本發(fā)明屬于醫(yī)藥領域，具體涉及一系列具有蛋白激酶抑制作用的取代2-(吡啶-2-基)氨基嘧啶類化合物及其制備方法和醫(yī)藥用途。
背景技術：
：細胞周期是細胞生命活動的重要部分，在正常的細胞生長過程中，細胞周期進程的實現(xiàn)有賴于各級調(diào)控因子對細胞周期精確而嚴密的調(diào)控。這些調(diào)控因子的核心是細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶(CyclinDependentKinase,CDK)及其正、負性調(diào)控因子———細胞周期蛋白(Cyclin)和細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶抑制劑(CDI)。細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶和細胞周期蛋白形成的CDK-Cyclin復合物，參與細胞的生長、增殖、休眠或者進入凋亡。細胞周期的過程中，細胞周期蛋白周期性連續(xù)的表達和降解，并分別結(jié)合到由它們瞬時活化的CDK上，通過CDK活性，催化不同底物磷酸化，實現(xiàn)對細胞周期不同時相的推進和轉(zhuǎn)化作用。目前CDK家族已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了13個成員，分別是CDK1-CDK13；其中CDK1、CDK2、CDK3、CDK4和CDK6與調(diào)節(jié)細胞增殖有關，CDK7、CDK8、CDK9、CDK11、CDK12和CDK13參與調(diào)控轉(zhuǎn)錄。Cyclin分為A-L，不同的CDK分別連接不同亞型的Cyclin。其中，CyclinD家族(CyclinD1，D2，D3)，在G1期開始表達，結(jié)合并激活CDK4和CDK6，形成CDK4/6-CyclinD復合物，使包括視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白(Retinoblastomaprotein,Rb)在內(nèi)的一系列底物磷酸化。Rb磷酸化后釋放與其結(jié)合并被其抑制的蛋白，主要是轉(zhuǎn)錄因子E2F等，E2F激活并轉(zhuǎn)錄進入S期所必須的一些基因(馬珂，CDK4/6抑制劑抗腫瘤作用研究進展，《國外醫(yī)藥·抗生素分冊》，2013，34(5)：197-202)。如果由于各種因素使平衡被打破，無論是促進細胞增殖的信號增強，或者是抑制細胞增殖的信號減弱到某種程度，細胞增殖都會失控，進而出現(xiàn)腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，大約80％的人類腫瘤中存在CyclinD–CDK4/6–INK4–Rb通路的異常(1.MalumbresM,BarbacidM.,Tocycleornottocycle:acriticaldecisionincancer[J].NatureReviewsCancer,2001,1(3):222；2.ShapiroGI.,Cyclin-dependentkinasepathwaysastargetsforcancertreatment[J].JClinicalOncology,2006,24(11):1770)。這條通路的改變，加速了G1期進程，使得腫瘤細胞增殖加快而獲得生存優(yōu)勢。因此，對其的干預成為一種治療策略，CDK4/6因此成為潛在的抗腫瘤的靶點之一。CDK4/6作為抗腫瘤靶點的優(yōu)勢在于：(1)大多數(shù)增殖的細胞依賴CDK2或者CDK4/6增殖，但CDK4/6的抑制劑不表現(xiàn)出“泛-CDK抑制劑”的細胞毒性，如骨髓抑制和腸道反應。(2)臨床前實驗表明，如果細胞CyclinD水平升高或者p16INK4a失活，能夠增加細胞對藥物的敏感性，由于腫瘤細胞相對于正常細胞存在上述現(xiàn)象，所以一定程度上增加了藥物的靶向。除了抑制腫瘤生長，也有CDks抑制劑用于其它病癥的治療；如用于治療心血管障礙，包括動脈粥樣硬化、血管支架植入后再狹窄和其它由細胞異常增殖引起的心血管障礙；再如用于治療真菌、原生動物寄生蟲(如惡性瘧原蟲)和DNA與RNA病毒感染引起的疾病，包括瘧疾、艾滋病等。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)CDKs抑制劑還可以用于自身免疫系統(tǒng)疾病(如牛皮癬、類風濕性關節(jié)炎、腎小球性腎炎和紅斑狼瘡等)，抑制炎癥細胞的增殖。自WO9811095中公開了一系列具有細胞激酶抑制活性的2-嘧啶胺類化合物后，基于這樣的母核結(jié)構(gòu)，現(xiàn)有技術陸續(xù)出現(xiàn)了很多宣稱具有CDK4/6抑制活性的化合物，有的已經(jīng)成為有希望的候選藥物，甚至進入臨床III期試驗階段。如，化合物PD0332991在WO2003062236中被公開，又名Palbociclib，結(jié)構(gòu)式如1所示，由輝瑞公司開發(fā)。PD0332991抑制CDK4和CDK6的IC50分別為11nmol/L和15nmol/L；而抑制CDK2、CDK1和CDK5的IC50則大于10μmol/L(FryDW,HarveyPJ,KellerPR,etal.Specificinhibitionofcyclin-dependentkinase4/6byPD0332991andassociatedantitumoractivityinhumantumorxenografts[J].MolecularCancerTherapeutics,2004,3(11):1427)。諾華公司在研的化合物LEE011(由WO2011101409公開)，結(jié)構(gòu)式如2所示?；衔風Y2835219(由WO2010075074公開)，又名Bemaciclib，結(jié)構(gòu)式如3所示；據(jù)報道，它對CDK4和CDK6的抑制IC50分別為2nmol/L和9.9nmol/L(LawrenceM.G.,S.F.Cai,X.Linetal.PreclinicalcharacterizationoftheCDK4/6inhibitorLY2835219:in-vivocellcycle-dependent/independentanti-tumoractivitiesalone/incombinationwithgemcitabine[J].InvestNewDrugs,(2014),32:825)。目前LY2835219正在由禮來公司進行III期臨床實驗。由于這些化合物的出現(xiàn)，CDK4/6已經(jīng)成為明確的抗腫瘤靶點。申請人也就一系列新的取代2-(吡啶-2-基)氨基嘧啶類化合物提出過專利申請(申請?zhí)?01510708487.3，申請日2015年10月27日),這些化合物顯示出選擇性抑制CDK4/6的活性。惡性腫瘤依然嚴重威脅人類的健康。研發(fā)出活性、選擇性、生物利用度更好的CDK4/6抑制劑，從而為臨床提供更多治療癌癥等與細胞異常增殖相關疾病的新選擇，是十分必要和迫切的。技術實現(xiàn)要素：針對上述問題，本發(fā)明的一個目的在于提供一種新的取代2-(吡啶-2-基)氨基嘧啶類化合物。本發(fā)明提供的化合物，能夠選擇性抑制細胞周期蛋白激酶CDK4/6，使細胞停止在G1期，從而可以用于治療細胞增殖障礙性疾病。為了達到上述技術效果，本發(fā)明采用了如下的技術方案：一種結(jié)構(gòu)式I的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體，氘代化合物，前藥或其混合物形式，或結(jié)構(gòu)式I的化合物、其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體，氘代化合物，前藥或其混合物的藥學上可以接受的鹽或溶劑化物，其中，R1，R2，R3各自獨立地選自氫原子、未被取代的C1-C6的烴基或被一個或多個選自C1-C6的烴基、C3-C6的環(huán)烷基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的烷氧基、羥基、鹵素、氰基、-NR8R9、的取代基取代的C1-C6的烴基；或者R1，R2，R3中的任意兩個與各自連接的C原子一起形成飽和或不飽和的3-7元環(huán)；R4和R5各自獨立地選自氫、鹵素，且R4和R5中至少一個是鹵素；R6選自氫原子、C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、羥基或鹵素；R7為其中，Z是羰基、O、S、亞胺基、磺?；騨＝0-4的整數(shù)；W和Y各自獨立地是C、N、O或S，但W和Y不能同時是C，且當Z是O或S時，W是C；R10、R11、R12和R13各自獨立地選自氫原子、C1-C6的烷基、C3-C6的環(huán)烷基、C1-C6的羥基烷基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的烷氧基、羥基、鹵素、氰基、-NR8R9、且Y＝N時，R10不能是NH2、-NHR8、-NR8R9、或者，R6和R7與其連接的C原子一起形成含一個或多個選自N、O或S的5-7元雜環(huán)，并且所述5-7元雜環(huán)被一個或多個選自C1-C6的烷基、C3-C6的環(huán)烷基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的烷氧基、C1-C6的羥基烷基、羥基、鹵素、氰基、-NH2、-NHR8、-NR8R9、的取代基所取代；其中，R8和R9各自獨立地選自氫原子、C1-C6的烷基、C1-C6的羥基烷基。優(yōu)選的，R1，R2，R3各自獨立地選自氫原子、未被取代的C1-C6的烴基或被一個或多個選自C1-C6的烴基、C3-C6的環(huán)烷基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的烷氧基、羥基或鹵素的取代基取代的C1-C6的烴基。更優(yōu)選的，R1，R2，R3各自獨立地選自氫原子、未被取代的C1-C6的烴基或被一個或多個選自C1-C6的烴基、羥基或鹵素的取代基取代的C1-C6的烴基。進一步優(yōu)選的，R1，R2，R3各自獨立地選自氫原子、未被取代的C1-C6的直鏈或支鏈烷基、未被取代的C2-C4的直鏈或支鏈烯基。最優(yōu)選的，R1，R2，R3各自獨立地選自氫原子、未被取代的C1-C4的直鏈或支鏈烷基。作為另一種優(yōu)選的方式，R2和R3與共同連接的C原子一起形成飽和或不飽和的3-7元環(huán)。更優(yōu)選的，R2和R3與共同連接的C原子一起形成飽和的3-7元環(huán)。優(yōu)選的，R4和R5各自獨立地是氫、氟或氯，且R4和R5中至少一個是氟或氯。更優(yōu)選的，R4和R5各自獨立地是氫或氟，且R4和R5中至少一個是氟。最優(yōu)選的，R4是氫或氟，R5是氟。優(yōu)選的，R6選自氫原子或C1-C6的烷基。優(yōu)選的，Z是羰基、O或n＝0-4的整數(shù)。更優(yōu)選的，Z是n＝0-2的整數(shù)，進一步優(yōu)選的，n＝0或1。優(yōu)選的，W和Y各自獨立地選自C或N，但W和Y不能同時是C。優(yōu)選的，R10、R11、R12和R13各自獨立地選自氫原子、C1-C6的烷基、C3-C6的環(huán)烷基、C1-C6的羥基烷基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的烷氧基、羥基或-NR8R9，且Y＝N時，R10不能是-NR8R9，R8和R9各自獨立地選自氫原子和C1-C4的烷基。更優(yōu)選的，R10、R11、R12和R13各自獨立地選自氫原子、C1-C6的烷基、C1-C6的羥基烷基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的烷氧基或-NR8R9，R8和R9各自獨立地選自氫原子和C1-C4的烷基。進一步優(yōu)選的，R7選自如下結(jié)構(gòu)的取代基：其中，R14和R15各自獨立地選自氫原子、C1-C6的烷基、C3-C6的環(huán)烷基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的羥基烷基、C1-C6的烷氧基或羥基，R16選自氫原子、C3-C6的環(huán)烷基、C1-C6的鹵代烷基、C1-C6的羥基烷基、C1-C6的烷氧基、羥基或-NR8R9，R8和R9各自獨立地選自氫原子和C1-C4的烷基。