本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種小麥太谷核不育基因ms2及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：植物雄性不育是一種常見的自然現(xiàn)象。雄性不育在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著十分廣泛的用途，包括雜種優(yōu)勢的利用，輪回選擇育種等，因此具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值。雄性不育通常受基因控制，按不育的顯隱性可分為顯性不育突變與隱性不育突變兩大類，其中顯性核不育突變更為少見，目前還沒有顯性核不育基因被圖位克隆的報道，因此還不清楚其敗育產(chǎn)生的機(jī)制。小麥?zhǔn)俏覈闹饕Z食作物，在小麥中已鑒定并命名的核不育基因有17個。ms1為隱性不育基因，位于4BS染色體上，它有7個等位基因。ms2(也有寫作Ms2)，即太谷核不育基因，顯性核不育基因，位于4DS染色體上。ms3，顯性核不育基因，位于5AS染色體上。ms4，顯性核不育基因，位于4DS染色體上，根據(jù)與著絲粒之間的重組距離判斷ms4不同于ms2。ms5，位于3A染色體上。光溫敏核不育基因wptms1(5B)、wptms2(2B)、wtms1(2B)分別位于5B、2B和2B染色體上。顯性核不育基因Ms1376和在雜交小麥中不育基因Shw尚未被定位。上述基因均尚未被克隆。太谷核不育小麥?zhǔn)俏覈萍既藛T高忠麗1972年在小麥高代品系繁殖田中發(fā)現(xiàn)的單顯性核基因天然突變體，其特點是雄性敗育穩(wěn)定、徹底、異交結(jié)實率高，穩(wěn)定性好，不受環(huán)境條件影響，是世界上發(fā)現(xiàn)的第一個小麥顯性核不育材料，在國內(nèi)外引起了很大的影響，被稱為我國的“國寶”，嚴(yán)禁對外交換與提供。1980年，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所的王琳清、鄧景陽先生將控制太谷核不育小麥性狀的基因分別命名為223、Tal。1986年該所的劉秉華先生等利用端體分析等方法將Tal定位到小麥4D染色體的短臂上距著絲點31.16個交換單位，同年國際小麥遺傳組織正式給予的基因符號為ms2。太谷核不育小麥?zhǔn)沁M(jìn)行輪回選擇育種的非常有價值的育種材料。自太谷核不育材料發(fā)現(xiàn)以來，我國成立了太谷核不育輪回選擇育種協(xié)作組，育成了一批優(yōu)良小麥新品種。劉秉華等(1991)利用我國特有的矮稈資源矮變一號(攜帶的矮稈基因為Rht10)與太谷核不育小麥做雜交，培育了矮敗小麥。在矮敗小麥中，矮稈基因Rht10與不育基因ms2緊密連鎖，因此，矮敗小麥?zhǔn)蔷哂邪捇驑?biāo)記的太谷核不育小麥，它繼承了太谷核不育小麥雄性敗育徹底、不育性穩(wěn)定、異交結(jié)實率高的優(yōu)點，克服了太谷核不育小麥早期育性難于鑒定的困難，同時也避免了輪選群體株高漸升的弊端，是理想的輪回選擇工具。利用矮敗小麥，劉秉華先生創(chuàng)立了矮敗小麥輪回選擇技術(shù)，構(gòu)建矮敗小麥高效育種平臺，利用矮敗小麥可以使數(shù)十個甚至上千個親本的基因進(jìn)行大規(guī)模的反復(fù)重組，并不斷優(yōu)化，進(jìn)而使群體得到改良，極大地提高育種效率。矮敗小麥創(chuàng)制以來，利用矮敗小麥高效育種方法育成國家或省級審定新品種42個，累計推廣1.85億畝，累計增產(chǎn)小麥56億 公斤，創(chuàng)造了巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益?！鞍珨⌒←溂捌涓咝вN方法的創(chuàng)建與應(yīng)用”獲2010年國家科技進(jìn)步一等獎。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種小麥太谷核不育基因ms2及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自矮敗小麥，命名為ms2蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物雄性不育和/或致死相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述ms2蛋白的基因(命名為ms2基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因具體可為如下1)或2)或3)的DNA分子：1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物雄性不育和/或致死相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼植物植物雄性不育和/或致死相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6×SSC、0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。