本發(fā)明涉及制備乳酸鏈球菌素的方法。

背景技術(shù)：

乳酸鏈球菌素(Nisin)亦稱乳酸鏈球菌肽或音譯為尼辛，是乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì)，由34個氨基酸殘基組成。由于乳酸鏈球菌素可抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細菌，并對芽孢桿菌的孢子有強烈的抑制作用，因此被作為食品防腐劑廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。食用后在人體的生理pH條件和α—胰凝乳蛋白酶作用下很快水解成氨基酸，不會改變?nèi)梭w腸道內(nèi)正常菌群以及產(chǎn)生如其它抗菌素所出現(xiàn)的抗性問題，更不會與其它抗菌素出現(xiàn)交叉抗性，是一種高效、無毒、安全、無副作用的天然食品防腐劑。

目前Nisin產(chǎn)品的生產(chǎn)是通過乳酸菌進行發(fā)酵得到的，然而由于成熟的Nisin能夠破壞細菌的細胞膜，導(dǎo)致細胞破裂，從而導(dǎo)致目前利用微生物全合成Nisin的工藝產(chǎn)量偏低。并且，雖然在Nisin生產(chǎn)菌種體內(nèi)存在其免疫機制，即NisEFG和NisI蛋白能夠保護細菌本身，但是這種免疫機制是有限的，無法改變微生物全合成Nisin工藝產(chǎn)量偏低的現(xiàn)狀。

因而，目前的乳酸鏈球菌素制備工藝仍有待改進。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種適合大規(guī)模培養(yǎng)，能夠打破原有的細胞壓力，得到產(chǎn)品產(chǎn)量和純度高的Nisin生產(chǎn)方式。

本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

目前的微生物全合成Nisin工藝，微生物體內(nèi)的合成途徑如下：由nisA/Z基因(或別的基因，如nisQ、nisF、nisU等)編碼前體肽(Nisin precursor)，該前體肽再由nisB和nisC基因編碼的NisB和NisC蛋白對前體肽進行修飾，其中NisB作用為對特定的絲氨酸和蘇氨酸進行脫水，而NisC作用為形成羊毛硫環(huán)，再由nisP基因產(chǎn)物NisP蛋白對修飾后的蛋白進行切割，最后形成成熟的NisinA/NisinZ產(chǎn)物。

發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在微生物體內(nèi)大量表達半成熟的Nisin前體肽，然后將這些未成熟的前體肽在體外利用nisP蛋白或者其他能識別nisP切割位點的蛋白進行酶解，即可得到大量有活性的成熟Nisin，并且在微生物體內(nèi)所得到的蛋白(即半成熟的Nisin前體肽)沒有生物活性，不會引起細胞的破裂，可以突破通過微生物全合成Nisin的瓶頸。這種生產(chǎn)方式更適合于大規(guī)模培養(yǎng)，能夠打破原有的細胞壓力，得到的產(chǎn)品不僅產(chǎn)量高、純度也更純，是一種全新的 Nisin生產(chǎn)方式。

因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種制備乳酸鏈球菌素的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法包括以下步驟：利用微生物表達獲得乳酸鏈球菌素前體肽；利用NisB蛋白和NisC蛋白將所述乳酸鏈球菌素前體肽進行修飾，以便獲得經(jīng)過修飾的乳酸鏈球菌素前體肽；以及利用能夠識別NisP切割位點的蛋白對所述經(jīng)過修飾的乳酸鏈球菌素前體肽進行體外酶解，以便獲得乳酸鏈球菌素，其中，所述NisB蛋白具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述NisC蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)，利用本發(fā)明的制備乳酸鏈球菌素的方法，在微生物體內(nèi)大量表達半成熟的Nisin前體肽，然后利用能夠識別NisP切割位點的蛋白對半成熟的Nisin前體肽進行體外酶解，即可得到大量有活性的成熟Nisin，并且在微生物體內(nèi)所得到的蛋白(即半成熟的Nisin前體肽)沒有生物活性，不會引起細胞的破裂，可以突破通過微生物全合成Nisin的瓶頸。并且，根據(jù)本發(fā)明的實施例，本發(fā)明的方法能夠打破現(xiàn)有微生物全合成Nisin工藝的細胞壓力，得到的產(chǎn)品不僅產(chǎn)量高、純度也更純，是一種全新的Nisin生產(chǎn)方式，并且適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

其中，NisB蛋白的序列如下所示：

MIKSSFKAQPFLVRNTILSPNDKRSFTEYTQVIETVSKNKVFLEQLLLANPKLYDVMQKYNAGLLKKKRVKKLFESIYKYYKRSYLRSTPFGLFSETSIGVFSKSSQYKLMGKTTKGIRLDTQWLIRLVHKMEVDFSKKLSFTRNNANYKFGDRVFQVYTINSSELEEVNIKYTNVYQIISEFCENDYQKYEDICETVTLCYGDEYRELSEQYLGSLIVNHYLISNLQKDLLSDFSWNTFLTKVEAIDEDKKYIIPLKKVQKFIQEYSEIEIGEGIEKLKEIYQEMSQILENDNYIQIDLISDSEINFDVKQKQQLEHLAEFIGNTTKSVRRTYLDDYKDKFIEKYGVDQEVQITELFDSTFGIGAPYNYNHPRNDFYESEPSTLYYSEEEREKYLSMYVEAVKNHNVINLDDLESHYQKMDLEKKSELQGLELFLNLAKEYEKDIFILGDIVGNNNLGGASGRFSALSPELTSYHRTIVDSVERENENKEITSCEIVFLPENIRHANVMHTSIMRRKVLPFFTSTSHNEVLLTNIYIGIDEKEKFYARDISTQEVLKFYITSMYNKTLFSNELRFLYEISLDDKFGNLPWELIYRDFDYIPRLVFDEIVISPAKWKIWGRDVNSKITIRELIQSKEIPKEFYIVNGDNKVYLSQENPLDMEILESAIKKSSKRKDFIELQEYFEDENIINKGQKGRVADVVVPFIRTRALGNEGRAFIREKRVSVERREKLPFNEWLYLKLYISINRQNEFLLSYLPDIQKIVANLGGNLFFLRYTDPKPHIRLRIKCSDLFLAYGSILEILKRSRKNRIMSTFDISIYDQEVERYGGFDTLELSEAIFCADSKIIPNLLTLIKDTNNDWKVDDVSILVNYLYLKCFFQNDNKKILNFLNLVSPKKVKENVNEKIEHYLKLLKVNNLGDQIFYDKNFKELKHAIKNLFLKMIAQDFELQKVYSIIDSIIHVHNNRLIGIERDKEKLIYYTLQRLFVSEEYMK(SEQ ID NO：1)，

