)，羅斯河病毒(ATCCVR-373；ATCCVR-1246)和委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(ATCCVR-923；ATCCVR-1250；ATCCVR1249；ATCCVR-532)，和腺相關(guān)病毒(AAV)載體(見，例如，PCTPublicationNos.WO94/12649,WO93/03769；WO93/19191；WO94/28938；WO 95/11984andWO95/00655)。DNA聯(lián)接到殺死的腺病毒也可以使用(Curiel,Hum.GeneTher.(1992)3:147)。非病毒遞送載體和方法也可使用，包括，但不限于，聚陽離子凝聚的DNA連接或單獨(dú)切斷了殺死腺病毒(見，例如，Curiel,Hum.GeneTher.(1992)3:147)；配體連接的DNA(例如，Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985)；真核細(xì)胞輸送載體細(xì)胞(見，例如，美國專利No.5,814,482；PCTPublicationNos.WO95/07994；WO96/17072；WO95/30763；andWO97/42338)和核酸電荷中和或融合細(xì)胞膜。裸DNA也可以采用。示例性的裸DNA導(dǎo)入方法在PCT公開號WO90/11092和美國專利號5580859中所述。脂質(zhì)體，可作為基因遞送載體在專利中描述(U.S.Pat.No.5,422,120；PCTPublicationNos.WO95/13796；WO94/23697；WO91/14445；andEPPatentNo.0524968)。其他方式見Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411,andinWoffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581。如果需要的話，本文所述的藥物組合物，含有抗PD-1抗體或其編碼核酸(多個(gè))，可以共同施用第二治療劑。第二治療劑的選擇取決于疾病的待處理的類型。例如，如果目標(biāo)疾病是癌癥，所述第二劑可以是抗癌劑(例如，他莫昔芬，紫杉醇，替尼，塞米松，和赫賽汀)。當(dāng)這里所描述的藥物組合物是共用于與第二治療劑，無論是組合物中的第二藥劑的或，或兩者的亞治療劑量的亞治療劑量，可以在受試者中具有可用于治療，或有發(fā)展與細(xì)胞信號由PD-1介導(dǎo)相關(guān)的疾病或病癥的風(fēng)險(xiǎn)。靶疾病包括癌癥(例如，本文中描述的那些)，感染性疾病等引起的病毒，細(xì)菌，或真菌感染，或免疫缺陷，如T細(xì)胞功能障礙相關(guān)的其他疾病的疾病。由病毒感染引起的疾病包括，但不限于，甲型肝炎，乙型肝炎，丙型肝炎病毒。這里所用的“亞治療劑量”是指一種劑量，這是小于會(huì)產(chǎn)生治療效果的劑量(如果受試者施用在沒有其他試劑或試劑)。因此，亞治療劑量在不使用本發(fā)明的藥劑時(shí)給藥對象不會(huì)產(chǎn)生所需治療結(jié)果。許多試劑治療劑量是在臨床使用的是在醫(yī)藥領(lǐng)域公知的，和另外的治療劑量可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過度的實(shí)驗(yàn)來確定。治療劑量已經(jīng)于如Remington的PharmaceuticalSciences，第22版(2012)的引用已廣泛地描述；還有許多其他醫(yī)學(xué)界作為指導(dǎo)疾病和病癥的治療的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)。常規(guī)方法，已知的醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，可以用于施用藥物組合物給受試者，這取決于疾病的要治療的類型或疾病的部位。此組合物還可以通過其它常規(guī)途徑，例如，口服，腸胃外給藥，通過吸入噴霧，局部，直腸，經(jīng)鼻，口腔，陰道或通過植入庫。本文所用的術(shù)語“腸胃外”包括皮下，皮內(nèi)，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，關(guān)節(jié)內(nèi)，動(dòng)脈內(nèi)，滑膜內(nèi)，胸骨內(nèi)，鞘內(nèi)，病灶內(nèi)和顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。此外，它可以施用到通過施用可注射的貯庫途徑，例如使用1-，3-，或6個(gè)月的貯庫可注射或可生物降解的材料和方法的主題。注射組合物可以含有各種載體如植物油，二甲基乙酰胺(dimethylactamide)，二甲基甲酰胺，乳酸乙酯，碳酸乙酯，肉豆蔻酸異丙酯，乙醇，多元醇(甘油，丙二 醇，液體聚乙二醇，等等)。