本發(fā)明涉及蛋白領(lǐng)域，特別涉及一種肽及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

衰老，乃是指機(jī)體各器官功能普遍的、逐漸降低的過(guò)程。衰老有兩種不同的情況，一種是正常情況下出現(xiàn)的生理性衰老；另一種是疾病引起的病理性衰老。是一種自然規(guī)律。但是，當(dāng)人們采用良好的生活習(xí)慣和保健措施，就可以有效地延緩衰老，提高生活質(zhì)量。中醫(yī)理論認(rèn)為，人體的生長(zhǎng)、發(fā)育、衰老與臟腑功能和經(jīng)絡(luò)氣血的盛衰關(guān)系密切。當(dāng)機(jī)體氣血不足，經(jīng)絡(luò)之氣運(yùn)行不暢，臟腑功能減退，陰陽(yáng)失去平衡，均會(huì)導(dǎo)致和加快衰老，表現(xiàn)為精神不振、健忘、形寒肢冷、納差少眠、腰膝無(wú)力、發(fā)脫齒搖、氣短乏力，甚則面浮腫等。千百年來(lái)，人們一直在探索健康長(zhǎng)壽的奧秘，充滿對(duì)青春長(zhǎng)駐、延年益壽的向往。

探索衰老發(fā)生的機(jī)理既是一個(gè)古老的問(wèn)題，又是一個(gè)嶄新的科研領(lǐng)域，在醫(yī)學(xué)漫長(zhǎng)的歷史發(fā)展過(guò)程中，有人認(rèn)為總共提出過(guò)數(shù)百個(gè)衰老的假說(shuō)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)在抗衰老方面積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)，提出了“陰陽(yáng)失調(diào)說(shuō)”、“臟腑虛衰說(shuō)”、“精氣神虧耗學(xué)說(shuō)”等等，滲透著對(duì)自然界宏觀的認(rèn)識(shí)。國(guó)外的古代醫(yī)學(xué)家和哲學(xué)家也從不同角度解釋衰老，提出溫?zé)釋W(xué)說(shuō)、熵學(xué)說(shuō)、磨損學(xué)說(shuō)、自家中毒學(xué)說(shuō)等，對(duì)于人們認(rèn)識(shí)衰老起到積極的作用。但因歷史條件與科學(xué)水平的限制，這些學(xué)說(shuō)有很大的局限性。

現(xiàn)代研究表明，皮膚衰老反映在細(xì)胞水平即為細(xì)胞衰老，而成纖維細(xì)胞是真皮中的主體成分，它的衰老及生物學(xué)特性的改變是導(dǎo)致皮膚老化出現(xiàn)的重要原因。目前，大多都是通過(guò)在外用化妝品中添加表皮生長(zhǎng)因子(EGF)來(lái)改善皮膚，其具有一定的效果。但是因?yàn)榧夹g(shù)等原因，EGF原料的生產(chǎn)供應(yīng)難以滿足不斷增長(zhǎng)的需求，EGF的價(jià)格一直居高不下，不僅嚴(yán)重制約了EGF的臨床研究和臨床應(yīng)用，也限制了EGF化妝品在消費(fèi)人群中的進(jìn)一步推廣。因此，開(kāi)發(fā)一種高效的表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)激活分子不僅具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也為EGF研究開(kāi)發(fā)出更廣闊的應(yīng)用前景提供了最基本的保障。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明提供一種肽及其應(yīng)用。該肽能有效促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖，抗皮膚衰老，同時(shí)還具有使用方便，原料來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜，降低化妝品的毒性，安全性能好。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種肽，包括：

(Ⅰ)、Arg-Arg-Tyr的氨基酸序列；或

(Ⅱ)、(Ⅰ)所述氨基酸序列經(jīng)取代、缺失或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸獲得的氨基酸序列，且與(Ⅰ)所示的氨基酸序列功能相同或相似的氨基酸序列；

(Ⅲ)、與(Ⅰ)或(Ⅱ)所述序列至少有80％同源性的氨基酸序列；

所述肽的氨基酸個(gè)數(shù)為3～5個(gè)。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述添加的氨基酸選自Trp或Phe。

在本發(fā)明的另一些具體實(shí)施方案中，所述肽的氨基酸序列為Arg-Arg-Tyr。

本發(fā)明還提供了所述肽在制備用于預(yù)防和/或治療衰老的化妝品中的應(yīng)用。

在本發(fā)明中，所述衰老從整體上體現(xiàn)在：身高下降，脊柱彎曲，皮膚失去彈性，顏面皺褶增多，局部皮膚，特別是臉、手等處，可見(jiàn)色素沉著，呈大小不等的褐色斑點(diǎn)，稱作老年斑。汗腺、皮脂腺分泌減少使皮膚干燥，缺乏光澤。須發(fā)灰白，脫發(fā)甚至禿頂，眼瞼下垂，角膜外周往往出現(xiàn)整環(huán)或半環(huán)白色狹帶，叫做老年環(huán)(或老年弓)，是脂質(zhì)沉積所致。牙齒脫落，但時(shí)間遲早因人而異。在行為方面，老年人反應(yīng)遲鈍，步履緩慢，面部表情漸趨呆滯，記憶力減退，注意不集中，語(yǔ)言常喜重復(fù)。視力減退，趨于遠(yuǎn)視。聽(tīng)力也易退化。

