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      一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子及應(yīng)用的制作方法

      文檔序號:12411547閱讀:379來源:國知局
      一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子及應(yīng)用的制作方法與工藝

      本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域,更具體涉及一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子及應(yīng)用。



      背景技術(shù):

      人腦是自然界中最為復(fù)雜的系統(tǒng)之一,而神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)是大腦行使功能的基礎(chǔ),神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的正常連接,使得機體產(chǎn)生正常的生理活動,如認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶和恐懼等;神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的異常往往導(dǎo)致神經(jīng)疾病的出現(xiàn),尚無有效手段來治療這些神經(jīng)疾病。目前,正常生理活動和致病機制均不清楚,主要的原因在于腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接信息的缺乏。因此,開展腦神經(jīng)環(huán)路的研究而繪制高精度的腦功能連接圖譜,對于了解人的生理活動和致病機制具有重要的意義。

      西門利克森林病毒(Semliki forest virus,SFV)屬于披膜病毒科甲病毒屬,其基因組為單股正鏈RNA,長度約為12kb。基因組編碼的多聚蛋白可切割成4個結(jié)構(gòu)蛋白(C、P62、6K和E1)和4個非結(jié)構(gòu)蛋白(nsP1、nsP2、nsP3和nsP4)。塞姆利基森林病毒具有廣泛的宿主范圍,包括:人、鼠、猴等,能夠感染神經(jīng)系統(tǒng),一方面不利于人類的健康和農(nóng)業(yè)生產(chǎn),另一方面,這種感染特性可以使得其成為介導(dǎo)外源基因到宿主體內(nèi)的載體,另外,西門利克森林病毒感染腦神經(jīng)系統(tǒng)的特性使其成為具備解析神經(jīng)環(huán)路的能力。但是因為存在一系列工藝和技術(shù)改造方面的問題,所以目前其還沒有應(yīng)用到細(xì)胞精細(xì)形態(tài)的描繪、靈長類神經(jīng)環(huán)路的標(biāo)記等方面。而本發(fā)明通過一系列的條件優(yōu)化、系統(tǒng)的改造和升級,獲得了一種高效且穩(wěn)定的具有單次感染特性的表達綠色熒光蛋白的SFV系統(tǒng),明確了其在非人靈長類神經(jīng)環(huán)路應(yīng)用方面的效果,為開展腦科學(xué)研究提供了良好的工具系統(tǒng)。

      隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,科學(xué)家已經(jīng)能夠通過反向遺傳學(xué)的手段來定向改造病毒,為深入開展相關(guān)的病毒學(xué)研究提供了良好的工具。因此,本發(fā)明分別采用不同的技術(shù)途徑獲得了一種高效且穩(wěn)定的具有單次感染特性的表達綠色熒光蛋白的SFV系統(tǒng)。將在神經(jīng)細(xì)胞和非神經(jīng)細(xì)胞精細(xì)形態(tài)的描繪、靈長類和非靈長類解析腦神經(jīng)環(huán)路、病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選、疫苗和診斷試劑的研發(fā)、動物模型的建立和病毒復(fù)制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應(yīng)用價值和前景。



      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的目的在于提供了一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子,該復(fù)制子為含有熒光蛋白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。該復(fù)制子可用于西門利克森林病毒類病毒顆粒的制備。

      本發(fā)明還有一個目的在于提供了一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子的應(yīng)用,包括該復(fù)制子可用于制備西門利克森林病毒類病毒顆粒。制備出的病毒樣顆??捎糜诜侨遂`長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記,同時,該復(fù)制子還可用于蛋白表達、基因治療、神經(jīng)細(xì)胞精細(xì)形態(tài)的描繪、神經(jīng)環(huán)路的解析、神經(jīng)環(huán)路稀疏標(biāo)記、病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選、疫苗和診斷試劑的研發(fā)、動物模型的建立和病毒復(fù)制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應(yīng)用價值。

      為了實現(xiàn)以上目的,本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:

      一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子,該復(fù)制子為含有熒光蛋白基因和SEQ ID NO.4所示序列的pSFV-replicon。

      優(yōu)選的,使用BamHI+XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.),然后采用Vazyme同源重組試劑盒將SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4片段插入到pSFV-replicon,將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101,PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序,測序正確的克隆命名為pSFV-replicon-EGFP,其序列為SEQ ID NO:8所示。

      一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子的應(yīng)用,包括:

      1.西門利克森林病毒復(fù)制子制備表達綠色熒光蛋白的單次感染性的西門利克森林病毒類病毒顆粒:

      使用NruI分別酶切pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper(Berglund,P et al.,(1993)Biot echnology 11,916-920.),使用MEGAscript SP6Transcription Kit分別體外轉(zhuǎn)錄酶切后的pS FV-replicon-EGFP和pSFV-helper為RNA,并轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞,37℃,5%(v/v)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),收集上清,即得。

      2.西門利克森林病毒復(fù)制子制備出的病毒樣顆粒在制備非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記藥物中的應(yīng)用,特別是用于猴神經(jīng)細(xì)胞的快速標(biāo)記。

      本發(fā)明提供的一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子的制備方法也適合于與西門利克森林病毒同科的病毒的構(gòu)建,例如委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒(Venezu elan equine encephalitis virus,VEEV)和辛德畢斯病毒(Sindbis virus,SINV)。西門利克森林病毒復(fù)制子或其制備出的病毒樣顆粒不僅可用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞的快速標(biāo)記,還可用于蛋白表達、基因治療、神經(jīng)細(xì)胞精細(xì)形態(tài)的描繪、神經(jīng)環(huán)路的解析、神經(jīng)環(huán)路稀疏標(biāo)記、病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選、疫苗和診斷試劑的研發(fā)、動物模型的建立和病毒復(fù)制與致病機制的分析。

      本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,具有以下優(yōu)點和效果:

      1.本發(fā)明提供了一種高效、便捷的表達外源蛋白的類西門利克森林病毒的顆粒,該平臺制備的病毒具有可視化的特點,便于開展相關(guān)的研究。

      2.本發(fā)明對于開展非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)記具有重要價值,同時對于其他應(yīng)用性研究(如蛋白表達、基因治療、細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)描繪、神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記、藥物篩選、抗原表位分析、新型疫苗和診斷試劑等)和基礎(chǔ)性研究(如復(fù)制、包裝盒致病機制等)具有重要的現(xiàn)實意義和廣泛的應(yīng)用價值。

      3.本發(fā)明制備的類病毒顆粒能夠在數(shù)天的時間內(nèi)快速標(biāo)記非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞。

      4.解析神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)是開展腦科學(xué)研究的基礎(chǔ),良好用于神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記的工具對于解析神經(jīng)環(huán)路的結(jié)構(gòu)具有重要意義。SFV能夠感染人和鼠等動物的神經(jīng)細(xì)胞,具有作為神經(jīng)環(huán)路標(biāo)記的潛力。本發(fā)明不僅能夠用于非人靈長類動物,而且還能用于非靈長類動物的腦科學(xué)研究。

      附圖說明

      圖1為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒的構(gòu)建和制備示意圖。

      A:一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒復(fù)制子的構(gòu)建示意圖;

      B:一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒的制備示意圖。

      圖2為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒表達熒光示意圖。

      A:未轉(zhuǎn)染RNA的細(xì)胞;

      B:共轉(zhuǎn)染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21細(xì)胞表達綠色熒光蛋白;

      圖3為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒單次感染細(xì)胞。

      A:類病毒顆粒感染BHK21細(xì)胞后表達綠色熒光蛋白;

      B:類病毒顆粒感染BHK21細(xì)胞后收集的上清感染BHK21細(xì)胞,沒有熒光蛋白的表達,即沒有病毒產(chǎn)生;

      圖4為一種攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒生長曲線。

      A:類病毒顆粒感染BHK21細(xì)胞后表達綠色熒光蛋白;

      B:不同時間收集類病毒顆粒的滴度分析;

      圖5為一種穩(wěn)定攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆??焖贅?biāo)記非人靈長類動物(猴)神經(jīng)細(xì)胞的示意圖。

      猴腦感染表達EGFP的西門利克森林病毒類病毒顆粒后2天,神經(jīng)細(xì)胞被綠色熒光蛋白標(biāo)記。

      具體實施方式

      本發(fā)明所述技術(shù)方案,如未特別說明,均為本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。

      實施例1:

      一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子,包括下述步驟制備步驟:

      ①以pEGFP-N2(Invitrogen公司)為模板擴增EGFP基因,其序列為SEQ ID NO:1,使用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示引物擴增片段SEQ ID NO:1;以pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.)為模板擴增capsid的N端102bp(即C34),其序列為SEQ ID NO:4,使用SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物擴增片段SEQ ID NO:4;按常規(guī)方式檢測回收擴增出的DNA片段。C34和EGFP之間通過F2A連接,其序列為SEQ ID NO:7,其序列包含在引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:2中。

      PCR的反應(yīng)體系均為50μl:5×Reaction Buffer:10μl,10mM dNTPs:1μl,10μM Forward Primer:2.5μl,10μM Reverse Primer:2.5μl,Template DNA:0.5μl,DNA Polymerase:0.5μl,Nuclease-Free Water:33μl。擴增條件為:98℃60s,98℃10s,55℃15s,72℃60s,72℃10min,16℃10min,30個循環(huán);

      使用BamHI和XhoI酶切pSFV-replicon(Lundstrom,K et al.,(2003)Mol.Ther.7,202-209.),然后采用Vazyme同源重組試劑盒將SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4片段插入到SFV復(fù)制子質(zhì)粒Ubc-SFV-replicon,將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)HB101,PCR鑒定為陽性的克隆進行培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒進行測序,測序正確的克隆命名為pSFV-replicon-EGFP,其序列為SEQ ID NO:8所示。

      實施例2:

      一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子的應(yīng)用:制備表達綠色熒光蛋白的單次感染性的西門利克森林病毒類病毒顆粒:

      用NruI分別酶切pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper(Berglund,P et al.,(1993)Biotec hnology 11,916-920.),使用MEGAscript SP6Transcription Kit分別體外轉(zhuǎn)錄酶切后的pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper為RNA,并轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞,37℃,5%(v/v)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),通過倒置熒光顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài)和熒光表達,在感染后的不同時間收集病毒上清。使用終濃度為500μg/ml的α-chymotrypsin(Sigma)在37度處理收集的上清30min,然后加入終濃度為250μg/ml aprotinin(Sigma)。然后檢測不同時間點收集病毒的滴度,選擇滴度最高的病毒進行后續(xù)的實驗。

      圖2中A:沒有轉(zhuǎn)染RNA的BHK21細(xì)胞,作為實驗的對照;

      圖2中B:共轉(zhuǎn)染pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA的BHK21細(xì)胞,1天后即可產(chǎn)生綠色的熒光信號,表明依賴于西門利克森林病毒復(fù)制子能高效快速表達外源蛋白。

      利用實施例2所述的方法而制備的表達綠色熒光蛋白的西門利克森林病毒類病毒顆粒經(jīng)過α-chymotrypsin和aprotinin處理后,用于以下實施例。

      實施例3:

      西門利克森林病毒復(fù)制子制備出的西門利克森林病毒類病毒顆粒具有單次感染性:

      取1μl類病毒顆粒感染BHK21細(xì)胞,在感染后1天觀察綠色熒光的表達情況,并收集培養(yǎng)基上清。取收集的培養(yǎng)基上清100μl感染BHK21細(xì)胞,感染后不同時間觀察熒光的表達情況。

      圖3中A:攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒感染BHK21細(xì)胞后表達綠色熒光蛋白,表明本發(fā)明能夠用于體外表達外源蛋白,具有在體內(nèi)的應(yīng)用價值。

      圖3中B:將感染BHK21細(xì)胞后收集的上清再次感染新制備的BHK21細(xì)胞,觀察后不同時間沒有觀察到熒光蛋白的表達,表明該病毒樣顆粒具有單次感染細(xì)胞的特點。

      實施例4:

      西門利克森林病毒復(fù)制子制備出的西門利克森林病毒類病毒顆粒生長曲線分析:

      分別取不同時間點收集的類病毒顆粒100μl感染BHK21細(xì)胞,在感染后2天觀察綠色熒光的表達情況,并計數(shù)熒光細(xì)胞的數(shù)量,計算病毒的滴度。

      圖4中A:攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒感染BHK21細(xì)胞后表達綠色熒光蛋白。不同時間收集的病毒均能感染BHK21細(xì)胞,并表達綠色熒光蛋白,表明本發(fā)明能夠用于體外表達外源蛋白,具有在體內(nèi)的應(yīng)用價值。

      圖4中B:攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒在BHK21細(xì)胞中的生長曲線。在將pSFV-replicon-EGFP和pSFV-helper的RNA共轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞后1天,病毒滴度即達到7×106FFU/ml,而后逐漸升高,轉(zhuǎn)染后3天,滴度到達1.8×108FFU/ml。該數(shù)據(jù)對于選擇最佳的時間收集攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒具有重要意義。