對于靜脈內(nèi)注射，水溶性抗體可以通過點(diǎn)滴方法，由此含有抗體和生理上可接受的賦形劑的藥物制劑輸注給藥。生理上可接受的賦形劑可以包括，例如，5％葡萄糖，0.9％鹽水，林格溶液或其它合適的賦形劑。肌內(nèi)制劑，例如，抗體的一個(gè)合適的可溶鹽形式的無菌制劑，可以溶解和施用的藥用賦形劑諸如水換注射液，0.9％鹽水，或5％葡萄糖溶液。當(dāng)用編碼本文所述用作治療劑的抗PD-1抗體核酸作治療，核酸或載體表達(dá)該抗體可以遞送受試者(Akhtar等,1992,TrendsCellBio.2,139).例如，它可以通過使用脂質(zhì)體，水凝膠，環(huán)糊精，生物可降解的納米膠囊，或生物粘附性微球被引入到細(xì)胞中?；蛘?，所述核酸或載體可在本地通過直接注射或通過使用輸注泵遞送。其它方法包括通過使用綴合物和生物可降解的聚合物的使用各種運(yùn)輸和載體系統(tǒng)。為了便于輸送，任何抗PD-1抗體或其編碼核酸可以結(jié)合有伴侶劑。如本文所用，“綴合”是指兩個(gè)實(shí)體相關(guān)聯(lián)，優(yōu)選以足夠親和力，這兩個(gè)實(shí)體之間的關(guān)聯(lián)的治療益處的實(shí)現(xiàn)。軛包括共價(jià)或非共價(jià)鍵合，以及其它形式的關(guān)聯(lián)，如任一實(shí)體對截留或內(nèi)的其它，或上或內(nèi)的第三實(shí)體(兩個(gè)實(shí)體，例如，膠束)。伴侶劑可以是天然存在的物質(zhì)，如蛋白質(zhì)(例如，人血清白蛋白，低密度脂蛋白，或球蛋白)，碳水化合物(例如，葡聚糖，支鏈淀粉，殼多糖，脫乙酰殼多糖，菊糖，環(huán)糊精或透明質(zhì)酸)，或脂質(zhì)。它也可以是一個(gè)重組或合成分子，例如合成聚合物，例如，一種合成的聚氨基酸。聚氨基酸的實(shí)例包括聚賴氨酸(PLL)，聚L-天冬氨酸，聚L-谷氨酸，苯乙烯-馬來酸酐共聚物，聚(L-丙交酯-共-glycolied)共聚物，二乙烯基醚-馬來酸酐共聚物，N-(2-羥丙基)甲基丙烯酰胺共聚物(HMPA)，聚乙二醇(PEG)，聚乙烯醇(PVA)，聚氨基甲酸酯，聚(2-ethylacryllic酸)，N-異丙基丙烯酰胺的聚合物，和聚膦嗪。在一個(gè)實(shí)例中，伴侶劑是微膠粒，脂質(zhì)體，納米顆粒，或微球體，其中的寡核苷酸/干擾RNA被封裝。制備這種微膠粒，脂質(zhì)體，納米顆粒，或微球體是公知的現(xiàn)有技術(shù)。見，例如，美國專利5108921；5354844；5416016；和5,527,5285。在另一實(shí)例中，伴侶劑作為基底用于連接一個(gè)或多個(gè)膜融合或縮合劑的。阿膜融合劑是響應(yīng)局部pH值。例如，在核內(nèi)體中遇到的pH值，它可以導(dǎo)致在其直接環(huán)境，物理變化，例如，在滲透性質(zhì)的變化擾亂或增大核內(nèi)體膜的滲透性，從而有利于釋放的反義寡核苷酸進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。優(yōu)選的促融合劑改變電荷，例如，在pH低于生理范圍時(shí)變得質(zhì)子化(例如，在pH4.5-6.5)。促融合劑可以是含有能夠經(jīng)歷電荷改變的氨基分子(如質(zhì)子)當(dāng)暴露于特定的pH值范圍。這種促融合劑包括具有聚鏈的聚合物(例如，聚乙烯亞胺)和膜破壞劑(如，mellittin)。其他的例子包括多組氨酸，polyimidazole，聚吡啶，聚丙烯亞胺，和聚縮醛物質(zhì)(例如，陽離子聚縮醛)。與反義寡核苷酸甲冷凝劑相互作用，導(dǎo)致它以冷凝(例如，減少寡核苷酸的大小)，從而保護(hù)它免于降解。優(yōu)選地，所述縮合劑包括：部分(例如，帶電的部分)，其與通過，寡核苷酸相互作用，例如，離子相互作用?？s合劑的實(shí)例包括聚賴氨酸， 精胺，亞精胺，聚胺或季鹽，假肽-聚胺，肽聚胺，聚胺樹枝狀聚合物，精氨酸，脒，魚精蛋白，陽離子脂質(zhì)，陽離子卟啉，和α-螺旋肽。組合治療本文還提供了如本文所述的與任何抗PD-1這里所描述的抗體和合適的第二藥劑的組合療法為任何與PD-1的信號傳導(dǎo)相關(guān)的疾病。術(shù)語聯(lián)合治療，如本文所使用的，包括這些試劑的給藥(例如，抗PD-1抗體，例如本文所述的那些和第二種合適的治療劑)以順序的方式，也就是，其中每種治療劑的給藥在不同的時(shí)間這些治療劑，或至少兩種藥劑的，以基本同步的方式，以及施用。每種藥劑的順序或基本上同時(shí)給予可受任何適當(dāng)?shù)耐緩?，包括但不限于，口服途徑，靜脈途徑，肌內(nèi)，皮下途徑，并直接吸收通過粘膜組織。所述劑可以通過相同的途徑或不同的途徑給藥。例如，第一藥劑(例如，抗PD-1抗體)可以口服給藥，而第二藥劑(例如，抗癌癥劑，抗感染劑；或免疫調(diào)節(jié)劑)可以被靜脈內(nèi)給藥。此外，所選擇的組合的試劑可以通過靜脈注射施用，而組合的其它藥劑可以口服給藥?？商娲?，例如，兩個(gè)或多個(gè)代理可以通過靜脈內(nèi)或皮下注射施用。