含有所述ms2基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有ms2基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’ 端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用ms2基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或組成型啟動子或組織特異性啟動子(例如花粉特異性啟動子)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用ms2基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以表型篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體具體可為重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-ms2。重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-ms2的構(gòu)建方法具體如下：(1)以矮敗小麥的花藥的cDNA為模板，采用F1和R1組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；F1：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGCAGGGCACCACAG-3’；R1：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAACTTGAGAATGCTG-3’；(2)使步驟(1)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與入門載體pDONRTM/Zeo發(fā)生BP反應(yīng)，得到含有序列表的序列2所示雙鏈DNA分子的重組質(zhì)粒。(3)取步驟(2)得到的重組質(zhì)粒，使其與目標(biāo)載體pGW-CUbi1390發(fā)生LR反應(yīng)，得到在目標(biāo)載體pGW-CUbi1390中插入序列表的序列2所示雙鏈DNA分子的重組質(zhì)粒，即為重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-ms2。目標(biāo)載體pGW-CUbi1390的構(gòu)建方法：用限制性內(nèi)切酶PmlI酶切pCUbi1390載體，得到線性化載體；利用VectorConversionSystem，將gatewaycasseteA(平端)連入線性化載體，得到目標(biāo)載體pGW-CUbi1390。本發(fā)明還保護(hù)所述ms2蛋白的應(yīng)用，為如下(c1)至(c5)中的至少一種：(c1)促使植物發(fā)生雄性不育；(c2)致死植物組織；(c3)致死植物花藥；(c4)致死植物花粉；(c5)致死植物。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為小麥，例如Fielder小麥。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將所述ms2基因?qū)肽康闹参镏?，得到? 性不育的轉(zhuǎn)基因植物。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為小麥，例如Fielder小麥。所述方法中，所述ms2基因由花藥特異性啟動子或花粉特異性啟動子驅(qū)動表達(dá)。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將特異表達(dá)盒導(dǎo)入目的植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；所述特異表達(dá)盒中，由組織特異性啟動子驅(qū)動所述ms2基因的表達(dá)；所述轉(zhuǎn)基因植物中，與所述組織特異性啟動子對應(yīng)的組織被致死。所述組織特異性啟動子具體可為花藥特異性啟動子或花粉特異性啟動子。所述轉(zhuǎn)基因植物具體可為具有雄性不育表型的植物。所述植物可為單子葉植物或雙子葉植物。所述單子葉植物具體可為小麥，例如Fielder小麥。本發(fā)明還保護(hù)所述ms2蛋白、所述ms2基因、所述重組表達(dá)載體、所述表達(dá)盒、所述轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、所述重組菌或所述方法，在植物育種中的應(yīng)用。所述植物育種的目的為培育雄性不育植物或特異組織被致死的植物。所述特異組織具體可為花藥或花粉。作為基因符號，ms2基因早就被提出來了，但其序列一直未被發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明提供了具有致死作用的ms2蛋白及其編碼基因，用花藥特異性啟動子或花藥特異性啟動子驅(qū)動ms2基因在出發(fā)植物中表達(dá)，可以獲得具有雄性不育表型的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明對于植物育種具有重大價值。附圖說明圖1為雄性可育單株和雄性不育單株花藥的形態(tài)和開花時穗子形態(tài)。