NisC蛋白的序列如下所示：

MNKKNIKRNVEKIIAQWDERTRKNKENFDFGELTLSTGLPGIILMLAELKNKDNSKIYQKKIDNYIEYIVSKLSTYGLLTGSLYSGAAGIALSILHLREDDEKYKNLLDSLNRYIEYFVREKIEGFNLENITPPDYDVIEGLSGILSYLLLINDEQYDDLKILIINFLSNLTKENKGLISLYIKS ENQMSQSESEMYPLGCLNMGLAHGLAGVGCILAYAHIKGYSNEASLSALQKIIFIYEKFELERKKQFLWKDGLVADELKKEKVIREASFIRDAWCYGGPGISLLYLYGGLALDNDYFVDKAEKILESAMQRKLGIDSYMICHGYSGLIEICSLFKRLLNTKKFDSYMEEFNVNSEQILEEYGDESGTGFLEGISGCILVLSKFEYSINFTYWRQALLLFDDFLKGGKRK(SEQ ID NO：2)。

另外，根據(jù)本發(fā)明上述實施例的制備乳酸鏈球菌素的方法還可以具有如下附加的技術(shù)特征：

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述乳酸鏈球菌素前體肽為選自NisA蛋白、NisZ蛋白、NisQ蛋白、NisF蛋白、NisU蛋白和NisU2蛋白的至少之一，其中，所述NisA蛋白具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述NisZ蛋白具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列，所述NisQ蛋白具有SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列，所述NisF蛋白具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列，所述NisU蛋白具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列，所述NisU2蛋白具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。由此，使微生物表達NisA蛋白、NisZ蛋白、NisQ蛋白、NisF蛋白、NisU蛋白和NisU2蛋白的至少之一，均能夠有效獲得乳酸鏈球菌素前體肽。

具體地，NisA蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCNCSIHVSK(SEQ ID NO：3)，

NisZ蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCNCSIHVSK(SEQ ID NO：4)，

NisQ蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKTDSGASTRITSISLCTPGCKTGVLMGCNLKTATCNCSVHVSK(SEQ ID NO：5)，

NisF蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCNCSVHVSK(SEQ ID NO：6)，

NisU蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSKSLCTPGCKTGILTGCPLKTATCGCHFG(SEQ ID NO：7)，

NisU2蛋白的序列如下所示：

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRVTSKSLCTPGCKTGILTGCPLKTATCGCHFG(SEQ ID NO：8)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述NisA蛋白由SEQ ID NO：12所示的核酸序列編碼，所述NisZ蛋白由SEQ ID NO：13所示的核酸序列編碼，所述NisQ蛋白由SEQ ID NO：14所示的核酸序列編碼，所述NisF蛋白由SEQ ID NO：15所示的核酸序列編碼，所述NisU蛋白由SEQ ID NO：16所示的核酸序列編碼，所述NisU2蛋白由SEQ ID NO：17所示的核酸序列編碼。由此，蛋白表達效率高，從而能夠高效地獲得各種乳酸鏈球菌素前體肽。

具體地，NisA蛋白的編碼基因為nisA基因，其序列如下所示：

atgagtacaaaagattttaacttggatttggtatctgtttcgaagaaagattcaggtgcatcaccacgcattacaagtatttcgctatgtacacccggttgtaaaacaggagctctgatgggttgtaacatgaaaacagcaacttgtaattgtagtattcacgtaagcaaataa(SEQ ID NO：12)，

NisZ蛋白的編碼基因為nisZ基因，其序列如下所示：

ATGAGTACAAAAGATTTTAACTTGGATTTGGTATCTGTTTCGAAGAAAGATTCAGGTGCATCACCACGCATTACAAGTATTTCGCTATGTACACCCGGTTGTAAAACAGGAGCTCTGATGGGTTGTAACATGAAAACAGCAACTTGTAATTGTAGTATTCACGTAAGCAAATAA(SEQ ID NO：13)，

NisQ蛋白的編碼基因為nisQ基因，其序列如下所示：

ATGAGCACCAAGGACTTCAACCTGGATCTGGTGAGCGTTAGCAAAACCGACAGCGGCGCGAGCACCCGTATCACCAGCATTAGCCTGTGCACCCCGGGTTGCAAGACCGGCGTGCTGATGGGTTGCAACCTGAAAACCGCGACCTGCAACTGCAGCGTGCACGTTAGCAAGTAA(SEQ ID NO：14)，

NisF蛋白的編碼基因為nisF基因，其序列如下所示：

ATGAGCACCAAGGACTTCAACCTGGATCTGGTGAGCGTTAGCAAGAAAGACAGCGGTGCGAGCCCGCGTATCACCAGCATTAGCCTGTGCACCCCGGGTTGCAAGACCGGCGCGCTGATGGGTTGCAACATGAAAACCGCGACCTGCAACTGCAGCGTGCACGTTAGCAAATAA(SEQ ID NO：15)，