如本文所用，術(shù)語“連續(xù)”的意思，除非另有規(guī)定，其特點(diǎn)是正規(guī)的順序或次序，例如，如果一個(gè)劑量方案包括抗PD-1抗體的施用和第二劑，順序給藥方案可以之前包括抗PD-1抗體的施用，同時(shí)，基本同時(shí)，或施用第二藥劑，但兩種藥劑之后將被施用在一個(gè)普通的順序或次序。術(shù)語“分開的”是指，除非另有規(guī)定，保持除了從另一個(gè)。術(shù)語“同時(shí)”的意思，除非另有說明，或發(fā)生在相同的時(shí)間內(nèi)完成，也就是說，本發(fā)明的藥劑施用同時(shí)。術(shù)語“基本上同時(shí)”是指該試劑彼此分鐘內(nèi)施用(例如，在10分鐘之內(nèi))，并打算涵蓋聯(lián)合施用以及連續(xù)施用，但如果施用是連續(xù)它是在時(shí)間上分離的只有很短的時(shí)間(如時(shí)間，將采取一個(gè)醫(yī)生來管理兩種化合物另發(fā))。如本文所用，同時(shí)施用和基本上同時(shí)給藥可以互換使用。順序給藥是指在時(shí)間上分離的本文所述藥劑的施用。聯(lián)合療法還可以接受在進(jìn)一步結(jié)合本文中所描述與其它生物活性成分的試劑的施用。其中聯(lián)合療法還包括放射治療，放射治療可以在任何合適的時(shí)間進(jìn)行，只要從治療劑和放射治療的組合的協(xié)同作用的有益效果達(dá)到進(jìn)行。例如，在適當(dāng)?shù)那闆r下，有益的作用仍由天甚至數(shù)周時(shí)達(dá)到輻射治療被暫時(shí)從治療劑的施用除去，也許。當(dāng)目標(biāo)疾病是癌癥，抗PD-1抗體也可以前或手術(shù)或放療后使用。但是應(yīng)當(dāng)理解的是，任何組合如本文所述的，可以使用任何順序用于治療本文中所述的對象疾病。本文所述的組合可以由許多因素，包括但不限于抑制或預(yù)防目標(biāo)疾病進(jìn)展，減輕了組合的另一種藥劑的副作用的有效性，或效力的基礎(chǔ)上選擇減輕的目標(biāo)有關(guān)的疾病癥狀的效果。例如，本文所述的聯(lián)合治療可減少任何由組合的每個(gè)個(gè)別成員有關(guān)的副作用。合適的試劑為與任何共使用實(shí)施例抗PD-1抗體包括抗體結(jié)合的共刺激受體(例如，CD137/4-1BB，OX40，CD40，或GITR)，的藥劑誘導(dǎo)的免疫原性細(xì)胞死 亡(例如，化療劑，放射治療劑，抗血管生成劑，或用于靶向治療的試劑)中，抑制一個(gè)檢查點(diǎn)的分子的試劑(例如，CTLA4，LAG3，TIM3，BTLA，或TIGIT)，一個(gè)癌癥疫苗，修飾免疫酶(例如，IDO1或iNOS)的，靶向Treg細(xì)胞，用于過繼細(xì)胞療法，或者其調(diào)節(jié)髓樣細(xì)胞的試劑。用于增強(qiáng)免疫反應(yīng)和治療PD-1信號相關(guān)疾病工具包本公開還提供試劑盒用于增強(qiáng)免疫應(yīng)答和/或治療與PD-1信號有關(guān)的疾病的使用。此類試劑盒可包括一個(gè)或多個(gè)容器，包括如本文所述的抗PD-1抗體。在一些實(shí)施方案中，試劑盒可以包括用于根據(jù)本文所述任何方法的使用說明。所包括的指令可以包括抗PD-1抗體給藥的說明，以加強(qiáng)免疫應(yīng)答和/或如本文所述的治療對象疾病。所述試劑盒可進(jìn)一步包括基于鑒定個(gè)體是否具有本文所述的那些PD-1信號傳導(dǎo)有關(guān)的疾病。關(guān)于使用抗PD-1抗體的指令一般包括信息如劑量，給藥時(shí)間表，和給藥途徑用于預(yù)期治療。所述容器可以是單位劑量，散裝包(例如，多劑量包裝)或亞單位劑量。在本發(fā)明的試劑盒提供的指令通常寫在標(biāo)簽或包裝插頁(指示例如，包括在試劑盒的紙頁)，但機(jī)器可讀指令(例如，攜帶的磁或光存儲盤上的指示)也可以接受的。所述標(biāo)簽或包裝插頁指示該組合物用于治療本文所公開的任何目標(biāo)疾病的或減輕這種疾病的一種或多種癥狀，可以提供用于實(shí)施本文所述任何方法。本發(fā)明的試劑盒在合適的包裝中。合適的包裝包括但不限于，小瓶，瓶，罐，軟包裝(例如密封的聚脂薄膜或塑料袋)和類似物。還預(yù)期的是包裝組合使用與特定設(shè)備，例如吸入器，鼻施用裝置(例如，霧化器)或輸液設(shè)備，諸如微型泵。一種試劑盒，可以具有無菌存取口(例如容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有可刺穿的塞子皮下注射針頭的小瓶)。容器還可以具有無菌存取口(例如容器可以是靜脈內(nèi)溶液袋或具有可刺穿的塞子皮下注射針頭的小瓶)。在組合物中的至少一種活性劑是抗PD-1抗體如本文所述。本文描述的試劑盒可包括一種或多種另外的治療劑，例如那些如上所述在“聯(lián)合治療”。試劑盒可任選地提供額外的組分，例如緩沖液和解釋性的信息。