圖2為雄性可育單株和雄性不育單株花藥發(fā)育減速分裂時期的顯微結(jié)構(gòu)。圖3為雄性可育單株和雄性不育單株花藥表面掃描電鏡圖。圖4為矮敗小麥/中國春小麥近等基因系BAC文庫插入片段脈沖電泳檢測及插入片段頻率分布圖。圖5為太谷核不育基因區(qū)域物理圖譜構(gòu)建及比較分析。圖6為ms2基因在太谷核不育小麥近等基因系中的表達(dá)分析。圖7為ms2基因的結(jié)構(gòu)示意圖。圖8為實施例4中ms2基因的致死效應(yīng)的結(jié)果；A：再生培養(yǎng)過程中的照片；B：PCR鑒定結(jié)果，泳道N代表以水為模板的空白對照。圖9為實施例5中ms2基因與雄性不育的關(guān)系的結(jié)果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。太谷核不育小麥：參考文獻(xiàn)：鄧景揚(yáng)，高忠麗，小麥顯性核不育基因的發(fā)現(xiàn)與利用-太谷核不育小麥鑒定總結(jié)，作物學(xué)報，1980，(2)：85-98；公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研 究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。中國春小麥(ChineseSpring)：參考文獻(xiàn)：P.Sourdille,T.Cadalen,H.Guyomarc'h,J.Snape,M.Perretant,G.Charmet,C.Boeuf,S.BernardandM.Bernard.(2003)AnupdateoftheCourtot×ChineseSpringintervarietalmolecularmarkerlinkagemapfortheQTLdetectionofagronomictraitsinwheat.TheoreticalandAppliedGenetics106(3):530-538；公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。矮敗小麥：參考文獻(xiàn)：劉秉華,楊麗.“矮敗”小麥的選育及利用前景.科學(xué)通報,1991,36(4):306-308.；公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。Fielder小麥(TriticumaestivumL.)：YujiIshida,MasakoTsunashima,YukohHiei,ToshihikoKomari；Wheat(TriticumaestivumL.)transformationusingimmatureembryos.；MethodsinMolecularBiology,Volume1223,2015,pp189-198；Editors:KanWang；Publisher:Springer,NewYork；doi:10.1007/978-1-4939-1695-5_15；公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。BPIIEnzymemix為LifeTechnologies的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為11789-020。LRIIEnzymemix為LifeTechnologies的產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為11791-020。VectorConversionSystem為LifeTechnologies的產(chǎn)品,產(chǎn)品目錄號為11828-019。入門載體pDONRTM/ZeoVector為LifeTechnologies的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為12535-035。大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞為北京全式金生物技術(shù)有限公司的產(chǎn)品。根癌農(nóng)桿菌EHA105為北京華越洋生物科技有限公司的產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為GX0133-100。Zeocin即博來霉素。pCUbi1390載體：參考文獻(xiàn)：彭昊.利用T-DNA插入突變和RNA干擾技術(shù)研究水稻基因功能.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文P43-44.2005；公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實驗所用，不可作為其它用途使用。實施例1、近等基因系的獲得一、太谷核不育小麥/中國春近等基因系的獲得1、將太谷核不育小麥(母本)和中國春(父本)進(jìn)行雜交，收獲子代。2、將步驟1收獲的子代中的雄性不育株(母本)和中國春(父本)進(jìn)行回交，收獲子代。3、將步驟2收獲的子代中的雄性不育株(母本)和中國春(父本)進(jìn)行回交，收獲子代。4、將步驟3收獲的子代中的雄性不育株(母本)和中國春(父本)進(jìn)行回交，收獲子代。