NisU蛋白的編碼基因為nisU基因，其序列如下所示：

ATGAGCACCAAGGACTTCAACCTGGATCTGGTGAGCGTTAGCAAGAAAGACAGCGGTGCGAGCCCGCGTATCACCAGCAAGAGCCTGTGCACCCCGGGTTGCAAAACCGGCATTCTGACCGGTTGCCCGCTGAAAACCGCGACCTGCGGTTGCCACTTTGGTTAA(SEQ ID NO：16)，

NisU2蛋白的編碼基因為nisU2基因，其序列如下所示：

ATGAGCACCAAGGACTTCAACCTGGATCTGGTGAGCGTTAGCAAGAAAGACAGCGGTGCGAGCCCGCGTGTGACCAGCAAGAGCCTGTGCACCCCGGGTTGCAAAACCGGCATCCTGACCGGTTGCCCGCTGAAAACCGCGACCTGCGGTTGCCACTTTGGTTAA(SEQID NO：17)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述NisB蛋白由SEQ ID NO：10所示的核酸序列編碼。也即，NisB蛋白的編碼基因為nisB基因其序列如下所示：

atgataaaaagttcatttaaagctcaaccgtttttagtaagaaatacaattttatctccaaacgataaacggagttttactgaatatactcaagtcattgagactgtaagtaaaaataaagtttttttggaacagttactactagctaatcctaaactctatgatgttatgcagaaatataatgctggtctgttaaagaagaaaagggttaaaaaattatttgaatctatttacaagtattataagagaagttatttacgatcaactccatttggattatttagtgaaacttcaattggtgttttttcgaaaagttcacagtacaagttaatgggaaagactacaaagggtataagattggatactcagtggttgattcgcctagttcataaaatggaagtagatttctcaaaaaagttatcatttactagaaataatgcaaattataagtttggagatcgagtttttcaagtttataccataaatagtagt gagcttgaagaagtaaatattaaatatacgaatgtttatcaaattatttctgaattttgtgagaatgactatcaaaaatatgaagatatttgtgaaactgtaacgctttgctatggagacgaatatagagaactatcggaacaatatcttggcagtctgatagttaatcattatttgatctctaatttacaaaaagatttgttgtcagatttttcttggaacacttttttgactaaagttgaagcaatagatgaagataaaaaatatataattcctctgaaaaaagttcaaaagtttattcaagaatactcagaaatagaaattggtgaaggtattgagaaactgaaagaaatatatcaggaaatgtcacaaattcttgagaatgataattatattcaaattgatttaattagtgatagtgaaataaattttgatgttaaacaaaagcaacaattagaacatttagctgagtttataggaaatacgacaaaatctgtaagaagaacatatttggatgactataaggataaatttatcgaaaaatatggtgtagatcaagaagtacaaataacagaattatttgattctacatttggcataggagctccatataattataatcatcctcgaaatgacttttatgagtccgaaccgagtactctatactattcagaagaggagagagaaaagtacctcagcatgtatgtagaagccgttaaaaatcataatgtaattaatcttgacgacttagagtctcattatcaaaaaatggacttagaaaagaaaagtgaacttcaagggttagaattatttttgaatttggcaaaggagtatgaaaaagatatttttattttaggggatatcgttggaaataataatttgggaggggcatcaggtagattttctgcactctctccggagttaacaagttatcatagaacgatagtagattctgtcgaaagagaaaatgagaataaagaaattacatcgtgtgaaatagtatttcttccagaaaatatcagacatgctaacgttatgcatacatcaattatgaggaggaaagtacttccattttttacaagtacaagtcacaatgaagttctgttaactaatatctatattggaatagacgaaaaagaaaaattttatgcacgagacatttcaactcaagaggtattgaaattctacattacaagcatgtacaataaaacgttattcagtaatgagctaagatttctttacgaaatttcattagatgacaagtttggtaatttaccttgggaacttatttacagagactttgattatattccacgtttagtatttgacgaaatagtaatatctcctgctaaatggaaaatttggggaagggatgtaaatagtaagattacaataagagaacttattcaaagcaaagaaattcccaaagagttttatattgtcaatggagataataaagtttatttatcacaggaaaacccattggatatggaaattttagagtcggcgataaagaagagctcaaaaagaaaagattttatagagctacaagaatattttgaagatgaaaatatcataaataaaggacaaaaggggagagttgccgatgttgtagtgccttttattagaacgagagcattaggtaatgaagggagagcatttataagagagaaaagagtttcggttgaacggcgtgaaaaattgccctttaacgagtggctttatctcaagttgtacatttctataaatcgtcaaaatgaatttttactgtcgtatcttccagatattcagaaaatagtagcaaacctgggtggaaatctattcttcctaagatatactgatcctaaaccacatattagattgcgtataaaatgttcagatttatttttagcttacggatctattcttgaaatcttaaaaaggagtcggaaaaataggataatgtcaacttttgatatttctatttatgatcaagaagtagaaagatatggtggatttgatactttagagttatccgaagcaatattttgtgccgattctaaaattattccaaatttgcttacattgataaaagatactaataatgattggaaagtcgatgatgtatcaatcttggtgaattatttatatctgaaatgcttctttcagaatgataacaaaaagattcttaattttttgaatttagttagtcctaaaaaggttaaagaaaatgtcaatgaaaagattgaacattatcttaagcttctgaaagttaataatctaggtgaccaaattttttatgacaagaattttaaagaattaaagcatgccataaaaaatttatttttaaaaatgatagctcaagattttgaacttcagaaagtttattcaattattgacagtatcattcatgtccataataaccgactaattggtattgaacgagataaagagaaattaatttattacacacttcaaaggttgtttgtttcggaagaatacatgaaatga(SEQ ID NO：10)。