在本發(fā)明中，所述衰老從組織與器官水平上體現(xiàn)在：骨骼系統(tǒng)——骨組織隨年齡衰老而鈣質(zhì)漸減，骨質(zhì)變脆，易骨折，創(chuàng)傷愈合也比年輕時(shí)緩慢。關(guān)節(jié)活動(dòng)能力下降，易患關(guān)節(jié)炎，脊柱椎體間的纖維軟骨墊由于軟骨萎縮而變薄，致使脊柱變短，這是老年人變矮的一個(gè)原因。皮膚——老年人真皮乳頭變低，使表皮與真皮界面變平，表皮變薄，真皮網(wǎng)狀纖維減少，彈性纖維漸失彈性且易斷裂，膠原纖維更新變慢，老纖維居多，膠原蛋白交聯(lián)增加使 膠原纖維網(wǎng)的彈性降低。皮膚松弛，不再緊附于皮下結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)透明質(zhì)酸減少而硫酸軟骨素相對(duì)增多，使真皮含水量降低，皮下脂肪減少，汗腺、皮脂腺萎縮，由于局部黑素細(xì)胞增生而出現(xiàn)老年斑。肌肉——老年人肌重與體重之比下降。肌細(xì)胞外的水分、鈉與氯化物有增加傾向、細(xì)胞內(nèi)的鉀含量則有下降傾向，此外，肌纖維數(shù)量下降，直徑減小，使整個(gè)肌肉顯得萎縮。這種衰老變化因功能不同而異，在不同的快縮肌或混合肌中收縮時(shí)間傾向于延長(zhǎng)，而在慢縮肌中收縮時(shí)間傾向于縮短，這會(huì)影響不同運(yùn)動(dòng)單位的相互作用，降低肌群協(xié)調(diào)共濟(jì)的有效性，很可能這是老人肌力不足的一個(gè)原因。當(dāng)然，運(yùn)動(dòng)單位的老年變化還不足以解釋老年人的一切運(yùn)動(dòng)障礙，因?yàn)樯窠?jīng)系統(tǒng)不同水平上的復(fù)雜機(jī)理對(duì)運(yùn)動(dòng)都會(huì)產(chǎn)生影響。神經(jīng)系統(tǒng)——90歲時(shí)人腦重較20歲時(shí)減輕10～20％。造成減重的原因主要在于神經(jīng)細(xì)胞的喪失。這種喪失有區(qū)域的特異性，例如大腦不同區(qū)域細(xì)胞減少程度不同。從出生到10歲神經(jīng)細(xì)胞已增殖到最多，不再分裂，20歲以后細(xì)胞開(kāi)始喪失。但全腦細(xì)胞基數(shù)很大，部分細(xì)胞死亡不致造成功能的嚴(yán)重障礙。況且人們對(duì)記憶機(jī)理了解得還不多，因此記憶減退未必是細(xì)胞喪失所致。老年人后腦膜加厚，腦回縮小，溝、裂寬而深，腦室腔擴(kuò)大。在顯微結(jié)構(gòu)上可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞尼氏體減少，脂褐質(zhì)沉積。在功能上則見(jiàn)神經(jīng)傳導(dǎo)速度減慢，近期記憶比遠(yuǎn)期記憶減退得嚴(yán)重，生理睡眠時(shí)間縮短；感覺(jué)機(jī)能如溫覺(jué)、觸覺(jué)和振動(dòng)感覺(jué)都下降，味覺(jué)閾升高，視聽(tīng)敏感度下降。反應(yīng)能力普遍降低，特別是在要求通過(guò)選擇做出決定的情況下反應(yīng)更為遲緩。心血管系統(tǒng)——老年心臟體積增大，目前還沒(méi)有證據(jù)表明脂褐質(zhì)沉積對(duì)心肌功能有何不良影響。在心臟的傳導(dǎo)系統(tǒng)可見(jiàn)起搏細(xì)胞的數(shù)量減少，竇房結(jié)與結(jié)間束內(nèi)纖維組織增加。在動(dòng)脈方面，內(nèi)膜也有不同程度的加厚，可因此而致小動(dòng)脈管腔狹窄。冠狀動(dòng)脈分支在30歲后就開(kāi)始出現(xiàn)內(nèi)膜的增厚，中膜日趨纖維化，有些平滑肌可能壞死，最突出的衰老變化為彈性纖維板層變。動(dòng)脈血管變性，外周血管阻力增加以致動(dòng)脈壓升高。呼吸系統(tǒng)——在形態(tài)方面老年人肋軟骨可能鈣化，駝背情況有所增加導(dǎo)致胸腔前后徑擴(kuò)大成為“桶狀胸”。顯微鏡下可見(jiàn)肺泡管與呼吸性細(xì)支氣管擴(kuò)大，使周圍肺泡容積減少。消化系統(tǒng)——一般說(shuō)來(lái)消化系統(tǒng)形態(tài)上的衰老變化不顯著，落齒與對(duì)牙齒的保護(hù)良否有關(guān)，未必為衰老特征。顯微鏡下可見(jiàn)胃的泌酸細(xì)胞隨衰老而減少，肝組織單位體積的細(xì)胞數(shù)也下降，小腸淋巴集結(jié)在年輕時(shí) 最明顯排泄系統(tǒng)人與大鼠腎臟在老年時(shí)都失重達(dá)20～30％，腎小球數(shù)目減少，40歲時(shí)正常腎小球占95％，90歲時(shí)僅余63％，近曲小管長(zhǎng)度與容積均下降，基底膜隨年齡加厚，髓質(zhì)內(nèi)間質(zhì)組織增多。在功能上腎小球過(guò)濾速度下降。內(nèi)分泌系統(tǒng)——性腺的萎縮是內(nèi)分泌系統(tǒng)最明顯的衰老變化。如女性45～50歲左右月經(jīng)停止，雌激素分泌顯著下降，男性從50～90歲雄激素逐漸減少，性機(jī)能減退。與此相應(yīng)生殖及副性器官產(chǎn)生各種萎縮性變化，如卵巢淋巴細(xì)胞形成的激素，這都導(dǎo)致免疫機(jī)能下降。分子水平——器宮與細(xì)胞的衰老終歸與分子水平的衰老有關(guān)，首先就細(xì)胞外的分子來(lái)說(shuō)，充塞于全身的胞外結(jié)締組織及上皮下方的基底膜均有特異的衰老變化。結(jié)締組織富含膠原蛋白及彈性蛋白。隨年齡增長(zhǎng)膠原蛋白分子之間產(chǎn)生交聯(lián)鍵。30～50歲為交聯(lián)迅速增加的時(shí)期，隨著交聯(lián)的增多膠原纖維吸水性下降，失去韌性，趨于僵硬，不利于組織的活動(dòng)。彈性蛋白為彈性纖維的主要成分，在衰老中也會(huì)進(jìn)行交聯(lián)。纖維斷裂、脆化，外觀黃色加深。至于基底膜只知其在衰老時(shí)加厚，其主要成分也是膠原蛋白，次為糖蛋白與碳水化合物。但這些分子如何改變導(dǎo)致膜的加厚還不清楚。此外，作為胞外物質(zhì)當(dāng)然還有血液、淋巴。這些物質(zhì)經(jīng)常處于運(yùn)行狀態(tài)，且不斷更新，很難定出衰老的指標(biāo)。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述衰老為皮膚衰老。

在本發(fā)明中，所述化妝品是指以涂沫、噴灑或其他類似方法，施于人體表面(如表皮、毛發(fā)、指甲、口唇等)，起到清潔、保養(yǎng)、美化或消除不良?xì)馕蹲饔玫漠a(chǎn)品，該產(chǎn)品對(duì)使用部位可以有緩和作用。

(一)按使用目的分類。清潔化妝品：用以洗凈皮膚、毛發(fā)的化妝品。這類化妝品如清潔霜、洗面奶、浴劑、洗發(fā)護(hù)發(fā)劑、剃須膏等。基礎(chǔ)化妝品：化妝前，對(duì)面部頭發(fā)的基礎(chǔ)處理。這類化妝品如各種面霜、蜜，化妝水，面膜，發(fā)乳、發(fā)膠等定發(fā)劑。美容化妝品：用于面部及頭發(fā)的美化用品。這類化妝品指胭脂，口紅，眼影，頭發(fā)染燙、發(fā)型處理、固定等用品。療效化妝品：介于藥品與化妝品之間的日化用品。這類化妝品如清涼劑、除臭劑、育毛劑、除毛劑、染毛劑、驅(qū)蟲(chóng)劑等。