更優(yōu)選的，R14和R15各自獨立地選自氫原子、C1-C6的烷基、C3-C6的環(huán)烷基、C1-C6的羥基烷基，R16選自氫原子、C1-C6的烷基、C3-C6的環(huán)烷基、C1-C6的羥基烷基或-NR8R9，R8和R9各自獨立地選自氫原子和C1-C4的烷基。作為另一種優(yōu)選的方式，R6和R7與其連接的C原子一起形成含一個或多個選自N、O或S的6元雜環(huán)。更優(yōu)選的，R6和R7與其連接的C原子一起形成含一個N的6元雜環(huán)。進一步優(yōu)選的，R6和R7與其連接的C原子一起形成如下的化學結(jié)構(gòu)：其中R17選自羥基或C1-C3的烷氧基；進一步優(yōu)選為羥基。作為優(yōu)選實施方式，本發(fā)明還提供結(jié)構(gòu)式II、III、IV或V的化合物或各自的互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體，氘代化合物，前藥或其混合物形式，或所述結(jié)構(gòu)式II、III、IV或V的化合物、各自的互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體，氘代化合物，前藥或其混合物的藥學上可以接受的鹽或溶劑化物，其中，Z、W、Y、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R10、R11和R17的定義如前，A環(huán)為飽和的3-7元環(huán)。優(yōu)選的，A環(huán)為飽和3-6元環(huán)。更優(yōu)選的，本發(fā)明提供結(jié)構(gòu)式VIII的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體，氘代化合物，前藥或其混合物形式，或所述結(jié)構(gòu)式VIII的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體，氘代化合物，前藥或其混合物的藥學上可以接受的鹽或溶劑化物，其中，R20、R21、R22各自獨立地選自C1-C4的烷基，或者R20為C1-C4的烷基，R21和R22與其共同連接的C原子形成5-6元飽和環(huán)；R23選自氫或氟；n＝0或1；R24選自氫、C1-C4的烷基或C1-C4的羥基烷基。本發(fā)明提供如下結(jié)構(gòu)的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體，氘代化合物，前藥或其混合物形式，或所述化合物、其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體，氘代化合物，前藥或其混合的藥學上可以接受的鹽或溶劑化物：本發(fā)明所述的化合物還包括同位素標記的上述所有化合物。本發(fā)明還提供一種結(jié)構(gòu)式VI的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體或其混合物形式，或所述結(jié)構(gòu)式VI的化合物、其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體的藥學上可以接受的鹽或溶劑化物，其中R1、R2、R3、R4和R5的定義如前，X為離去基團或氨基。優(yōu)選的，X是鹵素或氨基，更優(yōu)選是氟、溴、氯或氨基。本發(fā)明還有一個目的在于提供結(jié)構(gòu)式I的化合物的制備方法，包括結(jié)構(gòu)式VI和結(jié)構(gòu)式VII的化合物在溶劑中，經(jīng)鈀催化偶聯(lián)反應得到結(jié)構(gòu)式I的化合物，其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7的定義如前，X和M各自獨立地為離去基團或氨基，X和M中只能有一個且必須有一個為氨基；優(yōu)選的，所述離去基團為鹵素；更優(yōu)選的，所述離去基團為氟、溴或氯。本發(fā)明的另一個目的在于提供結(jié)構(gòu)式I-V和VIII的化合物或其各自的互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體，氘代化合物，前藥或其混合物形式，或所述結(jié)構(gòu)式I-V和VIII的化合物或其各自的互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體，氘代化合物，前藥或其混合物的藥學上可以接受的鹽或溶劑化物在制備用于治療細胞增殖障礙性疾病的藥物制劑中的用途。優(yōu)選的，所述藥物制劑包括藥學上可以接受的輔料。優(yōu)選的，所述細胞增殖障礙性疾病是指哺乳動物或人的癌癥，更優(yōu)選的是指人的癌癥，包括惡性實體瘤和惡性非實體瘤，具體包括但不限于乳腺癌、肺癌、前列腺癌、白血病、腦癌、胃癌等。還優(yōu)選的，所述細胞增殖障礙性疾病還可以是指艾滋病、動脈粥樣硬化、血管支架植入后再狹窄。優(yōu)選的，上述用途是指所述結(jié)構(gòu)式I-V的化合物或其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體或其混合物形式，或所述結(jié)構(gòu)式I-V的化合物、其互變異構(gòu)體、內(nèi)消旋體、外消旋體、對映異構(gòu)體、非對映異構(gòu)體的藥學上可以接受的鹽或溶劑化物作為唯一活性成分或聯(lián)合其它具有生物活性的物質(zhì)在制備用于治療細胞增殖障礙性疾病的藥物制劑中的用途。所述其它具有生物活性的物質(zhì)包括但不限于抗癌劑、免疫抑制劑、抗病毒劑等。其中，所述抗癌劑選自烷化劑(如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、塞替派、司莫司汀、鹽酸氮芥、白消安、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、硝卡芥、氮甲、卡莫司汀、洛莫司汀、六甲蜜胺、二溴甘露醇等)，抗代謝類抗腫瘤藥(阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨喋呤、羥基脲、替加氟、甲異靛、巰嘌呤等)，鉑絡合劑(如順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等)，抗生素類抗腫瘤藥(放線菌素D、絲裂霉素、阿霉素、平陽霉素、表柔比星、吡柔比星、柔紅霉素、博來霉素等)，天然來源抗腫瘤藥(高三尖杉酯堿及其衍生物、長春新堿及其衍生物、羥喜樹堿及其衍生物、依托泊苷及其衍生物、長春地辛及其衍生物、長春堿及其衍生物、重酒石酸長春瑞賓、紫杉醇及其衍生物、秋水仙堿及其衍生物、欖香烯及其衍生物等)，激素類抗腫瘤藥(如氨魯米特、他莫昔芬、地塞米松、度他雄胺、氟他胺、戈那瑞林、醋酸亮丙瑞林、來曲唑等)，VEGFR或EGFR抑制劑(如舒尼替尼、索拉非尼、伊馬替尼、吉非替尼、埃羅替尼、凡德替尼、帕唑帕尼、拉帕替尼、卡奈替尼、阿法替尼、木利替尼、達沙替尼、來那替尼等)，抗體抗腫瘤藥(如曲妥單抗、帕妥珠單抗、利妥昔單抗、帕尼單抗、貝伐單抗、伊匹單抗、奧法木單抗、雷莫盧單抗等)，mTOR抑制劑(如依維莫司、西羅莫司、佐他莫司等)，治療腦瘤類用藥替莫唑胺等。本發(fā)明還提供一種治療患有所述細胞增殖障礙性疾病的患者的方法，包括對所述患者通過口服或非口服途徑給予有效劑量的本發(fā)明所述化合物。優(yōu)選的，上述治療患有所述細胞增殖障礙性疾病的患者的方法，包括對所述患者通過口服或非口服途徑給予有效劑量的本發(fā)明所述化合物和所述其它具有生物活性的物質(zhì)。所述其它具有生物活性的物質(zhì)包括但不限于抗癌劑、免疫抑制劑、抗病毒劑等。其中，所述抗癌劑選自烷化劑(如環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、塞替派、司莫司汀、鹽酸氮芥、白消安、苯丁酸氮芥、苯丙氨酸氮芥、硝卡芥、氮甲、卡莫司汀、洛莫司汀、六甲蜜胺、二溴甘露醇等)，抗代謝類抗腫瘤藥(阿糖胞苷、氟尿嘧啶、甲氨喋呤、羥基脲、替加氟、甲異靛、巰嘌呤等)，鉑絡合劑(如順鉑、卡鉑、奧沙利鉑等)，抗生素類抗腫瘤藥(放線菌素D、絲裂霉素、阿霉素、平陽霉素、表柔比星、吡柔比星、柔紅霉素、博來霉素等)，天然來源抗腫瘤藥(高三尖杉酯堿及其衍生物、長春新堿及其衍生物、羥喜樹堿及其衍生物、依托泊苷及其衍生物、長春地辛及其衍生物、長春堿及其衍生物、重酒石酸長春瑞賓、紫杉醇及其衍生物、秋水仙堿及其衍生物、欖香烯及其衍生物等)，激素類抗腫瘤藥(如氨魯米特、他莫昔芬、地塞米松、度他雄胺、氟他胺、戈那瑞林、醋酸亮丙瑞林、來曲唑等)，VEGFR或EGFR抑制劑(如舒尼替尼、索拉非尼、伊馬替尼、吉非替尼、埃羅替尼、凡德替尼、帕唑帕尼、拉帕替尼、卡奈替尼、阿法替尼、木利替尼、達沙替尼、來那替尼等)，抗體抗腫瘤藥(如曲妥單抗、帕妥珠單抗、利妥昔單抗、帕尼單抗、貝伐單抗、伊匹單抗、奧法木單抗、雷莫盧單抗等)，mTOR抑制劑(如依維莫司、西羅莫司、佐他莫司等)，治療腦瘤類用藥替莫唑胺等。本發(fā)明的說明書中，如無特殊說明，所述“C1-C6烷基”指的是C1-C6的直鏈或支鏈烷基；“C1-C4烷基”指的是C1-C4的直鏈或支鏈烷基，優(yōu)選為甲基、乙基、丙基或異丙基。所述“C1-C6烷氧基”，指的是C1-C6的直鏈或支鏈烷氧基，優(yōu)選為C1-C4的直鏈或支鏈烷氧基，進一步優(yōu)選為甲氧基、乙氧基、丙氧基或2-甲基乙氧基。所述“C3-C6環(huán)烷基”，指的是未取代或C1-C4烷基、C1-C4烷氧基取代的C3-C6的環(huán)烷基，優(yōu)選為未取代或C1-C4烷基、C1-C4烷氧基取代的C3-C6的環(huán)烷基，進一步優(yōu)選為環(huán)丙烷、環(huán)丁烷、甲基環(huán)丙烷、環(huán)戊烷或環(huán)己烷。所述“鹵素”，指的是溴，氯或氟。所述“C1-C6鹵代烷基”指的是溴取代，氯取代或氟取代C1-C6的直鏈或支鏈烷基，優(yōu)選為氯取代或氟取代C1-C4的直鏈或支鏈烷基，進一步優(yōu)選為一氟代甲基、二氟代甲基、三氟代甲基、一氯代甲基、二氯代甲基、三氯代甲基、1-氟乙基、1-氯丙基、1-氯乙基、1-氯丙基?，F(xiàn)有研究認為，CDKs抑制劑的毒性主要與其抑制CDK1和其它蛋白激酶有關，如由同名的原癌基因編碼的蘇氨酸/絲氨酸激酶Pim-1。因此，作為CDKs抑制劑類化合物，希望其對CDK4/CDK6和CDK1以及其它激酶的作用差異越顯著越好，即選擇性抑制CDK4/CDK6。本發(fā)明提供的化合物其活性優(yōu)于或與目前處于III期臨床試驗的候選藥物LY2835219相當，部分化合物表現(xiàn)出更好的激酶選擇性。而且優(yōu)選的化合物(實施例17制備)口服吸收良好、血腦分布好。上述結(jié)果預示著本發(fā)明的化合物有希望被開發(fā)成新的治療細胞增殖相關疾病，尤其是惡性腫瘤(特別是腦癌)的藥物。具體實施方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明所述的結(jié)構(gòu)式VI的化合物是合成結(jié)構(gòu)式I的化合物的關鍵中間體，其和結(jié)構(gòu)式VII的化合物在溶劑中，經(jīng)鈀催化偶聯(lián)反應得到結(jié)構(gòu)式I的化合物。結(jié)構(gòu)式VI的化合物可以通過如下的反應路線合成：其中，R1、R2、R3、R4、R5、R6和R7的定義如前，X為離去基團或氨基。優(yōu)選的，R1，R2，R3各自獨立地選自氫原子、未被取代的C1-C6的烴基或被一個或多個選自C1-C6的烴基、羥基或鹵素的取代基取代的C1-C6的烴基。更優(yōu)選的，R1，R2，R3各自獨立地選自氫原子、未被取代的C1-C6的直鏈或支鏈烷基、未被取代的C2-C4的直鏈或支鏈烯基。進一步優(yōu)選的，R1，R2，R3各自獨立地選自氫原子、未被取代的C1-C4的直鏈或支鏈烷基?；蛘?，作為另一種優(yōu)選的方式，R1如前所述，R2和R3與共同連接的C原子一起形成飽和或不飽和的3-7元環(huán)；更優(yōu)選的，R2和R3與共同連接的C原子一起形成飽和的3-7元環(huán)。優(yōu)選的，R4和R5各自獨立地是氫或氟，且R4和R5中至少一個是氟。