由此，能夠高效地表達NisB蛋白，并且利用該NisB蛋白能夠有效將所述乳酸鏈球菌素前體肽的特定絲氨酸和蘇氨酸進行脫水，完成第一步修飾。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述NisC蛋白由SEQ ID NO：11所示的核酸序列編碼。也即，NisC蛋白的編碼基因為nisC基因，其序列如下所示：

atgaataaaaaaaatataaaaagaaatgttgaaaaaattattgctcaatgggatgagagaactagaaaaaataaagaaaacttcgatttcggagagttgactctctctacaggattgcctggtataattttaatgttagcggagttaaaaaataaagataactcaaagatatatcagaaaaagatagacaattatattgaatatattgttagcaaactttcaacatatgggcttttaacaggatcactttattcgggagcagctggcattgcattaagtatcctacatttacgagaagatgacgaaaaatataagaatcttcttgatagcctaaatagatatatcgaatatttcgtcagagaaaaaattgaaggatttaatttggaaaacattactcctcctgattatgacgtgattgaaggtttatctgggatactttcctatctattattaatcaacgacgagcaatatgatgatttgaaaatactcattatcaattttttatcaaatctgactaaagaaaacaaaggactaatatcgctttacatcaaatcggagaatcagatgtctcaatcagaaa gtgagatgtatccactaggctgtttgaatatgggattagcacatggacttgctggagtgggctgtatcttagcttatgcccacataaaaggatatagtaatgaagcctcgttgtcagctttgcaaaaaattatttttatttatgaaaagtttgaacttgaaaggaaaaaacagtttctatggaaagatggacttgtagcagatgaattaaaaaaagagaaagtaattagggaagcaagtttcattagagatgcatggtgctatggaggtccaggtattagtctgctatacttatacggaggattagcactggataatgactattttgtagataaagcagaaaaaatattagagtcagctatgcaaaggaaacttggtattgattcatatatgatttgccatggctattctggtttaatagaaatttgttctttatttaagcggctattaaatacaaaaaagtttgattcatacatggaagaatttaatgttaatagtgagcaaattcttgaagaatacggagatgaaagtggcacgggttttcttgaaggaataagtggctgtatactggtattatcgaaatttgaatattcaatcaattttacttattggagacaagcactgttactttttgacgattttttgaaaggagggaagaggaaatga(SEQ ID NO：11)。

由此，能夠高效地獲得NisC蛋白，且利用該NisC蛋白能夠有效使經(jīng)過NisB修飾的乳酸鏈球菌素前體肽形成羊毛硫環(huán)，完成第二步修飾。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用NisB蛋白和NisC蛋白將所述乳酸鏈球菌素前體肽進行修飾，是通過選自下列方式的至少一種實現(xiàn)的：

(1)使所述微生物同時表達所述乳酸鏈球菌素前體肽、NisB蛋白和NisC蛋白，以便在所述微生物體內(nèi)完成對所述乳酸鏈球菌素前體肽的修飾，獲得經(jīng)過修飾的乳酸鏈球菌素前體肽；

(2)使所述微生物同時表達所述乳酸鏈球菌素前體肽以及NisB蛋白和NisC蛋白中的其中一種，然后將NisB蛋白和NisC蛋白中的另一種與表達產(chǎn)物進行體外混合，以便獲得經(jīng)過修飾的乳酸鏈球菌素前體肽；

(3)將所述NisB蛋白、所述NisC蛋白與所述乳酸鏈球菌素前體肽進行體外混合，以便獲得經(jīng)過修飾的乳酸鏈球菌素前體肽。

由此，通過上述多種方式均能夠?qū)崿F(xiàn)對所述乳酸鏈球菌素前體肽的修飾。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述體外酶解是通過將能夠識別NisP切割位點的蛋白與所述經(jīng)過修飾的乳酸鏈球菌素前體肽進行體外混合實現(xiàn)的。由此，不會損傷微生物細胞，且方便快捷，還能有效降低生產(chǎn)成本。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述能夠識別NisP切割位點的蛋白為NisP蛋白，所述NisP蛋白具有SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。具體地，NisP蛋白的序列如下所示：

VKKILGFLFIVCSLGLSATVHGETTNSQQLLSNNINTELINHNSNAILSSTEGSTTDSINLGAQSPAVKSTTRTELDVTGAAKTLLQTSAVQKEMKVSLQETQVSSEFSKRDSVTNKEAVPVSKDELLEQSEVVVSTSSIQKNKILDNKKNRANFVTSSQLIKEKPSNSKDASGVIDNSASPLSYRKAKEVVSLRQPLKNQKVEAQPLLISNSSEKKASVYTNSHDFWDYQWDMKYVTNNGESYALYQPSKKISVGIIDSGIMEEHPDLSNSLGNYFKNLVPKGGFDNEEPDETGNPSDIVDKMGHGTEVAGQITANGNILGVAPGITVNIYRVFGENLSKSEWVARAIRRAADDGNKVINISAGQYLMISGSYDDGTNDYQEYLNYKSAINYATAKGSIVVAALGNDSLNIQDNQTMINFLKRFRSIKVPGKVVDAPSVFEDVIAVGGIDGYGNISDFSNIGADAIYAPAGTTANFKKYGQDKFVSQGYYLKDWLFTTTNTGWYQYVYGNSFATPKVSGALALVVDKYGIKNPNQLKRFLLMNSPEVNGNRVLNIVDLLNGKNKAFSLDTDKGQDDAINHKSMENLKESRDTMKQEQDKEIQRNTNNNFSIKNDFHNISKEVISVDYNINQKMANNRNSRGTVSVRSQEILPVTGDGEDFLRAL GIVCISILGILKRKTKN(SEQ ID NO：9)。由此，能夠高效地實現(xiàn)對經(jīng)過修飾的乳酸鏈球菌素前體肽的體外酶解，有效獲得乳酸鏈球菌素。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述NisP蛋白由SEQ ID NO：18所示的核酸序列編碼。具體地，NisP蛋白的編碼基因為NisP基因，其序列如下所示：