(二)按使用部位分類。膚用化妝品：指面部及皮膚用化妝品。這類化妝品如各種面霜、浴劑。發(fā)用化妝品：指頭發(fā)專用化妝品。這類化妝品如香 波、摩絲、噴霧發(fā)膠等。美容化妝品：主要指面部美容產(chǎn)品，也包括指甲頭發(fā)的美容品。特殊功能化妝品：指添加有特殊作用藥物的化妝品。

(三)按劑型分類。液體化妝品：浴液、洗發(fā)液、化妝水、香水等。乳液：蜜類、奶類。膏霜類：潤(rùn)面霜、粉底霜、洗發(fā)膏。粉類：香粉、爽身粉。塊狀：粉餅、化妝盒。棒狀：口紅、發(fā)蠟。

(四)按年齡分類。嬰兒用化妝品：嬰兒皮膚嬌嫩，抵抗力弱。配制時(shí)應(yīng)選用低刺激性原料，香精也要選擇低刺激的優(yōu)制品。少年用化妝品：少年皮膚處于發(fā)育期，皮膚狀態(tài)不穩(wěn)定，且極易長(zhǎng)粉刺?？蛇x用調(diào)整皮脂分泌作用的原料，配制弱油性化妝品。男用化妝品：男性多屋于脂性皮膚，應(yīng)選用適于脂性皮膚的原料。剃須膏、須后液是男人專用化妝品。

(五)按生產(chǎn)過(guò)程結(jié)合產(chǎn)品特點(diǎn)可分為七類。乳劑類：指各種膏霜蜜。粉類：各種香粉、爽身粉。美容類：指唇膏、眼影、睫毛膏、指甲油等。香水類：香水、古龍水、花露水。香波類：指香波、浴液、護(hù)發(fā)素。美發(fā)類：指染發(fā)、燙發(fā)、定發(fā)用品。療效類：添加藥物的化妝品。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述化妝品的劑型為水劑、蜜劑、奶劑、膏劑、霜?jiǎng)?、粉劑、塊狀、棒狀中的一種或多種。

在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，所述肽的濃度為0.01-100μM。

在本發(fā)明的另一些具體實(shí)施方案中，所述的肽的有效劑量為0.1-10μM。

在本發(fā)明的另一些具體實(shí)施方案中，所述的肽的有效劑量為0.01、0.1、10或100μM。

本實(shí)驗(yàn)采用分子數(shù)據(jù)庫(kù)。該數(shù)據(jù)庫(kù)主要包含中草藥單體分子、小分子化合物、從天然產(chǎn)物中提取的化合物結(jié)構(gòu)以及用計(jì)算機(jī)方法產(chǎn)生的虛擬化合物，在計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)中，主要用于基于分子性質(zhì)、藥效基團(tuán)和分子對(duì)接的數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。一方面它可以提供天然產(chǎn)物三維結(jié)構(gòu)信息，另一方面，數(shù)據(jù)庫(kù)還可以提供植物來(lái)源、傳統(tǒng)功用、相關(guān)領(lǐng)域科學(xué)研究進(jìn)展等重要信息。本項(xiàng)目通過(guò)分子對(duì)接技術(shù)，旨在尋找到與表皮生長(zhǎng)因子受體有特異結(jié)合的天然產(chǎn)物，從而開(kāi)發(fā)出高效、高選擇性的天然產(chǎn)物藥物，同時(shí)也可以研究天然產(chǎn)物在體內(nèi)的作用機(jī)理。隨著中草藥中的天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)的積累，本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有進(jìn)一步研究開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值，有利于小分子作用機(jī)制的闡明和探究。

本發(fā)明通過(guò)將三肽Arg-Arg-Tyr作用于人皮膚成纖維細(xì)胞中，對(duì)人皮膚成 纖維細(xì)胞進(jìn)行CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、Edu法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，三肽Arg-Arg-Tyr能有效促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖，增加S+G2M期所占比例，其用于皮膚衰老預(yù)防或治療療效確切，副作用小，因此具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

附圖說(shuō)明

為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。

圖1示EGFR分子模型：正視圖如圖1(A)所示，俯視圖如圖1(B)所示；

圖2示Arg-Arg-Tyr對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響；

圖3示Arg-Arg-Tyr對(duì)HSF增殖的影響；其中，圖3(A)示熒光顯微鏡拍照?qǐng)D；圖3(B)示熒光圖片軟件分析圖；

圖4示細(xì)胞周期分析圖；

圖5示細(xì)胞周期統(tǒng)計(jì)直方圖；

圖6示實(shí)施例3中對(duì)照組的肉眼觀察結(jié)果；

圖7示實(shí)施例3中短肽組的肉眼觀察結(jié)果；

圖8示實(shí)施例3中對(duì)照組HE染色×100結(jié)果；

圖9示實(shí)施例3中短肽組HE染色×100結(jié)果。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明公開(kāi)了一種肽及其應(yīng)用，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見(jiàn)的，它們都被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明的方法及應(yīng)用已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。

為了克服現(xiàn)有技術(shù)不足問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種三肽——Arg-Arg-Tyr的應(yīng)用，其在預(yù)防和/或治療皮膚衰老的化妝品中具有顯著療效。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種三肽——Arg-Arg-Tyr在制備用于預(yù)防和/或治療皮膚衰老化妝品中的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述的三肽——Arg-Arg-Tyr用于預(yù)防及延緩皮膚保護(hù)劑。

所述三肽Arg-Arg-Tyr的濃度為0.01-100μM。

本發(fā)明有以下有益效果：能有效促進(jìn)皮膚成纖維細(xì)胞增殖，抗皮膚衰老，同時(shí)還具有使用方便，原料來(lái)源廣泛，價(jià)格便宜，降低化妝品的毒性，安全性能好。具體的，本發(fā)明通過(guò)將三肽Arg-Arg-Tyr作用于人皮膚成纖維細(xì)胞中，對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞進(jìn)行CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、Edu法檢測(cè)細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，三肽Arg-Arg-Tyr能有效促進(jìn)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖，增加S+G2M期所占比例，其用于皮膚衰老預(yù)防或治療療效確切，副作用小，因此具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本發(fā)明提供的一種肽及其應(yīng)用中所用原料及試劑均可由市場(chǎng)購(gòu)得。

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明：

實(shí)施例1：計(jì)算機(jī)分子模擬篩選功能性短肽實(shí)驗(yàn)

1.1實(shí)驗(yàn)材料

搭載了192AMD Opteron處理器組的超級(jí)計(jì)算機(jī)