5、將步驟4收獲的子代中的雄性不育株(母本)和中國春(父本)進(jìn)行回交，收獲子代。6、將步驟5收獲的子代中的雄性不育株(母本)和中國春(父本)進(jìn)行回交，收獲子代。7、將步驟6收獲的子代中的雄性不育株(母本)和中國春(父本)進(jìn)行回交，收獲子代。8、將步驟7收獲的子代中的雄性不育株(母本)和中國春(父本)進(jìn)行回交，收獲子代。9、將步驟8收獲的子代中的雄性不育株(母本)和中國春(父本)進(jìn)行回交，收獲子代。10、將步驟9收獲的子代中的雄性不育株(母本)和中國春(父本)進(jìn)行回交，收獲子代。11、將步驟10收獲的子代中的雄性不育株(母本)和中國春(父本)進(jìn)行回交，收獲子代(該子代群體即為太谷核不育小麥/中國春近等基因系)。二、其他近等基因系的獲得采用不同的父本和/或母本，其他同步驟一。實施例2、花藥發(fā)育的形態(tài)及顯微和電鏡結(jié)構(gòu)觀察在太谷核不育小麥/中國春近等基因系植株的旗葉抽出后，分別采集雄性可育單株和雄性不育單株的不同長度的小麥幼穗，利用體式顯微鏡觀察花藥發(fā)育不同時期的形態(tài)。照片見圖1。在幼穗小于3cm時(花藥由花藥原基逐漸分化出五層細(xì)胞)，雄性不育株和雄性可育株的小穗中花藥的形態(tài)相似，無明顯差異。在3.2cm幼穗中(花藥五層細(xì)胞已分化完全，花粉母細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂前期)，雄性不育株和雄性可育株的花藥的顏色、花藥大小表現(xiàn)出差異。在4.5cm幼穗中(花粉母細(xì)胞即將完成減數(shù)分裂)，雄性不育株和雄性可育株的花藥的顏色、花藥大小差異更加明顯，雄性可育株花藥繼續(xù)發(fā)育，而雄性不育株花藥的大小不再變化。在10cm幼穗中(花藥中小孢子發(fā)育成熟)，雄性可育株花藥即將成熟開裂，雄性不育株花藥已經(jīng)完全干癟退化。散粉時，觀察雄性不育株和雄性可育株成熟的穗子和花藥，可以看出雄性不育株的穗子蓬松、穎殼保持張開、沒有花藥，雄性可育株開花正常、花絲伸長好、花藥正常散粉、散粉后穎殼閉合。分別取太谷核不育小麥/中國春近等基因系中的雄性可育單株和雄性不育單株，對生長至不同長度的小穗進(jìn)行固定，觀察花藥在不同發(fā)育時期半薄切片的結(jié)果。照片見圖2(A-E：可育單株；F-J：不育單株；A，F(xiàn)：細(xì)線期；B，G：雙線期；C，H：減數(shù)分裂I中期；D，I：二分體；E，J：單核液泡化中期；Bar＝50μM)。當(dāng)花藥發(fā)育至減數(shù)分裂I前期時(圖2A、2B、2F、2G)，雄性可育株和雄性不育株的花藥在結(jié)構(gòu)上沒有區(qū)別，雄性不育株的花藥同樣可以正常分化出表皮、藥室內(nèi)壁、中層、絨氈層和花粉母細(xì)胞五層細(xì)胞，雄性可育株和雄性不育株的花藥的各層細(xì)胞發(fā)育都沒有明顯差異。當(dāng)花藥發(fā)育至減數(shù)分裂I中期時(圖2C、2H)：雄性可育株的花藥中花粉母細(xì)胞形成紡錘體，染色體排列于赤道面上，細(xì)胞沿紡錘體兩極延伸，其余四層細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整排列整齊；雄性不育株的花藥的結(jié)構(gòu)形態(tài)則產(chǎn)生了明顯異常，花粉母 細(xì)胞的形狀不規(guī)則，紡錘體雖然形成但是結(jié)構(gòu)不清晰，中層細(xì)胞提前退化，從這一時期開始不育花藥的發(fā)育明顯受到了影響。當(dāng)花藥發(fā)育至減數(shù)分裂I末期即二分體時期時(圖2D、2I)：雄性可育株花藥花粉母細(xì)胞形成二分體，其余四層細(xì)胞結(jié)構(gòu)均完整；雄性不育株花藥的各層細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生了劇烈的變異，大部分二分體細(xì)胞逐漸解體，中層細(xì)胞消失，表皮、藥室內(nèi)壁、絨氈層的細(xì)胞向藥室內(nèi)塌陷，雄性不育株花藥無法完成減數(shù)分裂過程。當(dāng)雄性可育株花藥發(fā)育至單核小孢子時期時(2E)，雄性不育株花藥的花粉母細(xì)胞連同中層以及絨氈層都已經(jīng)逐漸退化消失(2J)，只剩下萎縮在一起的藥室內(nèi)壁和表皮。分別取太谷核不育小麥/中國春近等基因系中的雄性可育單株和雄性不育單株，對來自4-6cm幼穗的花藥表面進(jìn)行電鏡掃描觀察。照片見圖3(A，C:4cm可育幼穗的花藥；E，G:4cm可育幼穗的花藥表面的局部放大；B，D:6cm不育幼穗的花藥；F，H:6cm不育幼穗的花藥表面的局部放大)。來自4cm幼穗的雄性不育株花藥比雄性可育株花藥略小，但是花藥外壁結(jié)構(gòu)并無明顯差異。來自6cm幼穗的雄性可育株與雄性不育株花藥大小以及外壁結(jié)構(gòu)有明顯差異，雄性可育株花藥長度約為雄性不育株花藥的2倍，并且花藥外壁有大量角質(zhì)累積，雄性不育株花藥外壁仍光滑。實施例3、太谷核不育基因(ms2基因)的發(fā)現(xiàn)過程一、以矮敗小麥/中國春近等基因系為材料構(gòu)建BAC文庫。