gtgaaaaaaatactaggtttcctttttatcgtttgttcgttgggtttatcagcaactgtgcatggggagacaacaaattcacaacagttactctcaaataatattaatacggaattaattaatcataattctaatgcaattttatcttcaacagagggatcaacgactgattcgattaatctaggggcgcagtcacctgcagtaaaatcgacaacaaggactgaattggatgtaactggtgctgctaaaactttattacagacatcagctgttcaaaaagaaatgaaagtttcgttgcaagaaactcaagttagttctgaattcagtaagagagatagcgttacaaataaagaagcagttccagtatctaaggatgagctacttgagcaaagtgaagtagtcgtttcaacatcatcgattcaaaaaaataaaatcctcgataataagaagaatagagctaacttcgttacttcctctcagcttattaaggaaaaaccatcaaattctaaagatgcatctggtgtaattgataattctgcttctcctctatcttatcgtaaagctaaggaagtggtatctcttagacaacctttaaaaaatcaaaaagtagaggcacaacctctattgataagtaattcttctgaaaagaaagcaagtgtttatacaaattcacatgatttttgggattatcagtgggatatgaaatatgtgacaaataatggagaaagctatgcgctctaccagccctcaaagaaaatttctgttggaattattgattcaggaatcatggaagaacatcctgatttgtcaaatagtttaggaaattattttaaaaatcttgttcctaagggagggtttgataatgaagaacctgatgaaactggaaatccaagtgatattgtcgacaaaatgggacacgggacggaagtcgcaggtcagattacagcaaatggtaatattttaggagtagcaccagggattactgtaaatatatacagagtatttggtgaaaatctttcgaaatcggaatgggtagctagagcaataagaagagctgcggatgatgggaacaaggtcatcaatataagtgctggacagtatcttatgatttcaggatcgtatgatgatggaacaaatgattatcaagagtatcttaattataagtcagcaataaattatgcaacagcaaaaggaagtattgttgtcgcagctcttggtaatgatagtttaaacatacaagataaccaaacaatgataaactttcttaagcgtttcagaagtataaaggttcctggaaaagttgtagatgcaccgagtgtatttgaggatgtaatagccgtaggtggaatagatggttatggtaatatttctgattttagtaatattggagcggatgcaatttatgctcctgctggcacaacggccaattttaaaaaatatgggcaagataaatttgtcagtcagggttattatttgaaagattggctttttacaactactaatactggctggtaccaatatgtttatggcaactcatttgctactcctaaagtatctggggcactggcattagtagttgataaatatggaataaagaatcctaaccaactaaaaaggtttcttctaatgaattctccagaagttaatgggaatagagtattgaatattgttgatttattgaatgggaaaaataaagcttttagcttagatacagataaaggtcaggatgatgctattaaccataaatcaatggagaatcttaaagagtctagggatacaatgaaacaggaacaagataaagaaattcaaagaaatacaaataacaatttttctatcaaaaatgattttcataacatttcaaaagaagtaatttcagttgattataatattaatcaaaaaatggctaataatcgaaattcgagaggtactgtttctgtacgaagtcaagaaattttacctgttactggagatggagaagattttttacgggctttaggtatagtgtgtatctcaatccttggtatattgaaaagaaagactaaaaattga(SEQ ID NO：18)。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述能夠識別NisP切割位點的蛋白為胰蛋白酶，優(yōu)選Trypsin。由此，能夠高效地實現(xiàn)對經(jīng)過修飾的乳酸鏈球菌素前體肽的體外酶解，有效獲得乳酸鏈球菌素，且胰蛋白酶獲得容易，便于本發(fā)明方法的產(chǎn)業(yè)化和規(guī)?；茝V。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述微生物不具備天然的乳酸鏈球菌素合成途徑。這是因為，具備天然的乳酸鏈球菌素合成途徑的微生物，其天然合成的乳酸鏈球菌素也會破壞自身細胞破裂，影響本發(fā)明的方法的實施。根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實施例，所述微生物為選自大腸桿菌、木霉、酵母、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉菌的至少一種。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用選自大腸桿菌、木霉、酵母、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉菌的至少一種表達獲得所述NisB蛋白。由此，能夠高效地生產(chǎn)NisB蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用選自大腸桿菌、木霉、酵母、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌和米曲 霉菌的至少一種表達獲得所述NisC蛋白。由此，能夠高效地生產(chǎn)NisC蛋白。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，利用選自大腸桿菌、木霉、酵母、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉菌的至少一種表達獲得所述NisP蛋白。由此，NisP蛋白產(chǎn)量高，質(zhì)量好，能夠有效用于上述體外酶解。

本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。

附圖說明

本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結(jié)合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：

圖1顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL300的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL301的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL302的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL303的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL304的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖6顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pRL305質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖7顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pRL306質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖8顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pRL307質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖9顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pRL308質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖10顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pRL309質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖11顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pRL310質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖12顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的pRL311質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖13顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL312的結(jié)構(gòu)示意圖

圖14顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL313的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖15顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL314的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖16顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL315的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖17顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL316的結(jié)構(gòu)示意圖；以及

圖18顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施例的質(zhì)粒pRL316的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實施方式

下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的方案進行解釋。本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下面的實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體技術(shù)或條件的，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品，例如可以采購自Sigma公司。

實施例1制備乳酸鏈球菌素

一、合成半成熟的Nisin前體肽

按照以下步驟，分別在酵母、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌、米曲霉和木霉中合成半成熟的Nisin前體肽：