通常，試劑盒包括一個(gè)容器，在標(biāo)簽或包裝插頁或與容器相關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的上述試劑盒的制造，包括內(nèi)容的文章。通用技術(shù)本發(fā)明的實(shí)踐將采用，除非另有說明，分子生物學(xué)的常規(guī)技術(shù)(包括重組技術(shù))，微生物學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生物化學(xué)和免疫學(xué)，這是本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中充分解釋，諸如，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊，第二版冷泉港出版社；(Sambrook等，1989。)寡核苷酸合成(MJ步態(tài)，編，1984年。)；在分子生物學(xué)方法，Humana公司出版社；細(xì)胞生物學(xué)：實(shí)驗(yàn)室筆記本(JECellis，編輯，1998年)科學(xué)出版社；動(dòng) 物細(xì)胞培養(yǎng)(RIFreshney編，1987年)；介紹細(xì)胞和組織培養(yǎng)(JP馬瑟和PE羅伯茨，1998年)中全會(huì)出版社；細(xì)胞與組織培養(yǎng)：檢驗(yàn)操作規(guī)程(A.多伊爾，JB格里菲思和DG紐厄爾，EDS，1993-8)，J。Wiley和Sons；酶學(xué)方法(學(xué)術(shù)出版社有限公司)；手冊實(shí)驗(yàn)免疫學(xué)(DM堰和CC布萊克威爾，合編)；基因轉(zhuǎn)移載體的哺乳動(dòng)物細(xì)胞(JM米勒和MPCalos合編，1987年)；在分子生物學(xué)當(dāng)前協(xié)議(調(diào)頻Ausubel等，編，1987)；PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，(Mullis的，等人，編著，1994)；當(dāng)前協(xié)議中免疫學(xué)(JEColigan等人編著，1991)；分子生物學(xué)短期協(xié)議(Wiley和Sons，1999年)；免疫學(xué)(CA詹韋和P.斯格特，1997年)；抗體(P.芬奇，1997年)；抗體：一個(gè)實(shí)用的方法(。D.凱蒂，編，IRL出版社，1988至1989年)；單克隆抗體：一個(gè)實(shí)用的方法(P.牧羊人和C.院長，編，牛津大學(xué)出版社，2000。)；使用抗體：實(shí)驗(yàn)室手冊(E.Harlow和D.巷(冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社，1999)；該抗體(M.薩內(nèi)蒂和JD卡普拉編，哈伍德學(xué)術(shù)出版社，1995年)。無需進(jìn)一步詳細(xì)說明，據(jù)信本領(lǐng)域的技術(shù)人員可根據(jù)上面的描述，利用本發(fā)明至其最大限度。以下的具體實(shí)施方案，因此，應(yīng)解釋為僅僅是說明性的，并且不限制本公開的以任何方式的其余部分。本文引用的所有出版物都通過用于本文引用的目的或主題引入作為參考。實(shí)施例1：先導(dǎo)抗PD-1抗體的產(chǎn)生試劑和方法人類PD-1蛋白(目錄號1086-PD，F(xiàn)c嵌合體)，PD-L1的(目錄號156-B7，F(xiàn)c嵌合體)，和針對人PD-1(目錄號AF1086)抗原親和純化的多克隆山羊IgG購自R&D系統(tǒng)(美國)。單克隆小鼠抗人PD-1(克隆J116，目錄號16-9989-82)從eBiosciences(美國)購買。表達(dá)人PD-1穩(wěn)定的CHO細(xì)胞系通過轉(zhuǎn)染全長人PD-1基因(基因ID：5133)構(gòu)建。捕獲ELISA檢測抗PD-1抗體：ELISA板先包被鏈霉親和素和生物素-PD-1，加抗體樣品與之結(jié)合后，用偶聯(lián)了辣根過氧化物酶的二抗檢測(羊抗小鼠或大鼠的IgG)。FACS檢測抗PD-1抗體與CHO-PD-1細(xì)胞的結(jié)合：抗體樣品與CHO-PD1細(xì)胞孵育后用PE或FITC標(biāo)記的二抗標(biāo)記并用流式檢測。FACS檢測抗體阻斷PD-1和PD-L1的結(jié)合：PD-L1與抗-PD1抗體競爭結(jié)合CHO-PD-1，結(jié)合的PD-L1用Alexa488偶聯(lián)的抗人Fc段二抗檢測。雜交瘤細(xì)胞的構(gòu)建以及抗體鑒定BALB/c小鼠和Wistar大鼠用重組人PD-1蛋白(R&D，#1086-PD，F(xiàn)c嵌合體)進(jìn)行免疫。免疫動(dòng)物的抗血清PD-1滴度通過捕獲ELISA進(jìn)行監(jiān)測并復(fù)篩人Fc段。陽性滴度的血清進(jìn)一步在CHO-PD1細(xì)胞上用FACS確定。