1.2實(shí)驗(yàn)方法：

高通量計(jì)算機(jī)分子模擬篩選技術(shù)的原理如下：(1)藥效團(tuán)和靶點(diǎn)的初步篩選。即利用現(xiàn)有中草藥分子單體數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)蛋白質(zhì)等受體進(jìn)行全面全面分析。模擬中草藥單體分子與目標(biāo)受體蛋白分子的相互作用，并且得到這幾種物質(zhì)結(jié)合的得分與作用位點(diǎn)。(2)分子對(duì)接。應(yīng)用半柔性對(duì)接方法，通過(guò)不斷優(yōu)化小分子化合物的位置(取向)以及分子內(nèi)部柔性鍵的二面角(構(gòu)象)，尋找小分子化合物與靶標(biāo)大分子作用的最佳構(gòu)象，允許小分子的構(gòu)象發(fā)生變化，然后將庫(kù)中的分子逐一與靶分子進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算結(jié)合自由能。以結(jié)合自由能作為評(píng)價(jià)對(duì)接結(jié)果的依據(jù)，根據(jù)此得分排名，找出與靶分子結(jié)合的最佳分子。(3)分子動(dòng)力學(xué)模擬。用計(jì)算機(jī)在虛擬的情況下對(duì)受體配體復(fù)合物進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，模擬出該復(fù)合物在自然狀態(tài)下最穩(wěn)定的形態(tài)，并作出數(shù)據(jù)分析。能很好的模擬體內(nèi)環(huán)境，通過(guò)精細(xì)的計(jì)算，能夠準(zhǔn)確的展現(xiàn)受體和配體結(jié)合的程度。精細(xì)篩選過(guò)程采用曙光5000系列的高性能計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，利用多核并行的計(jì)算方式，大大提高實(shí)驗(yàn)的進(jìn)度。

分子對(duì)接是本階段實(shí)驗(yàn)的主要實(shí)驗(yàn)方法。通過(guò)研究小分子配體和受體生物大分子的相互作用，計(jì)算機(jī)可預(yù)測(cè)復(fù)合物的結(jié)合模式和親和力，是目前藥物設(shè)計(jì)等領(lǐng)域最重要的方法之一。分子對(duì)接是小分子配體和生物大分子受體 通過(guò)幾何匹配和能量匹配而相互識(shí)別的過(guò)程。在藥物分子產(chǎn)生藥效反應(yīng)的過(guò)程中，藥物分子與靶標(biāo)相互結(jié)合，首先要兩個(gè)分子充分接近，采取合適的取向，使兩者在必要的部位相互契合，發(fā)生相互作用，續(xù)而通過(guò)適當(dāng)?shù)臉?gòu)象調(diào)整，得到一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物構(gòu)象。通過(guò)分子對(duì)接確定復(fù)合物中兩個(gè)分子正確的相對(duì)位置和取向，研究?jī)蓚€(gè)分子的構(gòu)象，特別是底物的構(gòu)象在形成復(fù)合物過(guò)程中的變化，是確定藥物作用機(jī)制、設(shè)計(jì)新藥的基礎(chǔ)。以下是主要幾種分子對(duì)接方法，詳見(jiàn)表1：

表1 幾種主要的分子對(duì)接方法

本發(fā)明主要使用Autodock實(shí)現(xiàn)分子對(duì)接計(jì)算。

分子對(duì)接計(jì)算：把配體分子放在受體活性位點(diǎn)的位置，然后按照幾何互補(bǔ)、化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)、能量互補(bǔ)等原則實(shí)時(shí)評(píng)價(jià)配體和受體相互作用的好壞，并找到兩個(gè)分子之間最佳的結(jié)合模式。

評(píng)價(jià)方法：通過(guò)打分函數(shù)進(jìn)行評(píng)估。每一個(gè)對(duì)接的算術(shù)在計(jì)算機(jī)分子篩選平臺(tái)中都會(huì)進(jìn)行自由能函數(shù)打分，該過(guò)程需平衡以下兩種因素：時(shí)效性和精確度。目前這種評(píng)價(jià)主要包括以下三部分：1.基于經(jīng)驗(yàn)的回歸參數(shù)的方法，即用多元回歸的方法擬合各種物理參數(shù)對(duì)結(jié)合自由能的貢獻(xiàn)，如FlexX程序中采用配體旋轉(zhuǎn)鍵的個(gè)數(shù)、氫鍵、離子鍵，疏水和芳香環(huán)的π堆積作用，以及親水作用。這種方法能快速直接地估算結(jié)合自由能；2.基于分子力場(chǎng)的方法，該方法只考慮熱焓對(duì)能量的貢獻(xiàn)，不考慮熵的影響，一般情況下，采用標(biāo)準(zhǔn)力場(chǎng)的非鍵作用能如真空靜電和范德華作用能用作打分函數(shù)，如DOCK 程序中采用AMBER的能量函數(shù)：

3.基于知識(shí)的打分函數(shù)。最初應(yīng)用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，打分函數(shù)用統(tǒng)計(jì)力學(xué)的方法得到蛋白質(zhì)－配體的復(fù)合物結(jié)構(gòu)，結(jié)合自由能函數(shù)為分子間距離的平均能的加和來(lái)計(jì)算。

1.3實(shí)驗(yàn)步驟：

1.3.1明確模擬對(duì)象：

本項(xiàng)目計(jì)算機(jī)分子模擬實(shí)驗(yàn)的模擬對(duì)象為待計(jì)算配體以及EGFR蛋白結(jié)構(gòu)(圖1)，其中，圖1(A)為正視圖，圖1(B)為俯視圖。所有EGFR蛋白結(jié)構(gòu)來(lái)自于蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)，主要為解析度為的EGFR胞外域晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)：1NQL)，以及解析度為的結(jié)合了EGF的變構(gòu)后的EGFR胞外域晶體結(jié)構(gòu)(PDB編號(hào)：1IVO)。

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)備是虛擬篩選的重要一步。虛擬篩選的蛋白靶標(biāo)的結(jié)構(gòu)可以從PDB庫(kù)(http://www.rcsb.org/pdb/index.htmL)中直接下載使用；也可以通過(guò)和家族中同源蛋白的序列、結(jié)構(gòu)信息比較，同源模建而得。去除受體分子中的所有水分子和金屬離子。接著是結(jié)合位點(diǎn)的描述，選擇合適的配體結(jié)合口袋。本實(shí)驗(yàn)為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的精確性，我們根據(jù)生物功能如結(jié)合、突變等實(shí)驗(yàn)信息，手動(dòng)選擇結(jié)合部位。

1.3.2制定模擬方案：

首先使用軟件SYBYL1.1修飾獲得的PDB文件，刪除冗余分子以及無(wú)關(guān)基團(tuán)，以獲得純凈的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)；

其次使用軟件Autodock4.0設(shè)置空間坐標(biāo)，通過(guò)拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic algorithm)，規(guī)定藥物分子的結(jié)合位點(diǎn)，選定的活性位點(diǎn)即是配體(此處即為EGF)的結(jié)合位點(diǎn)。此時(shí)初始設(shè)置完畢。

1.3.3分子模擬計(jì)算:

包括對(duì)接和打分，這一步是虛擬篩選的核心步驟。對(duì)接操作是把每個(gè)小分子放到受體蛋白的配體結(jié)合位點(diǎn)，優(yōu)化配體構(gòu)像和位置，使之與受體有最 佳的結(jié)合作用；給最佳結(jié)合構(gòu)象打分，對(duì)所有化合物根據(jù)打分排序，然后從化合物庫(kù)中挑出打分最高的小分子。