X優(yōu)選為鹵素或氨基，更優(yōu)選為氟、溴、氯或氨基。R6優(yōu)選為氫原子或C1-C4的烷基。R7優(yōu)選為如下結(jié)構(gòu)的取代基：其中，R14和R15各自獨立地選自氫原子、C1-C4的烷基、C1-C4的羥基烷基。或者，作為另一個優(yōu)選的實施方式，R6和R7與其連接的C原子一起形成如下的化學結(jié)構(gòu)：其中R17選自羥基或C1-C3的烷氧基；進一步優(yōu)選為羥基。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的化學原料、試劑等，如無特殊說明，均為市售購買產(chǎn)品。本發(fā)明實施例中出現(xiàn)的縮略語及其含義如下所示：PE：石油醚EA：乙酸乙酯DCM：二氯甲烷MeOH：甲醇Pd(dppf)Cl2：[1,1'-雙(二苯基磷)二茂鐵]二氯化鈀Pd(PPh3)4：：四(三苯基膦)鈀Pd2(dba)3：三(二亞芐基丙酮)二鈀NaHB(OAc)3：三乙酰氧基硼氫化鈉LHMDS：六甲基二硅基胺基鋰DAPI：DAPI熒光染料實施例15-氟-4-(7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-基)-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基步驟14-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧基叔丁酯的合成向反應瓶中加入5-溴-2-硝基吡啶(5.0g,24.63mmol)，哌嗪-1-羧基叔丁酯(5.04g,27.09mol)，乙腈(30mL),二異丙基乙胺(4.77g,36.94mmol)，回流反應2h,旋干溶劑，柱色譜分離(PE/EA＝1:1至DCM/MeOH＝20:1)，得到標題化合物3.8g(黃色固體)。MS(ESI):masscalcd.forC14H20N4O4308.1,m/zfound309.1[M+H]+.步驟24-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧基叔丁酯的合成向反應瓶中加入步驟1制備的4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧基叔丁酯(0.92g,3.0mmol)，乙酸乙酯/甲醇(10mL/10mL),Pd/C(0.1g)，通入氫氣室溫反應2小時，過濾，濃縮，得到標題化合物792mg(類白色固體)。MS(ESI):masscalcd.forC14H22N4O2278.2,m/zfound279.2[M+H]+.步驟35-溴-7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚的合成向反應瓶中加入(4-溴-2-氟苯)肼鹽酸鹽(1.0g,4.14mmol)，醋酸(10ml),3-甲基-2酮(0.32g,4.14mmol)，然后回流反應5小時，旋干溶劑，加入20ml水，用乙酸乙酯萃取三次，每次20ml，合并有機相，然后用25ml飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，柱色譜分離(DCM:MeOH＝50:1-25:1)，得到標題化合物420mg(黃色固體)。1H-NMR(CDCl3,300MHz)δ：7.21(s,1H),7.19(s,1H),2.28(s,3H),1.30(s,6H).MS(ESI):257.1[M+H]+.步驟47-氟-2，3，3-三甲基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧雜硼酸-2-基)-3H-吲哚的合成向反應瓶中加入步驟1制備的5-溴-7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(400.0mg,1.56mmol),4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-雙(1,3,2-二氧雜環(huán)戊硼烷)(436.5mg,1.71mmol)，乙酸鉀(306.3mg,3.12mmol)，二氧六環(huán)(10ml)，Pd(dppf)Cl2(228.7mg,0.32mmol)，氮氣保護，加熱至90℃，反應過夜；混合物冷卻至室溫，過濾，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取三次，每次20ml；合并乙酸乙酯有機相，用25ml飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，硅膠柱色譜分離(DCM:MeOH＝50:1-30:1)，得到標題化合物306.5mg(黃色油狀物)。MS(ESI):m/z304.1[M+H]+.步驟55-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚的合成向微波反應瓶中加入步驟2制備的7-氟-2,3,3-三甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼酸-2-基)-3H-吲哚(300mg,0.99mmol),，2,4-二氯-5-氟嘧啶(181.8mg,1.08mmol),磷酸鉀(419.8mg,1.98mmol)，二氧六環(huán)/水(4mL/1mL)，Pd(PPh3)4(114.5mg,0.09mmol)，氮氣保護，在130℃下微波反應1小時；冷卻至室溫，過濾，加入10ml水，用二氯甲烷萃取三次，每次15ml；合并二氯甲烷有機相，用20ml飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，然后用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，硅膠柱色譜分離(DCM:MeOH＝100:1-50:1)，得到標題化合物301.2mg(黃色固體)。MS(ESI):masscalcd.forC15H12ClF2N3307.1,m/zfound308.1[M+H]+.步驟64-(6-((5-氟-4-(7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧基叔丁酯的合成向反應瓶中加入步驟5制備的5-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(150.0mg,0.48mmol),步驟2制備的4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧基叔丁酯(135.8mg,0.48mmol)，碳酸銫(371.6mg,0.96mmol)，二氧六環(huán)(3ml)，Pd2(dba)3(44.7mg,0.05mmol)，4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽(30.4mg,0.05mmol)，氮氣保護，加熱至150℃，微波反應1小時，冷卻至室溫；過濾，加入10ml水，用二氯甲烷萃取三次，每次10ml，合并有機相，用30ml飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，硅膠柱色譜分離(DCM/MeOH＝50:1)，得到標題化合物53.4mg(黃色固體)。MS(ESI):masscalcd.forC29H33F2N7O2549.3,m/zfound550.3[M+H]+.步驟75-氟-4-(7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-基)-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基三氟乙酸鹽的合成向反應瓶中加入步驟6制備的4-(6-((5-氟-4-(7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧基叔丁酯(30.0mg,0.054mmol)，二氯甲烷(4ml)，三氟乙酸(1ml)，室溫攪拌反應2小時；旋干溶劑，用飽和碳酸氫鈉水溶液調(diào)pH到8，用二氯甲烷萃取三次，每次5ml，合并有機相，用10ml飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，有機相用無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，硅膠柱色譜分離(DCM/MeOH＝20:1)，得到標題化合物10.5mg(黃色固體)。1H-NMR(DMSO-d6,300MHz)δ11.49(s,1H),9.91(s,1H),8.71(d,J＝2.7Hz,1H),8.19-8.11(m,2H),7.97(s,1H),7.85(d,J＝8.7Hz,1H),7.66(m,1H),3.20–3.17(m,4H),3.07–2.99(m,4H),2.37(s,3H),1.35(s,6H).MS(ESI):masscalcd.forC24H25F2N7449.50,m/zfound450.2[M+H]+.實施例2N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-基)嘧啶-2-氨基步驟11-((6-溴吡啶-3-基yl)甲基)-4-乙基哌嗪的合成向反應瓶中加入2-溴-5醛基吡啶(1.5g,8.15mmol)，1-乙基哌嗪(0.93g,8.15mmol)，二氯甲烷(15mL),然后分批加入NaHB(OAc)3(2.58g,12.23mmol)。室溫反應過夜，過濾，濃縮，柱色譜分離(DCM/MeOH＝100:1-10:1)，得到標題產(chǎn)物1.64g(黃色油狀物)。MS(ESI):masscalcd.forC12H18BrN3283.1,m/zfound284.1[M+H]+.步驟25-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-氨基的合成向反應瓶中加入步驟1制備的1-((6-溴吡啶-3-基yl)甲基)-4-乙基哌嗪(2.84g,10mmol),2-(二環(huán)己基膦基)聯(lián)苯(700mg,2mmol),Pd2(dba)3(915mg,1mmol)，甲苯(30mL)，氮氣保護下加入LHMDS(1N)(20ml,20mmol).該混合物加熱到80℃反應過夜，然后冷卻到室溫，過濾，濃縮，柱色譜分離(DCM/MeOH＝100:1-10:1)，得到標題產(chǎn)物1.52g(褐色固體)。MS(ESI):masscalcd.forC13H21N3220.2,m/zfound221.2[M+H]+.步驟35-溴-7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚的合成向反應瓶中加入(4-溴-2-氟苯)肼(900.0mg,3.73mmol)，乙酸(5mL)，3-甲基丁基-2-酮(353.3mg,.09mmol)，回流反應5小時；旋干溶劑，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取三次，每次20ml，合并有機相，有機相用25ml飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，硅膠柱色譜分離(乙酸乙酯:石油醚＝1:50-1:25)，得到標題化合物910mg(黃色固體)。MS(ESI):m/z257.1[M+H]+.步驟47-氟-2,3,3-三甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼酸-2-基)-3H-吲哚的合成向反應瓶中加入按照步驟3所述方法制備的5-溴-7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(1.0g,3.91mmol)，4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-雙(1,3,2-二氧雜硼烷)(1.09g,4.29mmol)，醋酸鉀(770mg,7.82mmol)，二氧六環(huán)(10ml)，Pd(dppf)Cl2(570mg,0.78mmol)，氮氣保護，升溫至90℃過夜反應，然后冷卻至室溫，過濾，加入10ml水稀釋，用乙酸乙酯萃取三次，每次20ml。合并有機相，有機相用25ml飽和食鹽水洗滌一次，硫酸鈉干燥，過濾，旋干，硅膠柱色譜分離(EA:PE＝1:100-1:20)，得到標題化合物1.02g(黃色油狀物)。