將抗體滴度最高的小鼠和大鼠處死后，分離脾臟細(xì)胞，按雜交瘤實(shí)驗(yàn)方法與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。我們用捕獲法ELISA篩選了20塊96孔板小鼠雜交瘤細(xì)胞，鑒定出334個(gè)陽性孔。陽性的細(xì)胞進(jìn)一步用人Fc段復(fù)篩，鑒定出85個(gè)克隆為PD-1特異性。然后，用FACS方法檢測這些特異性克隆與CHO-PD-1細(xì)胞的結(jié)合，鑒定出34個(gè)結(jié)合能力最高的克隆用于進(jìn)一步的PD-L1阻斷篩選試驗(yàn)。我們還用捕獲法ELISA篩選了25塊96孔板大鼠雜交瘤細(xì)胞，鑒定出207個(gè)陽性孔。陽性的細(xì)胞進(jìn)一步用人Fc段復(fù)篩，鑒定出54個(gè)克隆為PD-1特異性。然后，用FACS方法檢測這些特異性克隆與CHO-PD-1細(xì)胞的結(jié)合，鑒定出30個(gè)結(jié)合能力最高的克隆用于進(jìn)一步的PD-L1阻斷篩選試驗(yàn)。我們用阻斷PD-1和PD-L1結(jié)合試驗(yàn)篩選陽性雜交瘤細(xì)胞，鑒定出24個(gè)能特異性結(jié)合PD-1并阻斷PD-L1結(jié)合的克隆。然后我們亞克隆了13個(gè)作用最強(qiáng)的雜交瘤(5個(gè)大鼠雜交瘤和8個(gè)小鼠雜交瘤)，從8個(gè)單細(xì)胞克隆中生產(chǎn)并純化出抗體，包括1個(gè)大鼠IgM，7個(gè)小鼠IgG雜交瘤。這些純化的抗體進(jìn)一步用人PD-1蛋白結(jié)合試驗(yàn)，細(xì)胞表面PD-1蛋白結(jié)合試驗(yàn)，以及阻斷PD-L1結(jié)合試驗(yàn)進(jìn)行確證。我們對這些確證的雜交瘤細(xì)胞抗體可變區(qū)進(jìn)行測序。從冷凍的雜交瘤細(xì)胞中抽提總RNA，用特異性引物或通用引物用SuperScriptIII第一鏈合成系統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。抗體的VH和VL片段按照RACEofGenScript的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的抗體片段按標(biāo)準(zhǔn)克隆方法分別被克隆進(jìn)標(biāo)準(zhǔn)克隆載體中。用PCR方法鑒定克隆是否插入了正確長度的片段。挑選出5個(gè)含有正確VH和VL插入片段長度的單克隆進(jìn)一步進(jìn)行測序鑒定。測序結(jié)果表明5個(gè)不同克隆的VH和VL基因幾乎完全相同。一致的序列說明應(yīng)該是雜交瘤細(xì)胞所產(chǎn)生的抗體序列。我們合成了編碼抗PD-1抗體可變區(qū)的cDNA序列與包含S228P鉸鏈(EUnumbering；Kabatnumbering241)穩(wěn)定突變的(Angalet.,Mol.Immunol30:105,1993)人IgG4重鏈恒定區(qū)組成嵌合體，及與人的kappa輕鏈恒定區(qū)組成嵌合體，在HEK293細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)表達(dá)。這些嵌合性抗體用proteinA親和層析方法純化，純化的抗體對PBS透析平衡后，檢測內(nèi)毒素<EU/mg)，單體含量>95％。我們檢測了這些嵌合性抗體對體外活化人T細(xì)胞功能的作用。密度梯度法分離近期免疫過破傷風(fēng)疫苗的人PBMC，重懸于10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。調(diào)整細(xì)胞密度1*10^6/ml，200ul/孔鋪于96孔板內(nèi)。加入梯度稀釋的待測抗體(終濃度為0、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30ug/ml)孵育30min。加入1ug/ml破傷風(fēng)抗原(AstarteBiologics,cat#1002)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。7天后收集上清，ELISA(eBioscience,88-7316-88)檢測IFNg的濃度。陽性對照抗體為購自eBioscience的抗人PD-L1抗體(eBioscience#16-5983)。SHB-617(rat/humanIgG4/kappa)嵌合體誘導(dǎo)活化T細(xì)胞表達(dá)最高的IFNg(圖1)。SHB-617衍生自大鼠IgM。SHB-617的活性表示，其結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有阻斷PD-1功能獨(dú)特的活性。實(shí)施例2：先導(dǎo)抗PD-1抗體的人源化如本文所述和人源化抗體如此得到進(jìn)一步表征SHB-617是人源化的。我們分析了抗體SHB-617嵌合性抗體的氨基酸序列并參照了最新的ChothiaCDR定義(Al-Lazikanietal,1997)?？