      實施例5:

      攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒在標(biāo)記猴神經(jīng)細(xì)胞中的應(yīng)用,其步驟是:

      手術(shù)前,無菌的條件下肌肉注射氯胺酮45mg到獼猴(體重4.5kg),然后肌肉注射戊巴比妥135mg和阿托品0.18mg。然后移除面積為7cm×2.8cm的顱骨,剝除硬腦膜以暴露皮層,注射4μl攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒(滴度是1.8×108FFU/ml)定位注射到猴腦(獼猴,猴齡12年)到猴腦。當(dāng)注射器的針頭達到目的腦區(qū)后,等待2 min,然后開始緩慢的注射,每次注射使用時間約為20min,注射完畢后等待約10min,然后再拔出針頭。術(shù)后3天,每天肌肉注射頭孢菌素112.5mg。

      采用逆差計時的方式分別在取腦組織前1、2、5、7、10天麻醉猴后,用0.9%(V/V)生理鹽水灌流,然后用4%(V/V)多聚甲醛固定,取出腦組織浸泡于4%(V/V)多聚甲醛液中2周,然后將腦組織先置于20%(V/V)蔗糖溶液中1天,然后置于30%(V/V)蔗糖溶液中;將腦組織底部切平,置于底座上包埋冰凍1h后切片;取腦片后使用熒光顯微鏡觀察。在注射攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒后2天,可見明顯的綠色熒光蛋白的表達,表明攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒能夠感染猴腦神經(jīng)細(xì)胞,并能在其中復(fù)制和表達蛋白(圖5),該結(jié)果表明攜帶EGFP基因的西門利克森林病毒類病毒顆粒具有標(biāo)記非人靈長類動物神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的潛力,其標(biāo)記的速度快速(只需要2天),因此是一種高效的標(biāo)記非人靈長類動物神經(jīng)元的工具。

      最后,還需要注意的是,上述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規(guī)方法,并且以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個具體實施例。顯然,本發(fā)明不限于以上實施例,還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形,均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護范圍。