MS(ESI):m/z304.2[M+H]+.步驟55-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚的合成向微波反應瓶中加入步驟4制備的7-氟-2,3,3-三甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼酸-2-基)-3H-吲哚(1.0g,3.30mmol)，2,4-二氯-5氟嘧啶(610mg,3.63mmol)，磷酸鉀(1.39g,6.60mmol)，二氧六環(huán)/水(8mL/2mL)，Pd(PPh3)4(380mg,0.33mmol)，氮氣保護，在130℃下微波反應1小時；冷卻至室溫，過濾，加入10ml水，用二氯甲烷萃取三次，每次15ml，合并有機相，有機相用20ml飽和食鹽水洗滌一次，用無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，硅膠柱色譜分離(EA:PE＝1:50-1:10)，得到標題化合物290.0mg(黃色固體)。MS(ESI):m/z308.1[M+H]+.步驟6N-(5-((4-以及哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-基)嘧啶-2-氨基的合成向反應瓶中加入步驟5制備的5-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚(290.0mg,0.94mmol)，步驟2制備的5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-氨基(228.6mg,1.04mmol)，磷酸鉀(400.5mg,1.88mmol)，二氧六環(huán)10ml，Pd2(dba)3(86.4mg,0.09mmol)，4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽(109.2mg,0.19mmol)，氮氣保護，升溫至150℃微波反應1小時；混合物冷卻至室溫，過濾，加入10ml水稀釋，用二氯甲烷萃取三次，每次10ml，合并有機相；有機相用30ml飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，旋干，硅膠柱色譜分離(二氯甲烷:甲醇＝30:1)，得到標題化合物140.3mg(黃色固體)。1H-NMR(DMSO-d6,300MHz),δ9.98(s,1H),8.71(s,1H),8.19-8.15(m,2H),7.98(s,1H),7.83(d,J＝8.7Hz,1H),7.69(d,J＝6.3Hz,1H),3.45(s,2H),2.42-2.37(m,10H),2.32(s,3H),1.35(s,6H),1.00(brs,3H).MS(ESI):m/z492.3[M+H]+.實施例3N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基吡啶-2-基)-5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基按照實施例2中相似的步驟得到標題化合物。1HNMR(DMSO,400MHz),δ10.06(s,1H),8.71-8.70(d,1H),8.19-8.16(m,2H),8.04-8.02(d,1H),7.99(s,1H),7.85-7.82(d,1H),7.68-7.66(d,1H),3.45(s,1H),2.31(m,11H),2.31(m,11H),2.11-2.09(m,2H),1.01-0.97(m,3H).MS(ESI):m/z518.3[M+H]+.實施例4氮-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)丁烷-1,3'-吲哚]-5'-基)氨基嘧啶-2-氨基按照實施例2中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO-d6,300MHz),δ11.67(s,1H),9.95(s,1H),8.63(d,J＝3.3Hz,1H),8.23(d,J＝6.9Hz,1H),8.09(s,1H),7.70-7.60(m,2H),3.51(s,2H),2.89-2.75(m,8H),2.89-2.75(m,8H),2.33-2.31(m,3H),2.02-2.01(m,2H),1.35(s,3H),1.25-1.23(m,4H),0.86-0.85(m,2H).MS(ESI):m/z504.3[M+H]+.實施例54-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-N-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟嘧啶-2-氨基按照實施例2中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ10.03(s,1H),8.72-8.71(d,1H),8.20-8.16(m,2H),7.93(s,1H),7.94(s,1H),7.87-7.84(d,1H),7.71-7.69(d,1H),3.34(m,3H),2.00(s,3H),1.99-1.97(m,1H),1.90-1.88(m,1H),1.33(s,1H),1.01-0.97(t,3H).MS(ESI):m/z506.3[M+H]+.實施例65-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例1中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ10.60(s,1H),8.92(s,2H),8.74-8.73(d,1H),8.04-8.03(d,1H),7.95-7.91(m,2H),7.84-7.81(d,1H),7.75-7.73(m,1H),3.36(brs,4H),3.29(brs,4H),,2.50-2.34(s,3H),2.09-1.74(m,8H).MS(ESI):m/z476.2[M+H]+.實施例74-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例1中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.83(s,1H),8.67-8.66(d,1H),8.07-8.05(m,2H),7.91(s,1H),7.85-7.82(d,1H),7.49-7.47(d,1H),3.34-3.28(m,4H),3.15(brs,4H),2.27(s,3H),1.33(m,3H),1.23(m,3H),0.38-0.34(m,2H).MS(ESI):m/z464.2[M+H]+.實施例8氮-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基按照實施例2中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.92(s,1H),8.61-8.60(d,1H),8.29-8.7.27(m,1H),8.19-8.14(d,2H),8.02-7.99(d,1H),7.69-7.62(m,2H),3.45-3.34(m,2H),2.50-2.21(m,11H),2.16-2.06(m,7H),1.79-1.77(m,2H),1.23(s,1H),1.00-0.97(m,3H).MS(ESI):m/z500.3[M+H]+.實施例9氮-(5-((4-乙基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基按照實施例2中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ10.08(s,1H),8.68-8.67(d,1H),8.25-8.23(d,2H),8.16(s,1H),8.05-8.03(d,1H),7.69-7.67(d,1H),7.61-7.59(d,1H),3.59-3.53(d,2H),3.08-2.50(m,6H),2.39-2.31(m,5H),2.09-2.07(m,6H),1.73-1.71(m,2H),1.34-1.05(m,6H).MS(ESI):m/z500.3[M+H]+.實施例104-(3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚-5-基)-氮-(5-((4-乙基哌啶-1-基)甲基)吡啶-2-基)-5-氟嘧啶-2-氨基按照實施例2中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(D2O,300MHz),δ8.67(s,1H),8.66(s,1H),8.24(s,1H),8.15(d,J＝6.3Hz,1H),7.87(s,2H),7.70(d,J＝6.3Hz,1H),3.47(s,2H),2.53-2.50(m,8H),2.23(s,3H),2.23-2.01(m,2H),2.00-1.98(m,2H),1.04(t,J＝5.4Hz,3H),0.31(t,J＝4.2Hz,6H).MS(ESI):m/z520.3[M+H]+.實施例114-(3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基步驟16-硝基-3',6'-二氫-[3,4'-二吡啶]-1'(2'H)-羧基叔丁酯的合成向反應瓶中加入5-溴-2-硝基吡啶(20.3g,0.1mol)，4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧基硼酸-2-基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-羧基叔丁酯(31g,0.1mol)，二氧六環(huán)/水(250mL/30mL),碳酸銫(66g,0.2mol),Pd(dppf)Cl2(7.33g,0.01mol)，氮氣保護。該混合物被加熱至85℃反應12小時,冷卻至室溫，濃縮，柱色譜分離(PE/EA＝1:1-DCM/MeOH＝20:1)得到標題產(chǎn)物11g(黃色固體)。MS(ESI):masscalcd.forC15H19N3O4305.1,m/zfound306.1[M+H]+.步驟24-(6-氨基吡啶-3-基)哌啶-1-羧基叔丁酯的合成向反應瓶中加入步驟1制備的6-硝基-3',6'-二氫-[3,4'-二吡啶]-1'(2'H)-羧基叔丁酯(0.9g,3.0mmol)，乙酸乙酯/甲醇(10mL/10mL),Pd/C(0.1g)，通入氫氣，室溫反應2小時，過濾，濃縮，得到標題產(chǎn)物790mg(類白色固體)。MS(ESI):masscalcd.forC15H23N3O2277.2,m/zfound278.2[M+H]+.4-(3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基的合成其他步驟按照實施例1中3-7相似的步驟得到本實施例的標題化合物。1H-NMR(D2O,300MHz),δ8.61(d,J＝2.4Hz,1H),8.04-8.02(m,2H),7.83-7.80(m,2H)，7.43(dd,J1＝6.9Hz,J2＝1.8Hz,1H),3.32-3.31(m,4H),3.07-3.06(m,4H),2.22(s,3H),2.02-1.95(m,2H),1.87-1.81(m,2H),0.30(t,J＝5.4Hz,6H).MS(ESI):m/zfound477.3[M+H]+.實施例12氮-(5-(1-乙基哌啶-4-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮(5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基的合成按照實施例11相似的步驟得到該中間體氮-(5-(1-乙基哌啶-4-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基的合成向反應瓶中加入上步制備得到的5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基50mg(0.1mmol)，乙酸酐26mg(0.6mmol)，二氯甲烷5ml，室溫反應0.5小時，然后加入三乙基硼氫化鈉60mg(0.28mmol)，室溫反應2小時，向反應液中加入20ml飽和碳酸鈉水溶液，然后用二氯甲烷萃取三次，每次10mL，合并有機相；有機相用飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，硅膠柱色譜分離(PE/EA＝5:1)，得到標題化合物11mg，收率22％。