將矮敗小麥/中國春小麥近等基因系的種子置于濕潤的濾紙上，并于培養(yǎng)皿內(nèi)萌發(fā)，萌發(fā)的種子播種于營養(yǎng)土中，生長一周后噴灑50ppm的赤霉酸(GA3)處理幼苗，一周后即可區(qū)分出矮稈植株和高稈植株。當(dāng)幼苗生長到三周后，取矮稈植株幼苗迅速用液氮冷凍，保存于超低溫冰箱中備用。提取高質(zhì)量大片段基因組DNA，經(jīng)HindIII部分酶切、100-400kb的DNA片段選擇、電洗脫、DNA與載體pIndigoBAC-5(Epicentre,BACH095H)的連接、連接產(chǎn)物的電轉(zhuǎn)化(將2μl連接產(chǎn)物與18-20μlGibcoBRL公司的ElectroMaxDH10BTM感受態(tài)細(xì)胞混勻，加入到經(jīng)過處理的電轉(zhuǎn)化杯中進(jìn)行，采用GibcoBRL公司的Cell-PoratorElectroporationSystem進(jìn)行轉(zhuǎn)化)、電擊，結(jié)束后將墊片中的感受態(tài)細(xì)胞取出，加入1mlSOC培養(yǎng)基中，于37℃，225rpm下復(fù)蘇1小時，取適量復(fù)蘇液涂布于含有12.5μg/ml的氯霉素(CMR)、14μg/mlIPTG和60μg/mlX-gal的LB固體選擇培養(yǎng)基(X/I/C)表面，于37℃培養(yǎng)24-36小時。利用所建立的高效BAC文庫轉(zhuǎn)化體系將上述連接液進(jìn)行大量轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后每250μlSOC復(fù)蘇液涂一塊平板，以使其生長的克隆數(shù)在2500左右。用LB液體選擇培養(yǎng)基將菌落全部沖洗下來，混勻后加甘油使其終濃度達(dá)到15％制成BAC混合池?？偣彩占?97個BAC混合池。矮敗/中國春近等基因系BAC文庫約有1945460個BAC克隆，平均插入片段為118Kb(見圖4；圖4中，A為BAC文庫插入片段脈沖電泳檢測，M為LamdaladderPFGMarker，Vector為帶有HindIII克隆位點的pIndigoBAC-5；圖4中，B為BAC文庫插入片段頻率分布圖)，覆蓋小麥基因組 的大約12.7倍。利用PCR方法，依據(jù)小麥與水稻和短柄草共線性關(guān)系，選擇目標(biāo)基因區(qū)域內(nèi)的基因，設(shè)計4D特異的引物，用于BAC文庫的篩選。構(gòu)建BACshotgun文庫和BAC亞克隆測序。利用BigDyeTerminatorV3.1CycleSequencingKit，在ABI3730XL測序儀上進(jìn)行測序(AppliedBiosystems,Foster,CA)。每個BAC測10倍以上的覆蓋率，用Lasergenesuite7.1中的SeqMan軟件(DNASTAR,Madison,AL)對序列進(jìn)行組裝。二、太谷核不育基因(ms2基因)的克隆1、在目標(biāo)基因區(qū)域開發(fā)新的分子標(biāo)記基因圖位克隆的關(guān)鍵是不斷尋找在遺傳距離上逐漸靠近目標(biāo)基因的分子標(biāo)記。太谷核不育基因位于小麥4DS染色體上，該染色體在小麥中多態(tài)性最低，因此開發(fā)新的分子標(biāo)記逼近ms2基因的難度非常大。主要是通過與水稻、短柄草、粗山羊草D基因組序列比對分析、BAC文庫篩選及BAC亞克隆測序、目標(biāo)區(qū)段基因及基因間的PCR擴(kuò)增測序、太谷核不育近等基因系RNA-Seq測序的方法，開發(fā)SSR、ISBP、SNP等分子標(biāo)記來逼近目標(biāo)基因。2、太谷核不育基因區(qū)域物理圖譜的構(gòu)建及候選基因確定利用目標(biāo)基因兩側(cè)的分子標(biāo)記S1102和S1277比對水稻和短柄草基因組序列，將目標(biāo)基因鎖定在水稻第9染色體22660725bp-22719930bp,(即在59.2kb區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間共有17個基因)，對應(yīng)短柄草的43385015-43444531bp(即在59.5kb區(qū)間內(nèi)，該區(qū)間共有14個基因，這一區(qū)段對應(yīng)粗山羊草D基因組高密度遺傳圖第4染色體bin2-bin5之間的scaffold)。利用上述共線性區(qū)段內(nèi)的水稻、短柄草基因序列，比對粗山羊草D基因組的序列草圖獲得scaffold序列，利用所獲得的scaffold序列開發(fā)了707對SSR引物，其中Am3近等基因系可育池和不育池之間具有多態(tài)性引物79個。利用這些SSR標(biāo)記對Am3近等基因系群體的重組單株進(jìn)行檢測，將ms2基因鎖定在5個scaffold序列的區(qū)段之內(nèi)，其中M3和M7標(biāo)記與ms2基因之間的遺傳距離為0，為進(jìn)一步逼近ms2基因，進(jìn)一步擴(kuò)大群體以重組單株數(shù)目表示標(biāo)記逼近目標(biāo)基因的情況(見圖5)。在Am3大群體中2-0-1重組的標(biāo)記位于D基因組的3個scaffold中(S7071、S118155、S80695)，對應(yīng)六倍小麥矮敗中國春的BACE18和N6。再結(jié)合中國春各條染色體的測序結(jié)果(https://urgi.versailles.inra.fr/blast/blast.php)，共在2-0-1重組區(qū)段的序列內(nèi)預(yù)測出20余個基因。