使用Autodock中的AutoGrid模塊，計(jì)算配體和受體之間的結(jié)合自由能。此時(shí)為初步篩選，已經(jīng)可以獲得一部分分子與EGFR的親和信息；

使用AMBER 11模擬套件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)的模擬和數(shù)據(jù)分析。在EGFR的模擬中采用力場(chǎng)為AMBER ff03，這一力場(chǎng)對(duì)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋和β-折疊的受力施力分配較為均衡，因此更適合于EGFR的模擬。模擬環(huán)境采用TIP3P水盒子，即水環(huán)境，由于人體中主要成分是水，因此根據(jù)本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選取水環(huán)境作為分子模擬的實(shí)驗(yàn)條件是合理的，可充分模擬人體內(nèi)的水環(huán)境效果；

使用Gaussian03程序進(jìn)行配體分子的幾何結(jié)構(gòu)最優(yōu)化，獲得最穩(wěn)定的靜電勢(shì)能；

使用AMBER GAFF程序規(guī)定配體的其余力場(chǎng)參數(shù)；

使用AMBER 11軟件的antechamber套件設(shè)定配體缺失的力場(chǎng)參數(shù)。

本階段實(shí)驗(yàn)采用Autodock中的AutoGrid模塊，計(jì)算配體和受體之間的結(jié)合自由能。

1.3.4命中化合物的后處理:

命中化合物的后處理通過(guò)計(jì)算分子的類藥性質(zhì)ADME/T(吸收absorption、器官分布distribution、體內(nèi)代謝metabolism、排泄excretion和毒性toxicity)性質(zhì)的估算，排除那些不具有類藥性質(zhì)的分子。

由于EGFR是一個(gè)相對(duì)大的分子體系，在分子模擬中需要耗費(fèi)相當(dāng)大的計(jì)算量，因此在藥物初步篩選中我們采用了5ns的模擬時(shí)間。長(zhǎng)距靜電作用力使用Particle-Mesh Ewald方法計(jì)算，計(jì)算過(guò)程中，我們添加了鈉離子，以中和EGFR產(chǎn)生的負(fù)電荷。

最終，可以計(jì)算出EGFR和配體的結(jié)合自由能，從而可以對(duì)配體激活EGFR的能力作出一個(gè)計(jì)算機(jī)評(píng)價(jià)。通過(guò)以上四步處理，大部分分子從化合物庫(kù)中剔除，形成一個(gè)大小合理的化合物庫(kù)，僅對(duì)這些適合成藥的化合物或購(gòu)買、或合成、或分離得到，然后再進(jìn)行實(shí)際的生物測(cè)試。

1.4實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

對(duì)已建立包涵8000種短肽三維結(jié)構(gòu)的蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)過(guò)對(duì)該短肽庫(kù)的篩 選，由于短肽分子的空間構(gòu)像復(fù)雜，在實(shí)際的分子模擬篩選中，得分絕對(duì)值在8分以上為“具有較好結(jié)合效果的目標(biāo)分子”。因此，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)最終計(jì)算結(jié)果，得到與EGFR具有較好結(jié)合效果的短肽，結(jié)果如式Ⅰ所示：

Arg-Arg-Tyr(精氨酸-精氨酸-酪氨酸)，兩次模擬得分：-9.5；-9.7

實(shí)施例2：Arg-Arg-Tyr對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞增殖的影響

1材料

1.1細(xì)胞株

人皮膚成纖維細(xì)胞株(HSF)，購(gòu)于復(fù)旦大學(xué)IBS細(xì)胞資源中心。

1.2生化試劑

青霉素-鏈霉素溶液(100×)、胰酶細(xì)胞消化液(含酚紅)、Phosphate-Buffered Saline(含135mM NaCl，4.7mM KCl，10mM Na₂HPO₄，2mM NaH₂PO₄，pH值為7.4)，均為碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DMEM高糖培養(yǎng)基、細(xì)胞凍存液，美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；澳洲優(yōu)級(jí)胎牛血清，美國(guó)Gemini公司；TritonX-100、牛血清白蛋白(BSA)均為廣州杰特偉生物科技有限公司；氯化鈉、無(wú)水乙醇、多聚甲醛、二甲基亞砜(DMSO)，均為廣州化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品，分析純。

1.3生化試劑盒

CCK-8試劑盒，日本DOJINDO公司；key Fluor488-EdU法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒，均為南京凱基生物公司產(chǎn)品。

1.4常用生化耗材

6孔、24孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶、0.22μm針頭式無(wú)菌過(guò)濾器，15mL、50mL無(wú)菌離心管，均為潔特生物公司(JET)產(chǎn)品；凍存管，Sigma公司產(chǎn)品；流式細(xì)胞管，美國(guó)BD公司產(chǎn)品。

1.5主要儀器

EPICS XL-MCL型流式細(xì)胞儀，美國(guó)Beckman CoμLter公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱、生物安全柜，均為藝思高(ESCO)科技有限公司產(chǎn)品；倒置顯微鏡，日本OLYMPUS公司產(chǎn)品；TW12恒溫水浴鍋，德國(guó)JμLabo公司產(chǎn)品；AL104-IC電子分析天平，瑞士Mettler公司產(chǎn)品；Model 680型酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-RAD公司產(chǎn)品；5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司產(chǎn)品；微量移液器，德國(guó)Eppendorf公司；DMI4000B智能型倒置熒光顯微鏡，德國(guó)Leica公司產(chǎn)品；細(xì)胞計(jì)數(shù)板，上海求精生化儀器公司；細(xì)胞凍存程序降溫盒，美國(guó)Nalgene公司產(chǎn)品；液氮罐，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；﹣80℃低溫冰箱，美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品；﹣20℃低溫冰箱，青島海爾公司產(chǎn)品。

1.6藥品

EGF，無(wú)限極(中國(guó))有限公司；Arg-Arg-Tyr(RRY)純度99.33％，上海強(qiáng)耀生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.7細(xì)胞培養(yǎng)常用實(shí)驗(yàn)試劑的配制

1.7.1完全無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)基

無(wú)菌條件下量取DMEM高糖培養(yǎng)基90mL、胎牛血清10mL，混勻，加入青鏈霉素溶液1mL，0.22μm濾膜過(guò)濾除菌后分裝，保存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7.2EGF工作液的配制

(1)EGF為1mg/管，加入10mL完全培養(yǎng)基，震蕩混勻，配成10mg/mL的母液，分裝，﹣20℃避光保存；

(2)實(shí)驗(yàn)前取10μL EGF母液稀釋，最終配置其他濃度分別為100ng/mL的EGF工作液。

1.7.3短肽Arg-Arg-Tyr工作液配制

(1)短肽Arg-Arg-Tyr為10mg/管，加入20.125mL完全培養(yǎng)基，震蕩混勻，配成1000μM的母液，分裝，﹣20℃避光保存；

(2)實(shí)驗(yàn)前取母液稀釋，最終配置其他濃度分別為100、10、1、0.1、0.01μM 的RRY工作液。

1.7.4 4％多聚甲醛溶液

稱取40g的多聚甲酸加入900mI PBS中，充分?jǐn)嚢韬竺芊庥趶V口瓶中，置于60℃溫箱加熱促溶，待完全溶解后加PBS定容至1000mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.5 3％BAS溶液