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ10.08(s,1H),9.88(brs,1H),8.71-8.70(d,1H),8.21-8.16(m,2H),8.01(s,1H),7.85-7.82(d,1H),7.65-7.62(m,1H),3.58-3.55(m,2H),3.17-3.13(s,2H),3.02-2.99(m,2H),2.86(m,1H),2.34(s,3H),2.09-1.95(m,10H),1.75(brs,2H),1.34-1.23(m,3H).MS(ESI):m/z503.3[M+H]+.實施例135-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例11相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(D2O,400MHz),δ8.63-8.62(d,1H),8.16(s,1H),8.08-8.06(d,1H),7.97(s,1H),7.81-7.80(d,1H),7.61-7.59(d,1H),3.03-3.00(d,2H),2.61-2.51(m,3H),2.31(brs,3H),2.01(brs,4H),1.71-1.68(m,4H),1.58-1.49(m,2H),1.06(s,2H).MS(ESI):masscalcd.forC27H28F2N6474.2,m/zfound475.2[M+H]+實施例145-氟-4-(2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例11中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.81-9.76(d,1H),9.12(s,1H),8.62-8.61(d,1H),8.13-8.08(m,3H),8.04-8.01(m,1H),7.59-7.57(d,1H),7.48-7.45(m,1H),3.25-3.23(d,5H),2.30(brs,3H),2.14-2.05(m,6H),1.73-1.68(m,2H).MS(ESI):m/z458.2[M+H]+.實施例155-氟-4-(2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例11中相似步驟得到標題化合物1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.95(s,1H),8.65(s,1H),8.38(s,1H),8.19-8.17(d,2H),8.04-8.03(d,1H),7.63-7.58(m,2H),3.26-3.23(d,5H),2.86-2.73(m,4H),2.31(brs,3H),2.17-2.08(m,4H),1.87-1.84(m,2H),1.74-1.71(m,2H).MS(ESI):m/z457.2[M+H]+.實施例164-(3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基步驟15-溴-3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚的合成向反應瓶中加入10ml乙酸，(4-溴-2-氟苯)肼鹽酸鹽5.0g(20.75mmol)，3-乙基戊烷-2酮2.35g(20.75mmol)，混合物回流反應5小時，旋干溶劑，加入50ml水，然后用乙酸乙酯萃取三次，每次50ml，合并有機相；,有機層用50ml鹽水洗滌一次，加入硫酸鈉干燥，過濾，旋干，柱色譜分離(EA:PE＝1:100-1:10)，得到標題化合物2.5g(黃色油狀物)，收率87.1％。MS(ESI):m/z284.1[M+H]+.步驟23,3-二乙基-7-氟-2-甲基-5-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧硼基-2-基)-3H-吲哚的合成向反應瓶中加入步驟1制備的5-溴-3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚2.0g(7.07mol)，4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-雙(1,3,2-二氧硼戊環(huán))1.97g，(7.77mmol)，醋酸鉀1.38g(1.41mmol)，1,4二氧六環(huán)10ml，Pd(dppf)Cl21.03g(1.41mmo)，氮氣保護，混合物加熱到90℃，反應過夜。混合物冷卻到室溫過濾，用10ml水稀釋，用乙酸乙酯萃取三次，每次10ml，合并有機相。有機相用15ml食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，硅膠柱色譜分離(EA:PE＝1:50-1:10)，得到標題化合物2.0g(黃色油狀物)，收率86.96％。MS(ESI):m/z332.3[M+H]+.步驟35-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚的合成向反應瓶中加入步驟2制備得到的3，3-二乙基-7-氟-2-甲基-5-(4，4，5，5-四甲基-1，3，2-二氧基硼-2-基)-3H-吲哚2.0g(6.05mmol),2,4-二氯-5-氟嘧啶1.10g(6.65mmol)，磷酸鉀2.56g(12.1mmol)，1,4-二氧六環(huán)/水20mL/5ml，Pd(PPh3)40.69g(0.61mmol)，氮氣保護，混合物加熱到120℃反應2小時?；旌衔锢鋮s到室溫，過濾，用10ml水稀釋，用50ml二氯甲烷萃取三次，合并有機相。有機相用20ml食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，硅膠柱色譜分離(EA:PE＝1:100-1:10)，得到1.2g標題化合物(黃色固體)，收率59.4％。MS(ESI):m/z336.1[M+H]+.步驟44-(6-((4-(3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧基叔丁酯的合成向反應瓶中加入步驟3制備得到的5-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚400.0mg(1.19mmol),按照實施例1的步驟1-2制備的叔丁基4-(6-氨基吡啶-3-基)哌嗪-1-羧酸鹽331.9mg(1.19mmol)，碳酸銫776.2mg(2.38mmol)，1,4-二氧六環(huán)10ml，Pd2(dba)3109.5mg(0.12mmol)，4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽69.0mg(0.12mmol)，氮氣保護.混合物在130℃，微波反應1小時?；旌衔锢鋮s到室溫，過濾，用10ml水稀釋，用10ml二氯甲烷萃取三次，合并有機相。有機相用30ml食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，TLC分離得到253.1mg標題化合物(黃色固體)，收率36.74％。MS(ESI):m/z578.3[M+H]+.步驟54-(3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-N-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基的合成向反應瓶中加入步驟4制備得到的4-(6-((4-(3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-羧基叔丁酯250.0mg(0.43mmol)，二氯甲烷4mL，TFA1ml。混合物室溫旋轉(zhuǎn)攪拌2小時，除去溶劑，用5ml飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)pH到8，用二氯甲烷萃取三次，每次5ml，合并有機相。有機相用10ml飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，TLC分離純化，得到標題化合物201.2mg(黃色固體)，收率97.6％。MS(ESI):m/z478.3[M+H]+.步驟64-(3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基的合成向反應瓶中加入4-(3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基50.0mg(0.10mmol)，甲醛30.8mg(1.0mmol)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺2ml，三乙基硼氫化鈉65.3mg(0.3mmol)，反應過夜。加入2ml甲醇萃滅，用二氯甲烷萃取三次，每次5ml。有機相用10ml飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，TLC分離，得到20.3mg標題化合物(黃色固體)，收率39.4％。1H-NMR(DMSO-d6,300MHz),δ9.72(s,1H),8.64(s,1H),8.02-8.00(m,2H),7.90-7.82(m,2H),7.43(d,J＝7.2Hz,1H),3.12-3.10(m,4H),2.50-2.47(m,4H),2.05(s,6H),2.03-2.00(m,2H),1.89-1.84(m,2H),0.34(t,J＝5.4Hz,6H).MS(ESI):m/z491.3[M+H]+實施例175-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例1相似步驟得到中間體5'-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]步驟11'-甲基-6-硝基-1'，2'，3'，6'-四氫-3，4'-二吡啶的合成向反應瓶中加入5-溴-2-硝基吡啶(20.3g,0.1mol)，1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧基硼酸-2-基)-1,2,3,6-四氫吡啶(22.3g,0.1mol)，二氧六環(huán)/水(250mL/30mL),碳酸銫(66g,0.2mol),Pd(dppf)Cl2(7.33g,0.01mol)，氮氣保護。該混合物在85℃攪拌反應12小時，冷卻至室溫，濃縮，柱色譜分離(PE/EA＝1:1-DCM/MeOH＝20:1)，得到標題產(chǎn)物5.7g(白色固體)。MS(ESI):masscalcd.forC11H13N3O2219.1,m/zfound220.1[M+H]+.步驟25-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-氨基的合成向反應瓶中加入步驟1制備的1'-甲基-6-硝基-1',2',3',6'-四氫-3,4'-二吡啶(657mg,3.0mmol)，乙酸乙酯/甲醇(10mL/10mL),Pd/C(0.1g)。向該混合物中通入氫氣，攪拌反應2小時，過濾，濃縮，得到標題產(chǎn)物550mg(白色固體)。MS(ESI):masscalcd.forC11H17N3191.1,m/zfound192.1[M+H]+.