1、在釀酒酵母中合成半成熟的Nisin前體肽

在nisA、nisB和nisC基因前端分別添加GAL7、GAL10和GAL1啟動子，并在這三個基因后面分別添加終止子，再將這三個表達框克隆在去除原始啟動子的釀酒酵母表達載體pYes2上，形成質(zhì)粒pRL300，質(zhì)粒圖如圖1。將這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入釀酒酵母INVSC1中，得到釀酒酵母表達菌RL300。

從選擇平板上挑取RL300單克隆至5mL SC-U選擇培養(yǎng)基中(含有2％葡萄糖),30℃搖瓶過夜后，將其轉(zhuǎn)入50mL SC-U選擇培養(yǎng)基中(含有2％葡萄糖)，30℃搖瓶培養(yǎng)6小時后，培養(yǎng)測量過夜培養(yǎng)物的OD值。計算滿足300mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基OD為0.4所需的菌液量。計算方法如下：過夜培養(yǎng)的菌液OD為a。300mL選擇培養(yǎng)基所需要的菌液量為(120/a)mL。取上述步驟所需量的菌液，4℃、1500rpm離心5分鐘，收集菌體。用1-2mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SC-U，含2％棉籽糖)重懸菌體，加入300mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SC-U，含2％棉籽糖)中，30℃搖瓶培養(yǎng)1-2小時，加入1％的半乳糖進行誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)后24小時后收集菌體，再將菌體破碎后得到未成熟的Nisin蛋白。

2、在鏈霉菌中合成半成熟的Nisin前體肽

將nisA與nisB之間通過引物設(shè)計添加RBS序列，將兩端序列通過PCR擴增在一起，同時再在后面添加RBS序列和nisC序列，將這一整段序列克隆在載體pIB139上，構(gòu)成鏈霉菌表達載體pRL301，質(zhì)粒圖如圖2。將這個質(zhì)粒通過結(jié)合轉(zhuǎn)移進入鏈霉菌FR008宿主細胞中，形成鏈霉菌表達菌RL301.

從選擇平板上挑取經(jīng)驗證成功的RL301至5mL TSBY培養(yǎng)基中,28℃搖瓶過夜后，將其轉(zhuǎn)入50mL TSBY培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)待菌長濃后再按照2％的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)入300mL的TSBY培養(yǎng)基中培養(yǎng)36小時，收集菌體，再將菌體破碎后得到未成熟的Nisin蛋白。

3、在枯草芽孢桿菌中合成半成熟的Nisin前體肽

從pRL301中擴增nisA、nisB、nisC共表達的基因片段，將其克隆在枯草芽孢桿菌表達載體pHT43上，構(gòu)成枯草芽孢桿菌表達載體pRL302，質(zhì)粒圖如圖3。將這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入枯草芽孢桿菌WB800N中，形成枯草芽孢桿菌表達菌RL302.

挑取成功驗證的RL302菌株接種于5mL含有10ug/mL LB培養(yǎng)基中，置于搖床在37度過夜培養(yǎng)，按1％的接種量將上述過夜的一級培養(yǎng)液分別接種于500mL含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)至OD達到0.8左右，加入終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)，溫度降為28度。在誘導(dǎo)后24小時從發(fā)酵液中提取得到未成熟的Nisin蛋白。

4、在米曲霉表達菌株RL303中合成半成熟的Nisin前體肽

在nisA、nisB和nisC三個基因前面分別加上來自構(gòu)巢曲霉的gpdA啟動子，來自黑曲霉的pkiA啟動子和來自構(gòu)巢曲霉的trpC啟動子，并分別加上構(gòu)巢曲霉的trpC終止子，米曲霉 的agdA終止子和黑曲霉的glaA終止子，同時從質(zhì)粒pYH-WA-pyrG-KI上克隆構(gòu)巢曲霉的pyrG基因片段，將這四個片段首尾相連后克隆到pMD-18T載體上形成質(zhì)粒pRL303，質(zhì)粒圖如圖4。將質(zhì)粒酶切線性化之后轉(zhuǎn)入米曲霉?fàn)I養(yǎng)缺失型菌株(pyrG-)中，得到米曲霉表達菌株RL303。

將RL303菌株接種到PDB培養(yǎng)基中，28℃，220rpm培養(yǎng)3-4天，過濾收集菌體提取蛋白。

5、在里氏木霉中合成半成熟的Nisin前體肽

在nisA、nisB和nisC三個基因前面分別加上里氏木霉(Trichoderma reesei)cbhI基因的啟動子，長枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)egl1基因的啟動子和微紫青霉(Penicillium janthinellum)egl2基因的啟動子，并分別加上構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)的trpC終止子和Nos終止子，將這三個表達框均克隆到更換了潮霉素抗性基因啟動子的pCambia1301上，得到質(zhì)粒pRL311(見圖12)。將質(zhì)粒pRL311轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌EHA105中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化里氏木霉(Trichoderma reesei)，得到重組菌株RL311。

將此重組菌株RL311接種到含5g/L的葡萄糖，10g/L的纖維物質(zhì)和10g/L的微晶纖維素的30mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(BFM)培養(yǎng)基中，250mL的搖瓶，200rpm，28℃，pH5-6，振蕩培養(yǎng)5d，使用10％的氨水調(diào)節(jié)pH，發(fā)酵結(jié)束后收集蛋白。

二、表達純化NisP蛋白

利用大腸桿菌蛋白表達純化系統(tǒng)，將nisP基因通過NdeI和XhoI位點克隆在pET28(a)質(zhì)粒上，形成質(zhì)粒pRL304，質(zhì)粒圖如圖5。將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中形成大腸桿菌表達菌RL304。