勺儏^(qū)的CDR部分(L1,L2,L3,H1,H2和H3)如圖2,3所示。除非特別指明按Chothia1987編號，位置是按順序標(biāo)記。SHB-617可變區(qū)與人胚系序列的對比。依照整體序列的一致性、配對部分位置以及相似的CDR規(guī)范位置，一個(gè)最符合受體框架的胚系輕鏈和重鏈家族序列被鑒定出來，輕鏈的VK1-L1和重鏈的VH2-2-70。將J-片段基因上的FR4與父本序列進(jìn)行對比，選擇JK4和JH4分別作為輕鏈和重鏈。父本序列在受體框架上的排列如圖2,3所示。人源化SHB-617由CDR嫁接法將其連接到人的框架內(nèi)，構(gòu)建好父本的結(jié)構(gòu)模型以及人源化序列。注意位于FR2區(qū)域(Cys35)和CDRH2區(qū)域(Cys54)的兩個(gè)半胱氨酸殘基。在許多鼠源胚系序列中半胱氨酸殘基常存在于這些位置，并可能形成二硫鍵以穩(wěn)定VH區(qū)。另外的重鏈間氨基酸H:Cys35和H:Cys54二硫鍵被構(gòu)建用于建模。FR2上的H:Cys35殘基被保留于人源化序列中。另外，由于這個(gè)位點(diǎn)構(gòu)象的緣故，將胚系FR3上的H:Asn67殘基替換成蘇氨酸并不合適，因此，我們將其替換成絲氨酸，使其更適合局部構(gòu)象。輕鏈框架并沒有做回復(fù)突變。人源化以及父本的輕重鏈可變區(qū)排列如圖4、5所示。從HEK293細(xì)胞或CHO細(xì)胞中表達(dá)并純化人源化抗體SSI-361含人源化的SHB-617可變區(qū)和人IgG4/卡帕(含鉸鏈S228P(EU編號；Kabat編號241)人IgG4構(gòu)建的穩(wěn)定突變(Angalet.,Mol.Immunol30:105,1993)和人κ輕鏈恒定區(qū)域。實(shí)施例3：抗PD-1人源化抗體的評估用Biacore測定結(jié)合PD-1抗原親和常數(shù)CM5sensorchip流室(GEHealthcareLifeSciences)用新鮮50mmol/LNHS和200mmol/LEDC激活360秒(10μL/分鐘)，注入溶于10mmol/LNaAC(pH5.0)的抗HisIgG于活化的流室上(10μL/分鐘)300秒，HBS-EP+(10mMHEPES,150mMNaCl,3mMEDTAand0.05％P20,pH7.4)為運(yùn)行緩沖液。未結(jié)合的活化位點(diǎn)用1mol/L乙醇胺(10μL/分鐘)阻斷420秒。在2個(gè)流室上分別重復(fù)該過程2次以固定蛋白。維持低流速過夜以平衡固定的蛋白。人的PD1用流細(xì)胞2捕獲(10μL/分鐘)后，將梯度稀釋的SSI-361(3.125nM,6.25nM,12.5nM,25nMand50nM)注于抗原結(jié)合的流室上(30ul/分鐘，180秒)，注入雙份單濃度抗原以解離600秒。沒有結(jié)合抗原的流細(xì)胞1作為對照流室。為去除流室表面結(jié)合的抗體和抗原，注入10mMpH1.5的鹽酸甘氨酸60秒(10μL/分鐘,流室1-2)。每個(gè)濃度的待測抗體都重復(fù)以上步驟。親和常數(shù)(表1)用BiacoreX100評估軟件2.0的1:1相互作用模型計(jì)算得出。數(shù)據(jù)均減去作為本底水平的流細(xì)胞1數(shù)值。表1.Biacore分析SSI-361的結(jié)合動(dòng)力學(xué)抗原ka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)人PD12.296E+51.165E-35.072E-9ka：締合常數(shù)；kd：解離常數(shù)；KD：親和常數(shù)。PD-1結(jié)合ELISA用PBS緩沖液將待檢測的抗PD-1抗體稀釋至1ug/ml，100ul/孔體積加至高吸附的ELISA板內(nèi)(Costar,Cat#3590,highbinding)，4℃放置過夜。將96孔板中PBS緩沖液拍掉，加入200ul/孔封閉液(eBioscience,5*ELISA/ELISPOTDiluent,Cat#00-4202-55)，室溫孵育1h進(jìn)行封閉。拍去封閉液，用PBST緩沖液洗板3次后，加入100ul/孔用封閉液梯度稀釋(0,0.001,0.01,0.1,1,10ug/ml)的his-tagged人PD-1protein(SinoBiologicalInc.Cat#10377-H08H-100)，或his-taggedrhesusmonkeyPD-1-His(SinoBiologicalInc.Cat#90305-K08H-100)，置室溫孵育1h。用PBST緩沖液洗板4次后，加入100ul/孔用封閉液1:2000稀釋的anti-His-HRP(GenscriptCat#A00612)，置室溫孵育1h。用PBST緩沖液洗板4次后，加入100ul底物TMB，室溫孵育約15min，加入50ul/孔1MH2S04終止反應(yīng)。