步驟35-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基的合成向反應瓶中加入中間體5'-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚](150.0mg,0.45mmol),步驟2制備的5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-氨基(86.6mg,0.45mmol)，碳酸銫(293.2mg,0.9mmol)，二氧六環(huán)(3ml)，Pd2(dba)3(44.7mg,0.05mmol)，4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽(30.4mg,0.05mmol)，氮氣保護，加熱至150℃，微波反應1小時，冷卻至室溫，過濾，加入10ml水，用二氯甲烷萃取三次，每次10ml，合并有機相，用30ml飽和氯化鈉水溶液洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，硅膠柱色譜分離(二氯甲烷/甲醇＝50:1)，得到標題化合物51.1mg(黃色固體)。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.99(s,1H),8.69(s,1H),8.19(s,1H),8.13-8.11(d,1H),8.01(s,1H),7.85-7.82(d,1H),7.66-7.64(d,1H),3.83-3.69(m,3H),2.92-2.89(m,4H),2.34(brs,4H),2.23(brs,3H),2.14-2.03(m,5H),1.74-1.67(m,4H).MS(ESI):m/z489.2[M+H]+.實施例184-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例16中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.71(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.47(brs,4H),2.47(s,3H),2.27(s,3H),2.23-1.84(m,2H),1.33-1.23(m,3H),0.38-0.34(m,3H).MS(ESI):m/z478.3[M+H]+.實施例194-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-氮-(5-(4-乙基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-5-氟嘧啶-2-氨基步驟11-乙基-4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪的合成依次將5-溴-2-硝基吡啶720mg(3.56mol)、4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2,-二氧雜戊硼烷-2-基)-5,6-二氫吡啶-1(2H)-乙基1g(3.24mmol)、碳酸銫2.12g(6.50mmol)，1,4-二氧六環(huán)和水(V/V＝16:1)17mL，加入封管中，氬氣氛下，加入[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡合物230mg(0.32mmol)，85℃反應2h。冷卻至室溫，減壓濃縮，柱色譜分離得到677mg標題化合物(淡黃色固體)，收率67.7％。MS(ESI):m/z237.1[M+H]+.步驟25-(4-乙基哌嗪-1-基)吡啶-2-氨基的合成將步驟1制備得到的1-乙基-4-(6-硝基吡啶-3-基)哌嗪650mg(2.13mmol)溶于45ml甲醇中，加入10％鈀碳(250mg，cat)，氫氣置換三次，3個大氣壓下氫氣氛圍中室溫反應12h。停止反應，少量硅藻土過濾，濾餅用二氯甲烷和甲醇(V/V＝10:1)的混合溶劑20ml洗滌一次，收集濾液，減壓濃縮，得到559mg標題化合物粗品(透明粘稠狀物)，未進一步純化，直接用于后續(xù)反應。MS(ESI):m/z207.1[M+H]+.步驟35-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚的合成該中間體的合成方法與實施例16步驟1-3相同的方法制備得到。步驟44-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-氮-(5-(4-乙基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-5-氟嘧啶-2-氨基的合成向反應瓶中加入步驟3制備得到的5-(2-氯-5-氟嘧啶-4-基)-3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚321mg(1mmol)，步驟2制備得到的5-(4-乙基哌嗪-1-基)吡啶-2-氨基206mg(1mmol)，1,4-二氧六環(huán)2ml,Cs2CO3650mg(2mmol),Pd2(dba)391mg(0.1mmol)，二苯基膦58mg(0.1mmol)；混合物加熱到120℃，微波反應1小時；冷卻至室溫，加入10ml水，然后用乙酸乙酯萃取三次，每次40ml，合并有機相。有機相用40ml飽和食鹽水洗滌一次，硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，硅膠柱色譜分離(DCM/MeOH＝10:1)，得到49mg標題化合物(黃色固體)，收率10％。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.71(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.18(brs,4H),3.06(brs,4H),2.47(s,3H),2.27(s,3H),2.23-1.84(m,2H),1.33-1.23(m,3H),0.38-0.34(m,3H).MS(ESI):m/z492.3[M+H]+.實施例205-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(4-甲基哌啶-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例16中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.77(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.46(brs,4H),2.33(s,3H),2.21(s,3H),2.09-1.17(m,8H).MS(ESI):m/z490.3[M+H]+.實施例21氮-(5-(1-乙基哌啶-4-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基按照實施例12中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.91(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,3H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.46(brs,4H),2.33(s,3H),2.21(s,3H),2.09-1.17(m,8H),1.04(s,3H).MS(ESI):m/z485.3[M+H]+.實施例22氮-(5-(4-乙基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基按照實施例19中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.68(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,2H),3.13-3.11(brs,4H),2.50-2.46(brs,4H),2.38-2.37(m,2H),2.35-2.30(m,3H),2.09-1.17(m,8H).1.02(s,3H).MS(ESI):m/z486.3[M+H]+.實施例23氮-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基按照實施例17中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.90(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.19-8.14(m,3H),7.90-7.80(d,1H),7.64-7.58(d,2H),3.13-3.11(brs,4H),2.50-2.46(brs,4H),2.38-2.37(m,2H),2.35-2.30(m,3H),2.09-1.17(m,8H).MS(ESI):m/z471.3[M+H]+.實施例244-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例17中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.93(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.47(brs,4H),2.47(s,3H),2.27(s,3H),2.23-1.84(m,2H),1.33-1.23(m,3H),0.38-0.34(m,3H).MS(ESI):m/z477.3[M+H]+.實施例255-氟-氮-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-4-(2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基按照實施例16中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.66(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,2H),3.13-3.11(brs,4H),2.50-2.46(brs,4H),2.38-2.37(m,2H),2.35-2.30(m,3H),2.09-1.17(m,8H).MS(ESI):m/z472.3[M+H]+.實施例264-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-氮-(5-(1-乙基吡啶-4-基)吡啶-2-基)-5-氟嘧啶-2-氨基按照實施例12中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.91(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.47(brs,4H),2.47(s,3H),2.27(s,3H),2.23-1.84(m,2H),1.33-1.23(m,3H),0.38-0.34(m,3H).MS(ESI):m/z491.3[M+H]+.實施例27氮-(5-(4-乙基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基按照實施例19中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.74(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.46(brs,4H),2.33(s,3H),2.21(s,3H),2.09-1.17(m,8H),1.04(s,3H).MS(ESI):m/z504.3[M+H]+.實施例282-(4-(6-((5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌嗪-1-基)乙醇向反應瓶中加入5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基20mg(0.04mmol，按照實施例6相同方法制備)，2-溴-乙醇16mg(0.12mmol)，DMF2ml，碳酸銫17mg(0.12mmol)，加熱至80℃，反應1小時，然后冷卻至室溫，加入10ml水，然后用乙酸乙酯萃取三次，每次40ml，合并有機相。有機相用40ml飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，硅膠柱色譜分離(DCM/MeOH＝10:1)，得到標題化合物10mg(黃色固體)，收率55％。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.74(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.46(brs,4H),2.33(s,3H),2.21(s,3H),2.09-1.17(m,8H),1.04(s,3H).MS(ESI):m/z520.3[M+H]+.