將RL304在含有卡那霉素的5mL LB培養(yǎng)基37℃，200rpm培養(yǎng)12小時，按1％接種量將大腸桿菌過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入300mL含有卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖床培養(yǎng)約2小時至OD值約為0.6，加入0.25mM IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后溫度降為18℃繼續(xù)培養(yǎng)18小時后收集菌體。將菌體懸浮在Tris緩沖液中通過超聲破碎后，收集上清，將上清通過鎳柱，NisP蛋白會結(jié)合在鎳柱上，最后再用含有咪唑的洗脫緩沖液將NisP蛋白從鎳柱上洗脫下來，即為純化得到的NisP蛋白。

三、合成Nisin前體肽：NisA蛋白、NisZ蛋白、NisQ蛋白、NisF蛋白、NisU蛋白和NisU2蛋白

(一)合成NisA蛋白

按照以下步驟，分別在酵母、鏈霉菌、枯草芽孢桿菌和米曲霉中合成NisA蛋白：

1、在釀酒酵母中合成NisA蛋白

將nisA克隆在釀酒酵母表達載體pYes2上，形成質(zhì)粒pRL305,質(zhì)粒圖如圖6。將這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入釀酒酵母INVSC1中，得到釀酒酵母表達菌RL305。

從選擇平板上挑取RL305單克隆至5mL SC-U選擇培養(yǎng)基中(含有2％葡萄糖)，30℃搖 瓶過夜后，將其轉(zhuǎn)入50mL SC-U選擇培養(yǎng)基中(含有2％葡萄糖)，30℃搖瓶培養(yǎng)6小時后，培養(yǎng)測量過夜培養(yǎng)物的OD值。計算滿足300mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基OD為0.4所需的菌液量。計算方法如下：過夜培養(yǎng)的菌液OD為a。300mL選擇培養(yǎng)基所需要的菌液量為(120/a)mL。取上述步驟所需量的菌液，4℃1500rpm離心5分鐘，收集菌體。用1-2mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SC-U，含2％棉籽糖)重懸菌體，加入300mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基(SC-U，含2％棉籽糖)中，30℃搖瓶培養(yǎng)1-2小時，加入1％的半乳糖進行誘導(dǎo)，在誘導(dǎo)后24小時后收集菌體，從中得到NisA蛋白。

2、在鏈霉菌中合成NisA蛋白

將nisA基因克隆在載體pIB139上，構(gòu)成鏈霉菌表達載體pRL306，質(zhì)粒圖如圖7。將這個質(zhì)粒通過結(jié)合轉(zhuǎn)移進入鏈霉菌FR008宿主細胞中，形成鏈霉菌表達菌RL306。

從選擇平板上挑取經(jīng)驗證成功的RL306至5mL TSBY培養(yǎng)基中,28℃搖瓶過夜后，將其轉(zhuǎn)入50mL TSBY培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)待菌長濃后再按照2％的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)入300mL的TSBY培養(yǎng)基中培養(yǎng)36小時，收集菌體，再將菌體破碎后得到NisA蛋白。

3、在枯草芽孢桿菌中合成NisA蛋白

將nisA基因克隆在枯草芽孢桿菌表達載體pHT43上，構(gòu)成枯草芽孢桿菌表達載體pRL307，質(zhì)粒圖如圖8。將這個質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進入枯草芽孢桿菌WB800N中，形成枯草芽孢桿菌表達菌RL307。

挑取成功驗證的RL307菌株接種于5mL含有10ug/mL LB培養(yǎng)基中，置于搖床在37度過夜培養(yǎng)，按1％的接種量將上述過夜的一級培養(yǎng)液分別接種于500mL含抗生素的LB培養(yǎng)基中，37度培養(yǎng)至OD達到0.8左右，加入終濃度為1mM的IPTG誘導(dǎo)，溫度降為28度。在誘導(dǎo)后24小時從發(fā)酵液中提取得到NisA蛋白。

4、在米曲霉合成NisA蛋白

在nisA基因前后分別加上來自構(gòu)巢曲霉的gpdA啟動子和trpC終止子，同時從質(zhì)粒pYH-WA-pyrG-KI上克隆構(gòu)巢曲霉的pyrG基因片段，將這四個片段首尾相連后克隆到pMD-18T載體上形成質(zhì)粒pRL308，質(zhì)粒圖如圖9。將質(zhì)粒酶切線性化之后轉(zhuǎn)入米曲霉?fàn)I養(yǎng)缺失型菌株(pyrG-)中，得到米曲霉表達菌株RL308。

將RL308菌株接種到PDB培養(yǎng)基中，28℃，220rpm培養(yǎng)3-4天，過濾收集菌體提取蛋白NisA。

5、在畢赤酵母中合成NisA蛋白

將nisA克隆到pGAPZ-α質(zhì)粒上，使基因A處于α-信號肽和AOX1終止子之間，利用組成型GAP啟動子進行表達，得到質(zhì)粒pRL312，質(zhì)粒圖如圖13。將pRL312轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中，篩選得到重組菌株RL312。

將重組菌株RL312接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中，30℃，220rpm培養(yǎng)96小時后，收集發(fā)酵液提取蛋白NisA。

(二)分別合成NisZ蛋白、NisQ蛋白、NisF蛋白、NisU蛋白和NisU2蛋白

將nisZ基因克隆在pET28(a)質(zhì)粒上，形成質(zhì)粒pRL313，質(zhì)粒圖如圖14。將該質(zhì)粒導(dǎo)入 大腸桿菌BL21(DE3)中形成大腸桿菌表達菌RL313。

將nisQ基因克隆在pET28(a)質(zhì)粒上，形成質(zhì)粒pRL314，質(zhì)粒圖如圖15。將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中形成大腸桿菌表達菌RL314。

將nisF基因克隆在pET28(a)質(zhì)粒上，形成質(zhì)粒pRL315，質(zhì)粒圖如圖16。將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中形成大腸桿菌表達菌RL315。