將這些基因比對太谷核不育小麥近等基因系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)在目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的20多個預(yù)測基因中只有1個基因表達(dá)量存在顯著差異。利用RT-PCR和Real-timePCR對該基因在太谷核不育小麥/中國春近等基因系、太谷核不育小麥/豫麥18近等基因系、太谷核不育小麥/偃展1號近等基因系及太谷核不育小麥/鄭麥98近等基因系的雄性可育株與雄性不育株花藥中的表達(dá)量差異進(jìn)行進(jìn)一步的驗證，該基因在雄性可育株花藥中幾乎不表達(dá)，在雄性不育株花藥中高表達(dá)(見圖6：A-D:RT-PCR結(jié)果；E-H:Real-timePCR結(jié)果；1：雄性可育株花藥；2：雄性不育株花藥；A,E:太谷核不育小 麥/中國春近等基因系；B,F:太谷核不育小麥/豫麥18近等基因系；C,G:太谷核不育小麥/偃展1號近等基因系；D,H:太谷核不育小麥/鄭麥98近等基因系)，因此推測該基因即為ms2基因。3、太谷核不育基因的序列與結(jié)構(gòu)分析ms2基因的開放閱讀框如序列表的序列2所示(882bp)，編碼序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)(由293個氨基酸殘基組成)。ms2基因全長為4078bp，由8個外顯子組成，基因結(jié)構(gòu)如圖7所示(方框代表外顯子，實線代表內(nèi)含子)。ms2基因與粗山羊草基因序列同源性為99％，與烏拉爾圖小麥基因序列的同源性為89％。雖然ms2與烏拉爾圖小麥對應(yīng)的基因序列有較高的相似性，但預(yù)測出的基因編碼區(qū)差異很大，編碼的蛋白相似性很低。通過與NCBI數(shù)據(jù)中的DNA與蛋白序列的比對分析，ms2基因序列及其編碼的蛋白序列與其他物種的基因及蛋白均既沒有同源性，也不含有保守的結(jié)構(gòu)域，是一個特殊結(jié)構(gòu)的基因。實施例4、ms2基因的致死效應(yīng)一、重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-ms2的構(gòu)建1、attB引物設(shè)計設(shè)計并合成如下引物：F1：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGCAGGGCACCACAG-3’；R1：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTTCAACTTGAGAATGCTG-3’。F1中的下劃線標(biāo)注attB1重組位點，R1中的下劃線標(biāo)注attB2重組位點。2、提取矮敗小麥的花藥的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。3、以步驟2得到的cDNA為模板，采用F1和R1組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。經(jīng)測序，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中，attB1重組位點和attB2重組位點之間的核苷酸如序列表的序列2所示。4、進(jìn)行BP反應(yīng)，得到BP反應(yīng)產(chǎn)物。BP反應(yīng)體系：步驟3得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物25ng、入門載體pDONRTM/Zeo40ng、BPIIEnzymemix0.3μL，加滅菌ddH2O補(bǔ)足體系至2.5μL。BP反應(yīng)程序：25℃反應(yīng)10h。5、將2.5μL步驟4得到的BP反應(yīng)產(chǎn)物加入到30μL大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞液中，冰浴15min，42℃熱激90s，然后迅速置于冰上2min；加入500μLSOC培養(yǎng)基，在37℃、225rpm條件下復(fù)蘇50min，得到復(fù)蘇液；將復(fù)蘇液均勻涂布于含30μg/mL博來霉素的LB固體培養(yǎng)基表面，37℃倒置培養(yǎng)過夜。入門載體pDONRTM/Zeo自身帶有致死基因，攜帶入門載體pDONRTM/Zeo的重組菌不能在培養(yǎng)基上生存，通過BP反應(yīng)目標(biāo)基因片段會取代 致死基因，所以在培養(yǎng)基上生存的重組菌即為含有序列表的序列2所示的目標(biāo)基因的入門克隆(entryclone)。6、取步驟5得到的入門克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙向測序驗證，測序驗證所用引物為入門載體pDONRTM/Zeo通用引物，序列如下：M13F：5’-GTAAAACGACGGCCAG-3’；M13R：5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’。