用FlexStation3酶標(biāo)儀450nm處讀取吸收值，用Graphpad5.0,"log(agonist)vs.response--Variableslope"計(jì)算SSI-661ELISA結(jié)合EC50值為0.33nM(人PD-1)and0.39nM(猴PD-1)，見圖6A&B。用PBS緩沖液將食蟹猴PD1-Fctag(SinoBiologicalInc.Cat#90311-C02H)稀釋至2ug/ml，100ul/孔體積加至高吸附的ELISA板內(nèi)(Costar,Cat#3590,highbinding)，4℃放置過夜。將96孔板中PBS緩沖液拍掉，加入200ul/孔封閉液，室溫孵育1h進(jìn)行封閉。拍去封閉液，用PBST緩沖液洗板3次后，加入100ul/孔用封閉液梯度稀釋的待測抗PD-1抗體(0,0.001,0.01,0.1,1,10ug/ml)，置室溫孵育1h。用PBST緩沖液洗板3次后，加入100ul/孔用封閉液1:4000稀釋的anti-HuIgG-HRP(goat-anti-humanIgkappa-HRP,Millipore,Cat#AP502P)，置室溫孵育1h。用PBST緩沖液洗板4次后，加入100ul底物TMB，室溫孵育約15min，加入50ul/孔1MH2S04終止反應(yīng)。用FlexStation3酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸收值，計(jì)算SSI-661與食蟹猴PD-1ELISA結(jié)合EC50值為0.08nM(圖6C)。PD-1結(jié)合FACS將高表達(dá)人PD-1的CHO細(xì)胞以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，收集沉淀并用預(yù)冷的流式緩沖液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)整為5*10^6/ml，每個(gè)反應(yīng)分裝100ul。每個(gè)反應(yīng)加入50ul3*梯度稀釋的待測抗PD-1抗體(0,0.01,0.1,1,10ug/ml)，混勻候4℃避光孵育60分鐘。加入1ml流式緩沖液(3％BSAinPBS)，洗2次。加入100ul二抗(20ul/testPEMouseAnti-HumanIgGinstainingbuffer.BD,Cat#555787)。將細(xì)胞重懸，4℃避光孵育60分鐘。用流式緩沖液洗兩次細(xì)胞，并用2％的多聚甲醛重懸細(xì)胞進(jìn)行固定，進(jìn)行流式檢測(BD,FACScalibur)。如圖7 所示,SSI-361at1μg/mL(～6.7nM)飽和了CHO細(xì)胞PD-1結(jié)合.阻斷PD-1和PD-L1/2結(jié)合將高表達(dá)PD-1的CHO細(xì)胞以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，收集沉淀并用預(yù)冷的流式緩沖液重懸，細(xì)胞計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度調(diào)整為5*10^6/ml，每個(gè)反應(yīng)分裝100ul。每個(gè)反應(yīng)加入50ul4x梯度稀釋的待測抗PD-1抗體at1ug/ml，以及50ul4xPD-L1(HumanPD-L1(HisTag)(SinoBiologicalInc.Cat#10084-H08H-100)，終濃度為2ug/ml)或50ul4xPD-L2(HumanPD-L2(HisTag)(SinoBiologicalInc.Cat#10292-H08H-100)，終濃度為1ug/ml)。混勻后4℃避光孵育4h。加入1ml流式緩沖液，洗2次。加入100ul2ug/mlanti-HisTagAntibody[iFluor488](GenScript,Cat#A01800-100))。將細(xì)胞重懸，4℃避光孵育60分鐘。用流式緩沖液洗兩次細(xì)胞，并用2％的多聚甲醛重懸細(xì)胞進(jìn)行固定，進(jìn)行流式檢測。SSI-361有效阻斷了PD-1和PD-L1/2結(jié)合(圖8)。T細(xì)胞功能密度梯度法分離近期免疫過破傷風(fēng)疫苗的人PBMC，重懸于10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基。調(diào)整細(xì)胞密度1*10^6/ml，200ul/孔鋪于96孔板內(nèi)。加入稀釋的待測抗體(終濃度為3ug/ml)孵育30min。加入1ug/ml破傷風(fēng)抗原(AstarteBiologics,cat#1002)，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7天。7天后收集上清，ELISA(eBioscience,88-7316-88)檢測IFNg的濃度。SSI-361增強(qiáng)了破傷風(fēng)抗原誘導(dǎo)IFNg產(chǎn)生(圖9A)。