      SEQUENCE LISTING

      <110> 中國科學(xué)院武漢物理與數(shù)學(xué)研究所

      <120> 一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子及應(yīng)用

      <130> 一種用于非人靈長類神經(jīng)細(xì)胞快速標(biāo)記的西門利克森林病毒復(fù)制子及應(yīng)用

      <160> 8

      <170> PatentIn version 3.1

      <210> 1

      <211> 717

      <212> DNA

      <213> 人工序列

      <400> 1

      atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

      ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

      ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

      ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

      cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

      ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

      gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

      aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

      ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

      gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

      tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

      ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaag 717

      <210> 2

      <211> 59

      <212> DNA

      <213> 人工序列

      <400> 2

      ccttctcaag ctggcgggag acgtcgagtc caaccctggg ccaatggtga gcaagggcg 59

      <210> 3

      <211> 45

      <212> DNA

      <213> 人工序列

      <400> 3

      ggatcgacta gtgaactcga gttacttgta cagctcgtcc atgcc 45

      <210> 4

      <211> 102

      <212> DNA

      <213> 人工序列

      <400> 4

      atgaattaca tccctacgca aacgttttac ggccgccggt ggcgcccgcg cccggcggcc 60

      cgtccctggc cgttgcaggc cactccggtg gctcccgtcg tc 102

      <210> 5

      <211> 50

      <212> DNA

      <213> 人工序列

      <400> 5

      aatacacaga attctgattg gatccaccat gaattacatc cctacgcaaa 50

      <210> 6

      <211> 59

      <212> DNA

      <213> 人工序列

      <400> 6

      ctcccgccag cttgagaagg tcaaaattca acagctgccc ggggacgacg ggagccacc 59

      <210> 7

      <211> 60

      <212> DNA

      <213> 人工序列

      <400> 7

      cagctgttga attttgacct tctcaagctg gcgggagacg tcgagtccaa ccctgggcca 60

      <210> 8

      <211> 11471

      <212> DNA

      <213> 人工序列

      <400> 8

      gatggcggat gtgtgacata cacgacgcca aaagattttg ttccagctcc tgccacctcc 60

      gctacgcgag agattaacca cccacgatgg ccgccaaagt gcatgttgat attgaggctg 120

      acagcccatt catcaagtct ttgcagaagg catttccgtc gttcgaggtg gagtcattgc 180

      aggtcacacc aaatgaccat gcaaatgcca gagcattttc gcacctggct accaaattga 240

      tcgagcagga gactgacaaa gacacactca tcttggatat cggcagtgcg ccttccagga 300

      gaatgatgtc tacgcacaaa taccactgcg tatgccctat gcgcagcgca gaagaccccg 360

      aaaggctcgt atgctacgca aagaaactgg cagcggcctc cgggaaggtg ctggatagag 420

      agatcgcagg aaaaatcacc gacctgcaga ccgtcatggc tacgccagac gctgaatctc 480

      ctaccttttg cctgcataca gacgtcacgt gtcgtacggc agccgaagtg gccgtatacc 540

      aggacgtgta tgctgtacat gcaccaacat cgctgtacca tcaggcgatg aaaggtgtca 600

      gaacggcgta ttggattggg tttgacacca ccccgtttat gtttgacgcg ctagcaggcg 660

      cgtatccaac ctacgccaca aactgggccg acgagcaggt gttacaggcc aggaacatag 720

      gactgtgtgc agcatccttg actgagggaa gactcggcaa actgtccatt ctccgcaaga 780

      agcaattgaa accttgcgac acagtcatgt tctcggtagg atctacattg tacactgaga 840

      gcagaaagct actgaggagc tggcacttac cctccgtatt ccacctgaaa ggtaaacaat 900

      cctttacctg taggtgcgat accatcgtat catgtgaagg gtacgtagtt aagaaaatca 960

      ctatgtgccc cggcctgtac ggtaaaacgg tagggtacgc cgtgacgtat cacgcggagg 1020

      gattcctagt gtgcaagacc acagacactg tcaaaggaga aagagtctca ttccctgtat 1080

      gcacctacgt cccctcaacc atctgtgatc aaatgactgg catactagcg accgacgtca 1140

      caccggagga cgcacagaag ttgttagtgg gattgaatca gaggatagtt gtgaacggaa 1200

      gaacacagcg aaacactaac acgatgaaga actatctgct tccgattgtg gccgtcgcat 1260

      ttagcaagtg ggcgagggaa tacaaggcag accttgatga tgaaaaacct ctgggtgtcc 1320

      gagagaggtc acttacttgc tgctgcttgt gggcatttaa aacgaggaag atgcacacca 1380

      tgtacaagaa accagacacc cagacaatag tgaaggtgcc ttcagagttt aactcgttcg 1440

      tcatcccgag cctatggtct acaggcctcg caatcccagt cagatcacgc attaagatgc 1500

      ttttggccaa gaagaccaag cgagagttaa tacctgttct cgacgcgtcg tcagccaggg 1560

      atgctgaaca agaggagaag gagaggttgg aggccgagct gactagagaa gccttaccac 1620