稱取3g BAS加入100mL雙蒸水中，充分溶解后4℃短期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7.6 0.5％TritonX-100

量取50μL TritonX-100加入9mLPBS中，振蕩混勻，定容至10mL，使其終濃度為0.5％。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)方法

2.1.1培養(yǎng)環(huán)境

將人皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中(pH7.2～7.4)，于5％CO₂、37℃的飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。

2.1.2細(xì)胞復(fù)蘇

1)準(zhǔn)備37℃水浴或1000mL的燒杯，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。

2)從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動(dòng)。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。

3)用75％酒精擦拭消毒后，凈化臺(tái)上打開(kāi)蓋，用吸管吸出細(xì)胞懸液，裝入離心管中，再補(bǔ)加10mL培養(yǎng)液，吹打使細(xì)胞懸浮。

4)1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

5)沉淀加10mL培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。

6)加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，第二天觀察生長(zhǎng)情況。

2.1.3細(xì)胞的傳代

1)待細(xì)胞鋪滿瓶底時(shí)進(jìn)行傳代。先將原有的培養(yǎng)基倒掉，然后加入PBS洗3次。

2)向瓶?jī)?nèi)加入1mL 0.25％的胰蛋白酶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使消化液流遍所有細(xì)胞表面，然后吸掉或倒掉消化液后再加1mL新得胰蛋白酶消化液，輕輕搖動(dòng)后再倒掉大部分消化液，僅留少許進(jìn)行消化，顯微鏡下觀察。

3)當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞彼此連接分開(kāi)，胞質(zhì)回縮變圓但尚末完全脫落時(shí)，棄去胰酶后立刻加入3mL DMEM培養(yǎng)基，終止消化。

4)用微量移液器，吸取吹瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)液，反復(fù)吹打瓶壁分散細(xì)胞。

5)待細(xì)胞分散均勻后，1:3傳代。

2.1.4細(xì)胞的凍存:

1)將生長(zhǎng)至80％左右融合度的HSF,如上所述方法消化,離心，棄去上清液；

2)細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞凍存液(4℃預(yù)冷),吹打混勻后轉(zhuǎn)移至2mL細(xì)胞凍存管；

3)凍存管放入細(xì)胞凍存程序降溫盒內(nèi),置于﹣80℃冰箱,24小時(shí)后取出凍存管,快速轉(zhuǎn)移至液氮罐保存。

2.2CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)

2.2.1細(xì)胞復(fù)蘇和傳代

方法同2.1.2和2.1.3。

2.2.2制備細(xì)胞懸液

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)液，用PBS洗滌細(xì)胞3～4次，再用0.25％胰蛋白酶消化，消化后棄胰蛋白酶加進(jìn)新培養(yǎng)基終止消化，吹打細(xì)胞使其從瓶壁上完全脫落。將其導(dǎo)入離心管離心1000r/min，離心5min。離心后，棄掉上清液，重新更換培養(yǎng)基。

2.2.3細(xì)胞計(jì)數(shù)

用95％酒精清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片，然后于室溫下晾干或用綢布拭干。取少許制備好的細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一端滴加微少量的細(xì)胞懸液，滴加時(shí)要防止懸液溢出蓋玻片或溢入兩側(cè)的玻璃槽內(nèi)，加樣量也不要過(guò)少或帶氣泡。倒置顯微鏡下觀察，在10×物鏡下，計(jì)算計(jì)數(shù)板周邊四個(gè)大方格中的細(xì)胞數(shù)。將計(jì)算結(jié)果代入下式，得出細(xì)胞密度

細(xì)胞數(shù)/毫升原液＝(4個(gè)大方格的細(xì)胞數(shù)/4)×10⁴

2.2.4細(xì)胞接種

參照細(xì)胞計(jì)數(shù)板所得出的濃度結(jié)果，按4X10³/孔密度，200μL/孔接種于96孔板。用加樣槍吸取PBS液200μL分別注入96孔板邊緣四周(抵抗邊緣效應(yīng))，鋪板完成后，蓋上蓋子，標(biāo)明日期。放入5％CO₂、37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6h，直到細(xì)胞完全貼壁加藥。

2.2.5進(jìn)行藥物干預(yù)

當(dāng)細(xì)胞完全貼壁，吸出各個(gè)孔中培養(yǎng)液。設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組(EGF，100ng/mL)﹑陰性對(duì)照組(只加入單細(xì)胞懸液不加任何藥物)和實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組分為濃度為100、10、1、0.1、0.01μM每組各個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，各孔終體積為200μL，再將96孔板繼續(xù)置于5％CO₂﹑37℃的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加藥后進(jìn)行培養(yǎng)72h進(jìn)行測(cè)定。

2.2.6顯色及酶標(biāo)儀檢測(cè)：

在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束之前4h，無(wú)菌條件下去除原培養(yǎng)液，每孔加入20μL10％CCK-8溶液，37℃孵育4h。取出孔板，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)處的吸光值。數(shù)據(jù)輸出，記錄分析。

2.3Edu法檢測(cè)細(xì)胞增殖

2.3.1細(xì)胞復(fù)蘇和傳代

方法同2.1.2和2.1.3。

2.3.2細(xì)胞接種

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSF細(xì)胞，用PBS沖洗后，加胰酶細(xì)胞消化液消化，離心收集，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸，按照10000個(gè)/孔的濃度接種于含細(xì)胞爬片的24孔培養(yǎng)板中，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h。

2.3.3加藥及孵育

細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后，吸出培養(yǎng)液，加入不同濃度的，使終濃度分別為100、10、1、0.1、0.01μM同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照孔并各設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。加藥后同條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h。

2.4.4采用南京凱基公司生產(chǎn)的key Fluor488-EdU法細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒檢測(cè)短肽對(duì)細(xì)胞增殖的影響，按照說(shuō)明書(shū)步驟操作：

2.4.4.1EdU標(biāo)記：

1)將細(xì)胞完全培養(yǎng)基與EdU溶液按照2000:1比例配制適量50μMEdU稀釋液。

2)加入50μM EdU稀釋液200μL/孔、37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱孵育4h，棄培養(yǎng)基。

3)PBS清洗細(xì)胞，5min/次×2次，棄PBS。

2.4.4.2細(xì)胞固定及促滲：

1)加入細(xì)胞固定液(即含4％多聚甲醛的PBS)100μL/孔，室溫孵育30min，棄 細(xì)胞固定液。

2)加入含3％BSA的PBS100μL/孔，清洗，5min/次×2次。

3)加入滲透劑(0.5％TritonX-100的PBS)200μL/孔，室溫脫色搖床孵育20min，棄滲透劑。PBS清洗1次，5min。

2.4.4.3EdU檢測(cè)：

1)準(zhǔn)備1×Click-iTEdU反應(yīng)緩沖液：轉(zhuǎn)移1×Click-iTEdU反應(yīng)緩沖液試劑瓶中所有的溶液4mL至36mL的去離子水中。