我們也用混合人淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)測量SSI-361活性。密度梯度法分離人PBMC新鮮人PBMC，重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞密度為2*10^6/ml，每孔2ml接種于6孔板，37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中放置1.5小時(shí)，將懸浮細(xì)胞吸走，向貼壁細(xì)胞中加入2ml含有50ng/mlGM-CSF(粒細(xì)胞集落剌激生長因子)和35ng/mlIL-4(Peprotech,AF-HDC)的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)7天。每2天換一次含細(xì)胞因子的新鮮培液。第7天加1ug/mlLPS刺激，繼續(xù)培養(yǎng)1天得到成熟樹突細(xì)胞。再用10ug/ml絲裂霉素(Sigma,M0503-2MG)處理1.5h后，徹底清洗去掉殘余絲裂霉素。用EasySepTMHumanTCellIsolationKit(Stemcell,Cat#17951)分離人T細(xì)胞.PBMC用EasySepTM緩沖液稀釋成5*10^7/ml，加入IsolationCocktail抗體50ul/ml細(xì)胞，混勻后室溫靜置5分鐘。再加入RapidSpheres磁珠50ul/ml，混勻后室溫靜置5分鐘。加入EasySepTM緩沖液至5ml體積，將管子置于EASYSEPTMMAGNETS磁鐵中，靜置5分鐘。倒出緩沖液至新的離心管，里面含有所需T細(xì)胞，非T細(xì)胞將留在管壁內(nèi)。將上述樹突細(xì)胞及同種異體的T細(xì)胞分別離心重懸成濃度為1*10^6/ml和1*10^5/ml，于96孔板中每孔各加入100ul，抗體用培液按一定倍數(shù)稀釋成終濃 度為3ug/ml,加入96孔板細(xì)胞中,37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天，收上清用ELISA(eBioscience,88-7316-88or88-7025-88)檢測IFNg的水平。SSI-361增強(qiáng)了MLR誘導(dǎo)IFNg產(chǎn)生(圖9B).在食蟹猴藥物動(dòng)力學(xué)(PK)將待檢測抗PD-1抗體SSI-361用PBS稀釋按5mg/kg劑量尾靜脈注射4只雄性食蟹猴，體重大約3kg。于0,5,30min,1,2,4,8hr,1,3,5,8,11,15,22,29and36天(16個(gè)時(shí)間點(diǎn))經(jīng)外周靜脈穿刺的取血。分離血清后凍存于-80℃。ELISA檢測血清中抗體濃度。用PBS緩沖液將重組人PD-1蛋白(SinoBiologicalInc.Cat#10377-H08H-100)稀釋至2ug/ml，100ul/孔體積加至高吸附的ELISA板內(nèi)(Costar,Cat#3590,highbinding)，4℃放置過夜。將96孔板中PBS緩沖液拍掉，加入200ul/孔封閉液，室溫孵育1h進(jìn)行封閉。拍去封閉液，用PBST緩沖液洗板3次后，加入100ul/孔用封閉液稀釋的待測血清orSSI-361standards，置室溫孵育1h。用PBST緩沖液洗板3次后，加入100ul/孔用封閉液1:4000稀釋的anti-HuIgG-HRP(goat-anti-humanIgkappa-HRP,Millipore,Cat#AP502P)，置室溫孵育1h。用PBST緩沖液洗板4次后，加入100ul底物TMB，室溫孵育約15min，加入50ul/孔1MH2S04終止反應(yīng)。用FlexStation3酶標(biāo)儀在450nm處讀取吸收值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算試樣中的SSI-661濃度，并示于圖10。PK參數(shù)如表2所示。表2。SSI-361在食蟹猴中單次靜脈注射藥物動(dòng)力學(xué).藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。其他實(shí)施所有在本說明書中公開的所有特征可以任何組合進(jìn)行組合。在本說明書中公開的每個(gè)特征可被用于相同，等效或類似目的的替代特征所代替。因此，除非明確聲明，否則公開的每個(gè)特征僅是一系列的等效或類似特征的一個(gè)例子。從上面的描述，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以容易地確定本發(fā)明的基本特征，在不脫離其精神和范圍的前提下，可以進(jìn)行各種改變，并且本發(fā)明的修改，以使其適應(yīng)各種用途和條件。因此，其它實(shí)施方案也在權(quán)利要求書內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3