      ccctcgtccc catcgcgccg gcggagacgg gagtcgtcga cgtcgacgtt gaagaactag 1680

      agtatcacgc aggtgcaggg gtcgtggaaa cacctcgcag cgcgttgaaa gtcaccgcac 1740

      agccgaacga cgtactacta ggaaattacg tagttctgtc cccgcagacc gtgctcaaga 1800

      gctccaagtt ggcccccgtg caccctctag cagagcaggt gaaaataata acacataacg 1860

      ggagggccgg ccgttaccag gtcgacggat atgacggcag ggtcctacta ccatgtggat 1920

      cggccattcc ggtccctgag tttcaggctt tgagcgagag cgccactatg gtgtacaacg 1980

      aaagggagtt cgtcaacagg aaactatacc atattgccgt tcacggaccc tcgctgaaca 2040

      ccgacgagga gaactacgag aaagtcagag ctgaaagaac tgacgccgag tacgtgttcg 2100

      acgtagataa aaaatgctgc gtcaagagag aggaagcgtc gggtttggtg ttggtgggag 2160

      agctaaccaa ccccccgttc catgaattcg cctacgaagg gctgaagatc aggccgtcgg 2220

      caccatataa gactacagta gtaggagtct ttggggttcc gggatcaggc aagtctgcta 2280

      ttattaagag cctcgtgacc aaacacgatc tggtcaccag cggcaagaag gagaactgcc 2340

      aggaaatagt caacgacgtg aagaagcacc gcggactgga catccaggca aaaacagtgg 2400

      actccatcct gctaaacggg tgtcgtcgtg ccgtggacat cctatatgtg gacgaggctt 2460

      tcgcttgcca tcccggtact ctgctagccc taattgctct tgttaaacct cggagcaaag 2520

      tggtgttatg cggagacccc aagcaatgcg gattcttcaa tatgatgcag cttaaggtga 2580

      acttcaacca caacatctgc actgaagtat gtcataaaag tatatccaga cgttgcacgc 2640

      gtccagtcac ggccatcgtg tctacgttgc actacggagg caagatgcgc acgaccaacc 2700

      cgtgcaacaa acccataatc atagacacca caggacagac caagcccaag ccaggagaca 2760

      tcgtgttaac atgcttccga ggctgggtaa agcagctgca gttggactac cgtggacacg 2820

      aagtcatgac agcagcagca tctcagggcc tcacccgcaa aggggtatac gccgtaaggc 2880

      agaaggtgaa tgaaaatccc ttgtatgccc ctgcgtcgga gcacgtgaat gtactgctga 2940

      cgcgcactga ggataggctg gtgtggaaaa cgctggccgg cgatccctgg attaaggtcc 3000

      tatcaaacat tccacagggt aactttacgg ccacattgga agaatggcaa gaagaacacg 3060

      acaaaataat gaaggtgatt gaaggaccgg ctgcgcctgt ggacgcgttc cagaacaaag 3120

      cgaacgtgtg ttgggcgaaa agcctggtgc ctgtcctgga cactgccgga atcagattga 3180

      cagcagagga gtggagcacc ataattacag catttaagga ggacagagct tactctccag 3240

      tggtggcctt gaatgaaatt tgcaccaagt actatggagt tgacctggac agtggcctgt 3300

      tttctgcccc gaaggtgtcc ctgtattacg agaacaacca ctgggataac agacctggtg 3360

      gaaggatgta tggattcaat gccgcaacag ctgccaggct ggaagctaga cataccttcc 3420

      tgaaggggca gtggcatacg ggcaagcagg cagttatcgc agaaagaaaa atccaaccgc 3480

      tttctgtgct ggacaatgta attcctatca accgcaggct gccgcacgcc ctggtggctg 3540

      agtacaagac ggttaaaggc agtagggttg agtggctggt caataaagta agagggtacc 3600

      acgtcctgct ggtgagtgag tacaacctgg ctttgcctcg acgcgacgtc acttggttgt 3660

      caccgctgaa tgtcacaggc gccgataggt gctacgacct aagtttagga ctgccggctg 3720

      acgccggcag gttcgacttg gtctttgtga acattcacac ggaattcaga atccaccact 3780

      accagcagtg tgtcgaccac gccatgaagc tgcagatgct tgggggagat gcgctacgac 3840

      tgctaaaacc cggcggcagc ctcttgatga gagcttacgg atacgccgat aaaatcagcg 3900

      aagccgttgt ttcctcctta agcagaaagt tctcgtctgc aagagtgttg cgcccggatt 3960

      gtgtcaccag caatacagaa gtgttcttgc tgttctccaa ctttgacaac ggaaagagac 4020

      cctctacgct acaccagatg aataccaagc tgagtgccgt gtatgccgga gaagccatgc 4080

      acacggccgg gtgtgcacca tcctacagag ttaagagagc agacatagcc acgtgcacag 4140

      aagcggctgt ggttaacgca gctaacgccc gtggaactgt aggggatggc gtatgcaggg 4200

      ccgtggcgaa gaaatggccg tcagccttta agggagaagc aacaccagtg ggcacaatta 4260

      aaacagtcat gtgcggctcg taccccgtca tccacgctgt agcgcctaat ttctctgcca 4320

      cgactgaagc ggaaggggac cgcgaattgg ccgctgtcta ccgggcagtg gccgccgaag 4380

      taaacagact gtcactgagc agcgtagcca tcccgctgct gtccacagga gtgttcagcg 4440

      gcggaagaga taggctgcag caatccctca accatctatt cacagcaatg gacgccacgg 4500

      acgctgacgt gaccatctac tgcagagaca aaagttggga gaagaaaatc caggaagcca 4560

      tagacatgag gacggctgtg gagttgctca atgatgacgt ggagctgacc acagacttgg 4620

      tgagagtgca cccggacagc agcctggtgg gtcgtaaggg ctacagtacc actgacgggt 4680

      cgctgtactc gtactttgaa ggtacgaaat tcaaccaggc tgctattgat atggcagaga 4740

      tactgacgtt gtggcccaga ctgcaagagg caaacgaaca gatatgccta tacgcgctgg 4800

      gcgaaacaat ggacaacatc agatccaaat gtccggtgaa cgattccgat tcatcaacac 4860