2)制備一份10×的Click-iTEdU反應(yīng)添加物儲(chǔ)液：加1mL去離子水至10×的Click-iTEdU反應(yīng)添加物儲(chǔ)液試管中，混勻至全部溶解。

3)準(zhǔn)備1×Click-iTEdU緩沖液添加物(見(jiàn)表格2)：以去離子水稀釋10×儲(chǔ)液至1×，溶液應(yīng)新鮮配制，當(dāng)天用完。

4)依據(jù)表2準(zhǔn)備Click-iT反應(yīng)混合物。

表2 Click-iT反應(yīng)混合物:

5)去除促滲液，以每孔1mL的3％BSA的PBS的洗滌液洗滌2次，去除洗滌液。

6)加入0.5mL Click-iT反應(yīng)混合物至每張爬片，簡(jiǎn)短搖晃培養(yǎng)板以確保反應(yīng)混合物可以均勻覆蓋爬片。

7)室溫避光孵育30min。

8)除去反應(yīng)混合物，每孔以1mL3％BSAin PBS洗滌2次，去除洗滌液。

2.4.4.4DNA染色:

1)以1mLPBS洗滌每孔1次，去掉洗滌液。

2)以PBS稀釋Hoechst33342儲(chǔ)液1:2000至1×Hoechst33342溶液，終濃度 為5μg/mL。

3)每孔加1mL1×Hoechst33342溶液，室溫避光孵育30min。除去Hoechst33342溶液。

4)1mLPBS洗滌每孔2次，去除洗滌液。于熒光顯微鏡藍(lán)色及綠色熒光下觀察，每張細(xì)胞爬片隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行拍照，圖像采用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)增殖細(xì)胞核與總細(xì)胞核數(shù)目。

5)新增殖細(xì)胞在藍(lán)光激發(fā)下細(xì)胞核發(fā)出綠色突光，所有的細(xì)胞(包括新增殖和未增殖分裂的細(xì)胞)在紫外激發(fā)下細(xì)胞核發(fā)出藍(lán)色突光。將紅色增殖細(xì)胞核的數(shù)目與藍(lán)色總細(xì)胞核相比，計(jì)算得到EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，可檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期

2.4.1細(xì)胞復(fù)蘇和傳代

方法同2.1.2和2.1.3。

2.4.2細(xì)胞接種

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSF細(xì)胞，用PBS沖洗后，加胰酶細(xì)胞消化液消化，離心收集，棄上清，加入新鮮培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0x10⁵/mL，2mL/孔接種于6孔板中，置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，待細(xì)胞完全貼壁后，無(wú)血清培養(yǎng)液馴化24h，使細(xì)胞周期同步化。

2.4.3加藥及孵育

吸出培養(yǎng)液，加入不同濃度的，使終濃度分別為100、10、1、0.1、0.01μM同時(shí)設(shè)立陰性對(duì)照與陽(yáng)性對(duì)照孔并各設(shè)立4個(gè)復(fù)孔。加藥后同條件下繼續(xù)培養(yǎng)72h。

2.4.4采用南京凱基公司生產(chǎn)的細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒檢測(cè)短肽對(duì)細(xì)胞周期的影響，按照說(shuō)明書(shū)步驟操作：

1)用PBS洗滌細(xì)胞一次(離心2000rpm，5min)收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為1x10⁶/mL，取1mL單細(xì)胞懸液；

2)制備的單細(xì)胞懸液離心后，去除上清，在細(xì)胞中加入體積分?jǐn)?shù)為70％冷乙醇500μL固定(2小時(shí)至過(guò)夜)，4℃保存，染色前用PBS洗去固定液；

3)加100μL RNase A37℃水浴30min；

4)再加入400μL PI染色混勻，4℃避光30min；

5)上機(jī)檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488nm處紅色熒光；

6)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；

7)采用ModFit LT 4.1軟件分析數(shù)據(jù)。結(jié)果以增殖指數(shù)(proliferous index，PI)即S和G₂M期細(xì)胞百分比表示，計(jì)算公式：PI＝(S+G₂/M)/(G₀/G₁+S+G₂/M)，以此顯示處于活躍增殖期的細(xì)胞比例大小。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

2.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，結(jié)果用SPSS 11.0軟件處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1CCK-8法檢測(cè)Arg-Arg-Tyr對(duì)HSF增殖能力的影響

用不同濃度Arg-Arg-Tyr(0.01、0.1、1、10、100μM)處理HSF細(xì)胞72小時(shí)，cck-8檢測(cè)HSF細(xì)胞的增殖，與陰性對(duì)照組比較，Arg-Arg-Tyr 0.01、0.1、1、10、100μM處理組與陰性對(duì)照組比較差異顯著(p<0.05)。其中1μM組與0.01、0.1、10、100μM組相比，P<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即Arg-Arg-Tyr濃度為1μM時(shí)，胞的數(shù)量最多。但是對(duì)于1μMArg-Arg-Tyr和100ng EGF(陽(yáng)性對(duì)照組)兩個(gè)組的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，圖2。

綜上，不同濃度Arg-Arg-Tyr(0.01、0.1、1、10、100μM)都能引起HSF增殖。我們?cè)诤罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)中選擇0.1、1、10μM的Arg-Arg-Tyr處理細(xì)胞。

表3 Arg-Arg-Tyr干預(yù)下各組細(xì)胞OD值(x±s)

注：*P<0.05，藥物干預(yù)組與陰性對(duì)照組相比；#P<0.05，1μMArg-Arg-Tyr組 與其他濃度Arg-Arg-Tyr組相比。

3.2EdU法檢測(cè)Arg-Arg-Tyr對(duì)HSF增殖能力的影響

分別用0.1、1和10μM的Arg-Arg-Tyr以及100ng EGF處理細(xì)胞72h，用EdU檢測(cè)細(xì)胞的增殖數(shù)目。如圖3(A)和圖3(B)所示：藍(lán)色圖(Hoechst)表示熒光顯微鏡視野下的所有染色細(xì)胞核，綠色圖(EdU)表示該視野內(nèi)新增殖的細(xì)胞核，Merge為兩者的融合圖。與Control組相比，1μM組的細(xì)胞出現(xiàn)增殖(P<0.05)。結(jié)果表明1μM的Arg-Arg-Tyr可以引起細(xì)胞增殖。但是對(duì)于1μMArg-Arg-Tyr和100ngEGF兩個(gè)組的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.3RRY對(duì)HSF細(xì)胞周期的影響