實施例294-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例13中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.95(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.47(brs,4H),2.47(s,3H),2.23-1.84(m,2H),1.33-1.23(m,3H),0.38-0.34(m,3H).MS(ESI):m/z463.3[M+H]+.實施例302-(4-(6-((5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-基)氨基)吡啶-3-基)哌啶-1-基)乙醇向反應瓶中加入按照實施例13相同的方法制備得到的5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基20mg(0.04mmol)，2-溴乙醇16mg(0.12mmol)，DMF2mL，碳酸銫17mg(0.12mmol)，加熱至80℃，反應1小時；然后冷卻至室溫，加入10ml水，用乙酸乙酯萃取三次，每次40ml，合并有機相。有機相用40ml飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，硅膠柱色譜分離(DCM/MeOH＝10:1)，得到標題化合物10mg(黃色固體)，收率55％。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.74(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.46(brs,4H),2.33(s,3H),2.21(s,3H),2.09-1.17(m,8H),1.04(s,3H).MS(ESI):m/z519.3[M+H]+.實施例315-氟-4-(7-氟-2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-基)-氮-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例17中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.90(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.47(brs,4H),2.47(s,3H),2.27(s,3H),2.23-1.84(m,2H),1.33(s,6H).MS(ESI):m/z463.3[M+H]+.實施例324-(3-乙基-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例6中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.62(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,4H),7.90-7.80(d,1H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.47(brs,4H),2.24(s,3H),2.23-1.84(m,2H),1.33-1.23(m,3H),0.38-0.34(m,3H).MS(ESI):m/z446.3[M+H]+.實施例334-(3-乙基-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例13中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.83(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(d,2H),3.12-3.11(brs,4H),2.64-2.61(brs,1H)2.50-2.47(brs,4H),2.24(s,3H),2.23-1.84(m,2H),1.33-1.23(m,3H),0.38-0.34(m,3H).MS(ESI):m/z445.3[M+H]+.實施例344-(3-乙基-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(4-甲基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例16中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.62(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,4H),7.90-7.80(d,1H),7.44-7.41(d,1H),3.12-3.11(brs,4H),2.50-2.47(brs,4H),2.24(s,3H),2.23-1.84(m,2H),1.33-1.23(m,3H),0.38-0.34(m,3H).MS(ESI):m/z460.3[M+H]+.實施例354-(3-乙基-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-氮-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例17中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.84(s,1H),8.65-8.64(d,1H),8.02-8.7.90(m,2H),7.90-7.80(d,2H),7.44-7.41(m,2H),2.91-2.67(brs,3H),2.33-2.22(m,6H),2.02-1.67(m,8H),1.33-1.23(m,3H),0.38-0.34(m,3H).MS(ESI):m/z459.3[M+H]+.實施例364-(3-乙基-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-氮-(5-(4-乙基哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-5-氟嘧啶-2-氨基按照實施例19中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.65(s,1H),8.61-8.60(d,1H),8.15-8.00(m,4H),7.62-7.60(m,1H),7.44-7.41(d,1H),3.18(brs,4H),3.06(brs,4H),2.52-2.50(m,2H),2.47(s,3H),2.03-1.79(m,2H),2.23-1.84(m,3H),1.33-1.23(m,3H),0.38-0.34(m,3H).MS(ESI):masscalcd.forC28H33F2N7473.3,m/zfound474.3[M+H]+.實施例375-氟-氮-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基)-4-(2,3,3-三甲基-3H-吲哚-5-基)嘧啶-2-氨基按照實施例17中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO,400MHz):δ9.85(s,1H),8.66-8.65(m,1H),8.18-8.15(m,3H),8.10-8.01(m,1H),7.68-7.63(m,2H),2.88-2.85(m,3H),2.50(s,3H),2.28(s,3H),2.19-1.75(m,6H),1.66-1.65(m,6H),1.32-1.00(m,3H).MS(ESI):m/z445.3[M+H]+.實施例384-(3,3-二乙基-7-氟-2-甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-N-(5-(1-甲基哌啶-4-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例17中相似的步驟得到標題化合物。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz),δ9.95(s,1H),8.69(s,1H),8.19-8.11(m,2H),7.89-7.84(m,2H),7.67(d,J＝7.6Hz,1H),2.87-2.85(m,2H),2.25(s,3H),2.19(s,3H),2.02-1.92(m,6H),1.90-1.65(m,4H),0.34(m,6H).MS(ESI):m/z491.3[M+H]+.實施例391-(2-((4-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)-7,8-二氫-1,6-萘啶-6(5H)-基)-2-羥基乙酰胺步驟12-(2-氯-7,8-二氫-1,6-萘啶-6(5H)-基)-2-乙酰氧基乙酰胺的合成向反應瓶中中加入2-氯-5,6,7,8-四氫-1,6-萘啶1.0g(5.95mmol)，三乙胺1.21g(11.90mmol)，二氯甲烷5ml，然后緩慢滴加2-氯-2-乙酰氧基乙酰氯1.22g(8.93mmol).該混合物室溫反應1小時，加入5ml水萃滅反應，移除溶劑，用二氯甲烷萃取三次，每次15ml，合并有機相。有機相用10ml飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，真空濃縮，得到標題化合物灰白色粗品1.09g,收率68.21％.MS(ESI):m/z269.1[M+H]+.步驟21-(2-((4-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟嘧啶-2-基)氨基)-7,8-二氫-1,6-萘啶-6(5H)-基)-2-羥基乙酰胺的合成向反應瓶中加入按照實施1步驟1-3相似的方法得到4-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟嘧啶-2-氨基101mg(0.34mmol)，步驟1制備得到的2-(2-氯-7,8-二氫-1,6-萘啶-6(5H)-基)-2-乙酰氧基乙酰胺85.2mg(0.32mmol)，二氧六環(huán)10mL，叔丁醇鈉65.3mg(0.68mmol),Pd2(dba)331.2mg(0.034mmol)，4,5-雙二苯基膦-9,9-二甲基氧雜蒽19.7mg(0.034mmol)。該混合物加熱至120℃，微波反應1小時，然后冷卻至室溫，加入50ml水，用乙酸乙酯萃取三次，每次50ml，合并有機相。有機相用50ml飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，硅膠柱色譜分離(二氯甲烷/甲醇＝10:1)得到標題化合物20mg(白色固體)，收率12％。1H-NMR(DMSO,400MHz),δ9.98(s,1H),8.70(d,J＝3.6Hz,1H),8.07(d,J＝8.4Hz,1H),7.94(s,1H),7.87(d,J＝11.2Hz,1H),7.64-7.57(m,1H),4.68-4.55(m,3H),4.22-4.21(m,2H),4.21-4.19(m,2H),2.89-2.81(m,2H),2.28(s,3H),2.04-1.84(m,2H),1.33(s,3H),0.37(t,J＝7.2Hz,3H).MS(ESI):m/z493.2[M+H]+.實施例401-(2-((5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-基)氨基)-7,8-二氫-1,6-萘啶-6(5H)-基)-2-羥基乙酰胺按照實施例39中相似的步驟得到標題化合物1H-NMR(DMSO-d6,400MHz),δ10.07(s,1H),8.69(d,J＝2.7Hz,1H),8.53(s,1H),8.09-8.02(m,1H),7.98(s,1H),7.88(d,J＝9.3Hz,1H),7.62-7.54(m,1H),4.73(br,1H),4.62-4.61(m,2H),4.21-4.19(m,2H),2.89-2.81(m,2H),2.50(s,2H),2.34-2.11(m,5H),1.75-1.72(m,2H).MS(ESI):masscalcd.forC27H26F2N6O2504.2,m/zfound505.2[M+H]+.