      ctcccaggac agtgccctgc ctgtgccgct acgcaatgac agcagaacgg atcgcccgcc 4920

      ttaggtcaca ccaagttaaa agcatggtgg tttgctcatc ttttcccctc ccgaaatacc 4980

      atgtagatgg ggtgcagaag gtaaagtgcg agaaggttct cctgttcgac ccgacggtac 5040

      cttcagtggt tagtccgcgg aagtatgccg catctacgac ggaccactca gatcggtcgt 5100

      tacgagggtt tgacttggac tggaccaccg actcgtcttc cactgccagc gataccatgt 5160

      cgctacccag tttgcagtcg tgtgacatcg actcgatcta cgagccaatg gctcccatag 5220

      tagtgacggc tgacgtacac cctgaacccg caggcatcgc ggacctggcg gcagatgtgc 5280

      atcctgaacc cgcagaccat gtggacctgg agaacccgat tcctccaccg cgcccgaaga 5340

      gagctgcata ccttgcctcc cgcgcggcgg agcgaccggt gccggcgccg agaaagccga 5400

      cgcctgcccc aaggactgcg tttaggaaca agctgccttt gacgttcggc gactttgacg 5460

      agcacgaggt cgatgcgttg gcctccggga ttactttcgg agacttcgac gacgtcctgc 5520

      gactaggccg cgcgggtgca tatattttct cctcggacac tggcagcgga catttacaac 5580

      aaaaatccgt taggcagcac aatctccagt gcgcacaact ggatgcggtc gaggaggaga 5640

      aaatgtaccc gccaaaattg gatactgaga gggagaagct gttgctgctg aaaatgcaga 5700

      tgcacccatc ggaggctaat aagagtcgat accagtctcg caaagtggag aacatgaaag 5760

      ccacggtggt ggacaggctc acatcggggg ccagattgta cacgggagcg gacgtaggcc 5820

      gcataccaac atacgcggtt cggtaccccc gccccgtgta ctcccctacc gtgatcgaaa 5880

      gattctcaag ccccgatgta gcaatcgcag cgtgcaacga atacctatcc agaaattacc 5940

      caacagtggc gtcgtaccag ataacagatg aatacgacgc atacttggac atggttgacg 6000

      ggtcggatag ttgcttggac agagcgacat tctgcccggc gaagctccgg tgctacccga 6060

      aacatcatgc gtaccaccag ccgactgtac gcagtgccgt cccgtcaccc tttcagaaca 6120

      cactacagaa cgtgctagcg gctgccacca agagaaactg caacgtcacg caaatgcgag 6180

      aactacccac catggactcg gcagtgttca acgtggagtg cttcaagcgc tatgcctgct 6240

      ccggagaata ttgggaagaa tatgctaaac aacctatccg gataaccact gagaacatca 6300

      ctacctatgt gaccaaattg aaaggcccga aagctgctgc cttgttcgct aagacccaca 6360

      acttggttcc gctgcaggag gttcccatgg acagattcac ggtcgacatg aaacgagatg 6420

      tcaaagtcac tccagggacg aaacacacag aggaaagacc caaagtccag gtaattcaag 6480

      cagcggagcc attggcgacc gcttacctgt gcggcatcca cagggaatta gtaaggagac 6540

      taaatgctgt gttacgccct aacgtgcaca cattgtttga tatgtcggcc gaagactttg 6600

      acgcgatcat cgcctctcac ttccacccag gagacccggt tctagagacg gacattgcat 6660

      cattcgacaa aagccaggac gactccttgg ctcttacagg tttaatgatc ctcgaagatc 6720

      taggggtgga tcagtacctg ctggacttga tcgaggcagc ctttggggaa atatccagct 6780

      gtcacctacc aactggcacg cgcttcaagt tcggagctat gatgaaatcg ggcatgtttc 6840

      tgactttgtt tattaacact gttttgaaca tcaccatagc aagcagggta ctggagcaga 6900

      gactcactga ctccgcctgt gcggccttca tcggcgacga caacatcgtt cacggagtga 6960

      tctccgacaa gctgatggcg gagaggtgcg cgtcgtgggt caacatggag gtgaagatca 7020

      ttgacgctgt catgggcgaa aaacccccat atttttgtgg gggattcata gtttttgaca 7080

      gcgtcacaca gaccgcctgc cgtgtttcag acccacttaa gcgcctgttc aagttgggta 7140

      agccgctaac agctgaagac aagcaggacg aagacaggcg acgagcactg agtgacgagg 7200

      ttagcaagtg gttccggaca ggcttggggg ccgaactgga ggtggcacta acatctaggt 7260

      atgaggtaga gggctgcaaa agtatcctca tagccatggc caccttggcg agggacatta 7320

      aggcgtttaa gaaattgaga ggacctgtta tacacctcta cggcggtcct agattggtgc 7380

      gttaatacac agaattctga ttggatccac catgaattac atccctacgc aaacgtttta 7440

      cggccgccgg tggcgcccgc gcccggcggc ccgtccctgg ccgttgcagg ccactccggt 7500

      ggctcccgtc gtccccgggc agctgttgaa ttttgacctt ctcaagctgg cgggagacgt 7560

      cgagtccaac cctgggccaa tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc 7620

      catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg 7680

      cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct 7740

      gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg 7800

      ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg aaggctacgt 7860

      ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg ccgaggtgaa 7920

      gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact tcaaggagga 7980

      cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg tctatatcat 8040

      ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca acatcgagga 8100

      cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg acggccccgt 8160

      gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag accccaacga 8220

      gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca ctctcggcat 8280

      ggacgagctg tacaagtaac tcgagttcac tagtcgatcc cgcggccgct ttcgaaccta 8340

      ggcaagcatg cgggcccagt gggtaattaa ttgaattaca tccctacgca aacgttttac 8400

      ggccgccggt ggcgcccgcg cccggcggcc cgtccctggc cgttgcaggc cactccggtg 8460

      gctcccgtcg tccccgactt ccaggcccag cagatgcagc aactcatcag cgccgtaaat 8520

      gcgctgacaa tgagacagaa cgcaattgct cctgctagga gcttaattcg acgaataatt 8580

      ggatttttat tttattttgc aattggtttt taatatttcc aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 8640

      aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaactaga aatcgcgatt 8700

      tctagtctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc 8760

      tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta 8820

      tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag 8880

      aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg 8940

      tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgaccctc aagtcaaagg 9000

      gggcgaaacc cgacaggact ataaaaatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcggg 9060

      cgctctcctg ttccaaccct gccgcttacc ggatacctgt ccccctttct cccttcggga 9120

      agcggggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc 9180

      tccaagctgg gctgtgtgca caaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt 9240

      aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 9300

      ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg 9360

      cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt 9420

      accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt 9480

      ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct 9540

      ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 9600

      gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt 9660

      aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt 9720

      gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc 9780

      gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg 9840

      cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 9900

      gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg 9960

      gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca 10020

      ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga 10080

      tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct 10140

      ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 10200

      cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca 10260

      accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata 10320

      cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct 10380

      tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact 10440

      cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 10500

      acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 10560

      atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 10620

      tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 10680

      aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 10740

      cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 10800

      atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 10860

      cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 10920

      gagcagattg tactgagagt gcaccattcg acgctctccc ttatgcgact cctgcattag 10980

      gaagcagccc agtagtaggt tgaggccgtt gagcaccgcc gccgcaagga atggtgcatg 11040

      caaggagatg gcgcccaaca gtcccccggc cacggggcct gccaccatac ccacgccgaa 11100

      acaagcgctc atgagcccga agtggcgagc ccgatcttcc ccatcggtga tgtcggcgat 11160

      ataggcgcca gcaaccgcac ctgtggcgcc ggtgatgccg gccacgatgc gtccggcgta 11220

      gaggatctgg ctagcgatga ccctgctgat tggttcgctg accatttccg ggtgcgggac 11280

      ggcgttacca gaaactcaga aggttcgtcc aaccaaaccg actctgacgg cagtttacga 11340

      gagagatgat agggtctgct tcagtaagcc agatgctaca caattaggct tgtacatatt 11400

      gtcgttagaa cgcggctaca attaatacat aaccttatgt atcatacaca tacgatttag 11460

      gtgacactat a 11471

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