如圖4、5所示施加刺激72h后，實(shí)驗(yàn)組(1μM的Arg-Arg-Tyr)與對(duì)照組相比較，DNA合成前期(G1)細(xì)胞所占百分比均有所減少，并且反映細(xì)胞增殖活力的PI增殖指數(shù)[即(S+G2M)]明顯(P＜0.05)升高。結(jié)果表明1μM的Arg-Arg-Tyr可以引起細(xì)胞增殖(P<0.05)。但是對(duì)于1μM Arg-Arg-Tyr和100ngEGF兩個(gè)組的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

實(shí)施例3動(dòng)物試驗(yàn)

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SD鼠18只，雌性，體重18.0士0.6g，購(gòu)自中山大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑：Arg-Arg-Tyr(RRY)純度99.33％，上海強(qiáng)耀生物科技有限公司合成；用蒸餾水配制為1μM溶液。

1.3儀器:

Leica石蠟切片機(jī)，德國(guó)Leica公司產(chǎn)品；Shandon Paraffin Section Flotation Bath攤片機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品；DM 2500B正立顯微成像系統(tǒng)，德國(guó)Leica公司產(chǎn)品。

1.4實(shí)驗(yàn)分組及處理:

采用隨機(jī)數(shù)字法，12只SD鼠被隨機(jī)分為2組，每組6只：空白對(duì)照組：未給予任何處理；1μMArg-Arg-Tyr溶液短肽組。上述各組在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前一天背部剃毛(貫穿于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中)，范圍為4×4cm²大小，于剃毛部位皮膚涂用上述相應(yīng)藥物，1次/日，連續(xù)1個(gè)月。

1.5皮膚表面肉眼觀察

肉眼觀察小鼠背部皮膚的色澤，光滑程度和皺紋情況等，判斷動(dòng)物皮膚變化情況，作為宏觀體貌的觀察指標(biāo)。

1.6組織形態(tài)學(xué)觀察

具體操作如下:

1.6.1.標(biāo)本采集

實(shí)驗(yàn)第30d，所有動(dòng)物腹腔注射10％水合氯醛進(jìn)行麻醉，頸椎脫臼處死動(dòng)物?？焖偌羧”潮巢考s4×4cm²大小的脫毛皮膚，仔細(xì)除去皮下多余脂肪，取部分皮膚標(biāo)本，小心攤平，10％甲醛固定48小時(shí)以上，擬作為皮膚組織切片進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察。

1.6.2.石蠟包埋

取出固定好的皮膚組織，用流水漂洗過(guò)夜，次日進(jìn)行如下步驟的石蠟包埋:70％乙醇1h→80％乙醇1h→90％乙醇1h→95％乙醇(Ⅰ)1h→95％乙醇(Ⅱ)1h→100％乙醇(Ⅰ)1h→100％乙醇(Ⅱ)1h→正丁醇1h→二甲苯30min→溶蠟(Ⅰ)1.5h→溶蠟(Ⅱ)2h→包埋。

1.6.3切片制作

常規(guī)皮膚組織石蠟切片，厚度6nm，將制好的切片于室溫下瞭干過(guò)夜，隨后放入4冰箱密封保存，備用。

1.6.4皮膚組織HE染色

1)切片脫蠟與復(fù)水

二甲苯(Ⅰ)2min→二甲苯(Ⅱ)10min→100％乙醇2min→95％的乙醇2min→80％乙醇2min→75％乙醇2min→自來(lái)水洗2min。

2)染色：蘇木精染3min→自來(lái)水浸洗返藍(lán)3min→蒸溜水浸洗3min；

3)脫水透明：70％乙醇2min→80％乙醇2min→90％乙醇2min→1％伊紅染色3s→95％乙醇2min→100％乙醇(Ⅰ)2min→100％乙醇(Ⅱ)2min→二甲苯(Ⅰ)6min→二甲苯(Ⅱ)6min→中性樹(shù)膠封片、涼干。

4)鏡檢觀察。

HE染色中需時(shí)常在顯微鏡下觀察染色的深淺，以便及時(shí)調(diào)控，結(jié)果應(yīng)是細(xì)胞核被染成藍(lán)色，核仁分明，伊紅將細(xì)胞質(zhì)染成紅色，藍(lán)色的細(xì)胞核與紅色的胞漿對(duì)比鮮明。

2結(jié)果

2.1各組小鼠背部皮膚一般形態(tài)觀察

空白對(duì)照組小鼠皮膚紅潤(rùn)、光滑、無(wú)明顯皺紋，充滿彈性；實(shí)驗(yàn)組(1μMArg-Arg-Tyr溶液短肽組)皮膚紅潤(rùn)光澤，厚度適中，具有良好的皮膚彈性，且與空白對(duì)照組相比小鼠背側(cè)表皮無(wú)皮膚增厚、脫屑、顏色加深等不良反應(yīng)。(見(jiàn)圖6～7)。

2.2各組小鼠背部皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察

HE結(jié)果顯示，空白對(duì)照組小鼠皮膚各層結(jié)構(gòu)完整，皮下毛囊、皮脂腺飽滿，表皮規(guī)則，表皮與真皮界線清晰，真皮層厚度正，染色均勻致密，膠原纖維束狀排列，整齊而致密；實(shí)驗(yàn)組(1μMArg-Arg-Tyr溶液短肽組)小鼠皮膚表皮層結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞分層清晰，厚度正常，細(xì)胞成分及數(shù)量適中，真皮層可見(jiàn)波浪狀纖維組織，排列有序，分布均勻，疏密有致，且與空白對(duì)照組相比無(wú)差異。(見(jiàn)圖8～9)。

3結(jié)論

本發(fā)明通過(guò)綜合運(yùn)用肉眼觀察、HE染色方法，從組織形態(tài)生物學(xué)方面的實(shí)驗(yàn)，較全面的驗(yàn)證了短肽Arg-Arg-Tyr與光甘草定對(duì)SD鼠皮膚的影響。結(jié)果顯示短肽Arg-Arg-Tyr對(duì)正常SD鼠皮膚組織無(wú)毒副作用，對(duì)于皮膚安全可靠。

在短肽Arg-Arg-Tyr的基礎(chǔ)上添加Trp或Phe，能夠達(dá)到相同或者相近的效果，與Arg-Arg-Tyr的效果無(wú)顯著差異。

實(shí)施例4化妝品的制備

取Arg-Arg-Tyr肽添加化妝品中可接受的輔料按照常規(guī)制備方法制得化妝品。所述化妝品是指以涂沫、噴灑或其他類似方法，施于人體表面(如表皮、毛發(fā)、指甲、口唇等)，起到清潔、保養(yǎng)、美化或消除不良?xì)馕蹲饔玫漠a(chǎn)品，該產(chǎn)品對(duì)使用部位可以有緩和作用。

所述化妝品的劑型為液體、蜜劑、奶劑、膏劑、霜?jiǎng)?、粉劑、塊狀、棒狀中的一種或多種。

所述肽的濃度為0.01-100μM。

實(shí)施例5化妝品的檢驗(yàn)

按照化妝品國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)施例3制備的化妝品進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果如表4：

表4 化妝品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及結(jié)果

以上結(jié)果表明，本發(fā)明制得的化妝品符合中華人民共和國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。