將nisU基因克隆在pET28(a)質(zhì)粒上，形成質(zhì)粒pRL316，質(zhì)粒圖如圖17。將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中形成大腸桿菌表達菌RL316。

將nisU2基因克隆在pET28(a)質(zhì)粒上，形成質(zhì)粒pRL317，質(zhì)粒圖如圖18。將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中形成大腸桿菌表達菌RL317。

分別將菌株RL313、RL314、RL315、RL316、RL317在含有卡那霉素的5mL LB培養(yǎng)基37℃，200rpm培養(yǎng)12小時，按1％接種量將大腸桿菌過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入300mL含有卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37℃,200rpm搖床培養(yǎng)約2小時至OD值約為0.6，加入0.25mM IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后溫度降為18℃繼續(xù)培養(yǎng)18小時后收集菌體。破碎后即可得到相應(yīng)的蛋白。

四、表達純化NisB蛋白

利用大腸桿菌蛋白表達純化系統(tǒng)，將nisB基因克隆在pET28(a)質(zhì)粒上，形成質(zhì)粒pRL309，質(zhì)粒圖如圖10。將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中形成大腸桿菌表達菌RL309。

將RL309在含有卡那霉素的5mL LB培養(yǎng)基37℃，200rpm培養(yǎng)12小時，按1％接種量將大腸桿菌過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入300mL含有卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37℃,200rpm搖床培養(yǎng)約2小時至OD值約為0.6，加入0.25mM IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后溫度降為18℃繼續(xù)培養(yǎng)18小時后收集菌體。將菌體懸浮在Tris緩沖液中通過超聲破碎后，收集上清，將上清通過鎳柱，NisB蛋白會結(jié)合在鎳柱上，最后再用含有咪唑的洗脫緩沖液將NisB蛋白從鎳柱上洗脫下來，即為純化得到的NisB蛋白。

五、表達純化NisC蛋白

利用大腸桿菌蛋白表達純化系統(tǒng)，將nisC基因克隆在pET28(a)質(zhì)粒上，形成質(zhì)粒pRL310，質(zhì)粒圖如圖11。將該質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21(DE3)中形成大腸桿菌表達菌RL310。

將RL310在含有卡那霉素的5mL LB培養(yǎng)基37℃，200rpm培養(yǎng)12小時，按1％接種量將大腸桿菌過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接入300mL含有卡那霉素LB培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖床培養(yǎng)約2小時至OD值約為0.6，加入0.25mM IPTG進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后溫度降為18℃繼續(xù)培養(yǎng)18小時后收集菌體。將菌體懸浮在Tris緩沖液中通過超聲破碎后，收集上清，將上清通過鎳柱，NisC蛋白會結(jié)合在鎳柱上，最后再用含有咪唑的洗脫緩沖液將NisC蛋白從鎳柱上洗脫下來，即為純化得到的NisC蛋白。

六、用NisP蛋白體外酶解半成熟的Nisin前體肽

針對步驟一中在不同微生物中分別合成的幾種半成熟的Nisin前體肽，均分別進行以下操作：

利用0.5M磷酸緩沖液懸浮半成熟的Nisin前體肽，并添加步驟二中純化獲得的NisP蛋白，然后于30攝氏度下避光反應(yīng)5小時后，收集產(chǎn)物進行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果，均得到了成熟的Nisin蛋白。

七、用胰蛋白酶Trypsin體外酶解半成熟的Nisin前體肽

針對步驟一中在不同微生物中分別合成的幾種半成熟的Nisin前體肽，均分別進行以下操作：

將半成熟的Nisin前體肽用0.5M磷酸緩沖液懸浮，添加Trypsin并于30攝氏度下避光反應(yīng)5小時后，收集產(chǎn)物進行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果，均得到了成熟的Nisin蛋白。

八、用NisB、NisC和NisP蛋白體外酶解Nisin前體肽

針對步驟三中在不同微生物中分別合成的幾種Nisin前體肽(即NisA蛋白、NisZ蛋白、NisQ蛋白、NisF蛋白、NisU蛋白和NisU2蛋白)，均分別進行以下操作：

將Nisin前體肽用0.5M磷酸緩沖液懸浮，添加純化步驟四中獲得的NisB蛋白、步驟五中獲得的NisC蛋白、以及步驟二中獲得的NisP蛋白，并于30攝氏度下避光反應(yīng)10小時后，收集產(chǎn)物進行質(zhì)譜鑒定。結(jié)果，均得到了成熟的Nisin蛋白。

九、Nisin蛋白產(chǎn)量和質(zhì)量檢測

參照文獻Aeration and fermentation strategies on nisin production.Biotechnology Letters.2015,olume 37,Issue 10,pp 2039-2045中報道的檢測方法，檢測步驟六、七、八中Nisin蛋白的產(chǎn)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，獲得的Nisin的產(chǎn)量均顯著高于目前報道的利用乳酸菌生產(chǎn)Nisin的產(chǎn)量。例如上述的文獻Aeration and fermentation strategies on nisin production.Biotechnology Letters.2015,olume 37,Issue 10,pp 2039-2045中的Nisin產(chǎn)量為15400IU/mL，而本發(fā)明上述步驟六、七、八中Nisin蛋白的產(chǎn)量顯著高于15400IU/mL。由此，表明本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)能夠生產(chǎn)更多的Nisin，也即產(chǎn)量更高。

通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明上述步驟六、七、八中得到的Nisin蛋白的純度均高于目前市售的Nisin應(yīng)用產(chǎn)品(不包括標(biāo)準(zhǔn)品)。

在本說明書的描述中，參考術(shù)語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結(jié)合該實施例或示例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術(shù)語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結(jié)構(gòu)、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結(jié)合。

盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本 發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。