經(jīng)測序驗證正確的具有序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子的重組質(zhì)粒命名為入門質(zhì)粒。7、進(jìn)行LR反應(yīng)，得到LR反應(yīng)產(chǎn)物。目標(biāo)載體pGW-CUbi1390的構(gòu)建：用限制性內(nèi)切酶PmlI(平末端酶)酶切pCUbi1390載體，得到線性化載體；利用VectorConversionSystem，將gatewaycasseteA(平端)連入線性化載體(具體的方法為VectorConversionSystem標(biāo)準(zhǔn)流程，可從LifeTechnologies主頁下載)，得到目標(biāo)載體pGW-CUbi1390。LR反應(yīng)體系：入門質(zhì)粒25ng、目標(biāo)載體pGW-CUbi139040ng、LRIIEnzymemix0.3μL，加滅菌ddH2O補(bǔ)足體系至2.5μL。LR反應(yīng)程序：25℃反應(yīng)10h。8、將2.5μL步驟7得到的LR反應(yīng)產(chǎn)物加入30μL大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞液中，冰浴15min，42℃熱激90s，然后迅速置于冰上2min；加入500μLSOC培養(yǎng)基，在37℃、225rpm條件下復(fù)蘇50min，得到復(fù)蘇液；將復(fù)蘇液均勻涂布于含50μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基表面，37℃倒置培養(yǎng)過夜。目標(biāo)載體pGW-CUbi1390自身帶有致死基因，攜帶目標(biāo)載體pGW-CUbi1390的重組菌不能在培養(yǎng)基上生存，通過LR反應(yīng)目標(biāo)基因片段會取代致死基因，所以在培養(yǎng)基上生存的重組菌即為含有序列表的序列2所示的目標(biāo)基因的目標(biāo)克隆(Destiantionclone)。9、取步驟8得到的目標(biāo)克隆，提取質(zhì)粒并進(jìn)行雙向測序驗證，測序驗證所用引物為pGW-CUbi1390載體插入片段兩端啟動子區(qū)及終止區(qū)引物，序列如下：Pubi：5’-TTTGTCGATGCTCACCCTG-3’；Tnos：5’-TTGCCAAATGTTTGAACGA-3’。將經(jīng)測序驗證正確的具有序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子的重組質(zhì)粒命名為pGW-CUbi1390-ms2。重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-ms2中，由玉米Ubiquitin啟動子(組成型啟動子)驅(qū)動ms2基因超表達(dá)。二、重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-gus的構(gòu)建用序列表的序列3所示的gus基因代替序列表的序列2所示的ms2基因，其他同步驟一，得到重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-gus。三、轉(zhuǎn)ms2基因試驗采用PureWheat方法進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥遺傳轉(zhuǎn)化(YujiIshida,MasakoTsunashima,YukohHiei,ToshihikoKomariWheat(TriticumaestivumL.)transformationusingimmatureembryos.MethodsinMolecularBiology,Volume1223,2015,pp189-198；Editors:KanWang；Publisher:Springer,NewYork；doi:10.1007/978-1-4939-1695-5_15)，將重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-ms2導(dǎo)入Fielder小麥的胚性愈傷組織，具體步驟如下：1、將重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-ms2導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌EHA105，得到重組農(nóng)桿菌。2、Fielder小麥開花15天后，取種子，用1％次氯酸鈉水溶液消毒10分鐘后取幼胚。3、完成步驟2后，取幼胚，在步驟1得到的重組農(nóng)桿菌的菌懸液中室溫浸泡5min。4、完成步驟3后，取幼胚，23℃、黑暗條件下共培養(yǎng)5天。5、完成步驟4后，取幼胚，25℃、黑暗條件下恢復(fù)培養(yǎng)5天。6、完成步驟5后，取幼胚，先置于25℃、黑暗條件下篩選14天，再置于25℃、黑暗條件下篩選21天。篩選采用草銨膦進(jìn)行，第一次篩選的草銨膦濃度為5mg/L，第二次篩選的草銨膦濃度為10mg/L。此時，愈傷組織增殖，開始形成幼芽。8、完成步驟7后，取具有幼芽的幼胚，25℃、光照(68μmol/m2/s)條件下進(jìn)行再生培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)所有幼芽均不能繼續(xù)生長，導(dǎo)致不能獲得再生幼苗。照片見圖8A的左圖。9、取步驟8中不能繼續(xù)生長的幼芽，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板，采用F2和R2組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定，以檢測ms2基因的表達(dá)情況。采用Tubulin基因為內(nèi)參基因(用于檢測內(nèi)參基因的引物對由F3和R3組成)。PCR鑒定的部分結(jié)果見圖8B的泳道1至3(泳道1至3代表不同的幼芽)。不能繼續(xù)生長的幼芽中均具有ms2基因的表達(dá)。F2：5’-CTGCTGCATCCGACTAACTATC-3’；R2：5’-TGAGAATACTGTCCACCAAACTC-3’。F3：5’-TGAGGACTGGTGCTTACCGC-3’；R3：5’-GCACCATCAAACCTCAGGGA-3’。結(jié)果表明，ms2基因具有致死效應(yīng)。四、轉(zhuǎn)Gus基因試驗用重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-gus代替重組質(zhì)粒pGW-CUbi1390-ms2，步驟1至8同步驟三的步驟1至8。進(jìn)行步驟8的再生培養(yǎng)時，所有幼芽均能繼續(xù)生長并獲得再生植株。照片見圖8B的右圖。9、取步驟8中能繼續(xù)生長的幼芽，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板，采用F2和R2組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定，以檢測ms2基因的表達(dá)情況。采用Tubulin基因為內(nèi)參基因(用于檢測內(nèi)參基因的引物對由F3和R3組成)。結(jié)果見圖8B的泳道4。能繼續(xù)生長的幼芽中均不具有ms2基因的表達(dá)。實施例5、ms2基因與雄性不育的關(guān)系由于矮敗小麥中的矮桿基因和太谷核不育基因緊密連鎖，矮敗小麥本身的后代中所有矮桿植株的花藥均敗育，不能產(chǎn)生花粉自交結(jié)實。為了再次驗證確實是ms2基因的超表達(dá)引起了花藥的敗育，進(jìn)行EMS誘變的實驗，具體步驟如下：一、配制溶液pH7.0磷酸緩沖液配制：取60ml溶液A和40ml溶液B混合，即pH7.0磷酸緩沖液；溶液A：磷酸氫二鈉9.456克，加水至1000ml；溶液B：磷酸二氫鉀9.07克，加水至1000ml。0.6％EMS處理液配制：取24ml甲基磺酸乙酯，溶于4LpH7.0磷酸緩沖液。0.8％EMS處理液配制：取32ml甲基磺酸乙酯，溶于4LpH7.0磷酸緩沖液。二、EMS誘變采用的種子為矮敗小麥(母本)與中國春小麥(父本)的雜交種子。1、取種子，用水室溫浸泡12小時(2015年3月8日7:00至19:00)。2、完成步驟1后，將種子分為三組，第一組的7200粒種子用0.6％EMS處理液室溫浸泡16小時(3月8日19：00至3月9日11:00)，第二組的4300粒種子用0.8％EMS處理液室溫浸泡16小時(3月8日19：00至3月9日11:00)，第三組的700粒種子用pH7.0磷酸緩沖液室溫浸泡16小時(3月8日19：00至3月9日11:00)。3、完成步驟2后，取種子，用水洗滌16小時。4、完成步驟3后，播種，并于播種30天后進(jìn)行出苗率統(tǒng)計。第一組出苗4431株，致死率(100％-4431/7200)＝38.5％。第二組出苗2214株，致死率(100％-2214/4300)＝48.5％。第三組出苗700株，致死率＝0％。5、對步驟4得到的7345株小麥進(jìn)行花藥形態(tài)的觀察以及結(jié)實率的統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)多個矮桿植株能夠長出含有花粉的花藥，套袋后可自交結(jié)實。第三組得到的700株小麥中的矮桿小麥的自交結(jié)實率為0。第一組和第二組得到的6645株小麥中，368株矮桿小麥的自交結(jié)實率大于0(9株的自交結(jié)實率大于50％，54株的自交結(jié)實率達(dá)到20％-50％，64株的自交結(jié)實率在10％-20％之間，241株的自交結(jié)實率小于10％)，均在一定程度上恢復(fù)了雄性育性。從第一組和第二組得到的6645株小麥中，隨機(jī)取11株自交結(jié)實率大于0、花藥形態(tài)正常的矮桿小麥，剝?nèi)』ㄋ帲崛】俁NA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板檢測ms2基因的表達(dá)水平(方法同實施例4的步驟三的9)。結(jié)果見圖9。圖9中，1至11代表6645株小麥中的11株自交結(jié)實率大于0、花藥形態(tài)正常的矮桿小麥，12代表6645株小麥中的一株不育單株，13代表中國春小麥，14代表水。結(jié)果顯示，11株育性恢復(fù)的矮桿小麥中均檢測不到ms2基因的表達(dá)，說明當(dāng)ms2基因不表達(dá)時小麥的雄性育性得以恢復(fù)。當(dāng)前第1頁1 2 3