實施例41N-(5-(4-(環(huán)丙基甲基)哌嗪-1-基)吡啶-2-基)-5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)嘧啶-2-氨基按照實施例6相似步驟得到中間體5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基向反應瓶中加入上述中間體5-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-氮-(5-(哌嗪-1-基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基(150mg,0.32mmol)，溴甲基環(huán)丙烷，乙腈(5ml)，碳酸鉀(130.0mg,0.96mmol)，加熱至80℃反應4h,冷卻至室溫，加入50ml水，用二氯甲烷萃取三次，每次10ml.合并有機層，用15mg飽和食鹽水洗滌一次，無水硫酸鈉干燥，過濾，柱色譜分離(二氯甲烷/甲醇＝10:1)，得到本實施例的標題產(chǎn)物42.1mg(白色固體)。1H-NMR(DMSO-d6,400MHz),δ9.89(s,1H),8.68(m,1H),8.64-8.01(m,3H),7.87(d,J＝14.4Hz,1H),7.42-7.40(m,1H),3.14-3.13(m,5H),2.60-2.51(m,5H),2.33(s,3H),2.24-2.23(m,2H),2.09-2.02(m,6H),1.99-1.97(m,2H),1.75-1.74(m,2H),0.85-0.83(m,2H),0.48-0.47(m,2H).MS(ESI):masscalcd.forC30H33F2N7529.3,m/zfound530.3[M+H]+.實施例424-(3-乙基-7-氟-2,3-二甲基-3H-吲哚-5-基)-5-氟-N-(5-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例2中相似的步驟得到標題化合物1H-NMR(DMSO,400MHz),δ10.06(s,1H),8.72(d,J＝3.2Hz,1H),8.18-8.15(m,2H),7.93(s,1H),7.86(d,J＝11.6Hz,1H),7.67(d,J＝5.2Hz,1H),3.42(s,2H),2.35-2.28(m,8H),2.14(s,3H),2.04-1.98(m,1H),1.89-1.84(m,1H),1.34(s,3H),0.36(t,J＝7.2Hz,3H).MS(ESI):masscalcd.forC27H31F2N7491.3,m/zfound492.3[M+H]+.實施例435-氟-4-(7'-氟-2'-甲基螺[環(huán)戊烷-1,3'-吲哚]-5'-基)-N-(5-((4-甲基哌嗪-1-基)甲基)吡啶-2-基)嘧啶-2-氨基按照實施例2中相似的步驟得到標題化合物1H-NMR(DMSO-d6,400MHz),δ10.09(s,1H),8.71(d,J＝3.2Hz,1H),8.18-8.15(m,2H),8.02(s,1H),7.85(d,J＝11.2Hz,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),3.43(s,2H),2.50-2.34(m,8H),2.14(s,3H),2.14-2.08(m,6H),1.75-1.74(m,2H),1.75-1.72(m,2H).MS(ESI):masscalcd.forC28H31F2N7503.2,m/zfound504.2[M+H]+.以下實驗例中所用的對照品，編號為LY2835219，參考專利WO2010075074制備方法制備，其結(jié)構(gòu)式如
背景技術：
結(jié)構(gòu)式3所示。實驗例1本發(fā)明化合物的CDKs激酶抑制活性測定本發(fā)明所述化合物體外對CDK(CDK1、CDK4、CDK6)激酶活性的抑制作用通過以下的方法進行測試。1.1儀器和試劑盒信息1.2實驗準備：1.2.1激酶反應緩沖液Ⅰ的配制：將試劑盒中給出的5×ReactionBufferA(Promega；V307A-C)用MilliQH2O和0.1MDTT(二硫蘇糖醇)混合稀釋成4x激酶緩沖液；再按比例加入MilliQH2O，最終配制成1x激酶緩沖液。激酶反應緩沖液Ⅱ的配制：在1x激酶反應緩沖液中加入0.5％DMSO(二甲基亞砜)混勻即可。1.2.2激酶溶液的配制：用1x激酶反應緩沖液將100ng/μl激酶儲液配制每個反應體系所需濃度的激酶溶液。1.2.3供試化合物和對照品LY2835219溶液的配制:(1)配制對照品LY2835219溶液a.分別取1μl的10mM標準品儲液，加入到9μl的激酶反應緩沖液I中，混勻；再加入90μl的激酶反應緩沖液I，混勻；再加入100μl的激酶反應緩沖液I，混勻；得到終濃度為50μM。b.在96-孔板的B2-B10中加入40μl的激酶反應緩沖液II；在B1中加入50μl上述溶液；c.從孔B1中取出10μl加入B2，混勻，然后取10μl加入到B3，依次稀釋B9；得到依次5倍稀釋的對照品溶液。(2)準備供試化合物溶液：a.分別取一定濃度的供試化合物溶液，用激酶反應緩沖液I稀釋到終濃度為50μM的化合物溶液；b.在96-孔板的H2-H10中加入40μl的激酶反應緩沖液II；在H1中加入50μl上述溶液；c.從孔H1中取出10μl加入H2，混勻，然后取10μl加入到H3，依次稀釋H9；得到依次5倍稀釋的供試化合物溶液。1.2.4準備反應底物和ATP混合溶液：a.準備ATP溶液：200μl0.1mMATP溶液:2μl10mMATP加入198μl激酶反應緩沖液I；300μl50μMATP溶液：加150μl的激酶反應緩沖液Ⅰ到150μl上述0.1mMATP溶液中；b.準備300μl的反應底物溶液：將150μl1μg/μl的反應底物儲液，加入150μl激酶反應緩沖液I混勻；c.將上述a/b兩種溶液混合分別得到混合溶液。1.3實驗過程：1.3.1取2μl各濃度的化合物溶液加入到384孔板中，離心3min；1.3.2每孔加入4μl激酶溶液，18℃，5000rpm離心10min，搖板機上搖勻10min；1.3.3每孔加入4ul底物和ATP混合溶液，18℃，5000rpm離心10min，搖板機37℃搖勻90min；1.3.4取出384孔板，放置至室溫；1.3.5每孔加入10μl的ADP-Glo試劑，18℃、5000rpm離心10min，搖板機25℃搖勻40min，終止反應；1.3.6每孔加入20μl的激酶檢測試劑，18℃、5000rpm離心10min，搖板機25℃搖勻30min；1.3.7M1000pro酶標儀讀取熒光數(shù)值。1.4數(shù)據(jù)處理：按如下公式計算各化合物在各濃度點的抑制率，并通過軟件GraphPadPrism5進行曲線擬合得到IC50值。1.5檢測結(jié)果：由WO2010075074公開的LY2835219以及實施例1-43的化合物對CDK1/CyclinA2和CDK6/CyclinD3的抑制作用，以IC50表示，具體結(jié)果見表1。表1受試化合物對CDK1/CyclinA2和CDK6/CyclinD3抑制活性檢測結(jié)果(IC50：nM)實施例CDK1/CyclinA2CDK6/CyclinD3CDK1/CDK6Ly2835219319.433.8183.8312223.9243.0351.682158.7-3167879.0621.224-2147-5438.57.52858.236152.26.4523.59783.833.2625.718-85.77-9268.2820.4213,.1310435.6847.119.251182.423.14526.20121071.233.78283.3313327.000.39838.4614233.644.0757.401526.924.316.251695.709.0210.61172707.110.733708.3718189.862.7469.291964.8265.490.99201444.4587.6016.4921135.1927.674.8922915.3552.5017.432350.274.5311.102476.4412.86.5.9425417.168.7847.5126216.0812.5117.27271160.2316.2171.5728328.476.2452.6329110.065.6219.5830176.580.49360.3731-58.84-32142.0310.1414.0133166.2815.6110.65實施例CDK1/CyclinA2CDK6/CyclinD3CDK1/CDK634111.595.1321.753564.038.747.3336100.93.7926.653773.6722.873.223819.830.2099.153938.515.656.8240161.6024.976.474176.65423681.982.331580.2543268.900.90298.78本發(fā)明部分代表化合物對CDK9/CyclinD3、Pim-1和CDK2/CyclinE1及CDK4/CyclinE1的抑制作用分別見表2、表3和表4。表2部分受試化合物對CDK9/CyclinD3抑制活性檢測結(jié)果(IC50：nM)實施例CDK1/CyclinA2CDK6/CyclinD3CDK9/CyclinD3CDK1/CDK6CDK9/CDK6Ly2835219319.433.815.0883.831.3312223.9243.03244.9751.685.693167879.0650.0221.220.636152.26.450.4223.590.06783.833.264.5825.711.409268.2820.4214.4313,.130.7110435.6847.1127.049.250.57121071.233.7857.19283.3318.7513327.000.392.56838.466.561695.709.0216.3710.611.81172707.110.735.363708.377.3318189.862.741.0069.290.36201444.4587.600.2416.490.00322915.3552.500.5017.430.0092476.4412.86.1.745.940.1325417.168.781.0947.510.1226216.0812.5110.9517.270.88271160.2316.212.8371.570.1728328.476.240.9652.630.1530176.580.490.43360.370.88表3部分受試化合物對Pim-1抑制活性檢測結(jié)果(IC50：nM)表4部分受試化合物對CDK4和CDK2的抑制作用(IC50：nM)1.6試驗結(jié)論：1)本發(fā)明的化合物對CDK6和CDK4具有顯著的抑制作用。2)CDK1/CDK6、CDK9/CKD6和Pim-1/CDK6可以體現(xiàn)化合物對于蛋白激酶的選擇性，數(shù)值越大，則化合物對CDK6的選擇性越好，預示著化合物的泛蛋白激酶抑制的毒性可能越小。對照化合物(LY2835219)的CDK1/CDK6＝83.83，CDK9/CDK6＝1.33，Pim-1/CDK6＝1.03；本發(fā)明的部分化合物顯示出比LY2835219更好的選擇性，特別是實施例17制備的化合物就表現(xiàn)出對于CDK6具有更高的酶學活性，對于CDK1，CDK9和Pim1具有更好的選擇性。實驗例2本發(fā)明代表化合物對人乳腺癌細胞MDB-MA-231的增殖抑制測定2.1實驗材料：人乳腺癌細胞MDA-MB-231購于北京協(xié)和細胞資源中心，DAPI(5mg/mL,碧云天，c1002)，4％多聚甲醛(鼎國生物，AR-0211)，黑色透明底96孔板(PE，6005182)，InCellAnalyzer2200(GEHealthcare)2.2實驗準備：2.2.1人乳腺癌細胞MDA-MB-231培養(yǎng)基的配制:RPIM1640+10％FBS+1％青霉素/鏈霉素2.2.2供試化合物和標準品LY2835219溶液的配制:(1)配制標準品LY2835219,PD0332992溶液a.分別取3.6μl的10mM標準品儲液，加入到6.4ul培養(yǎng)基中，混勻；再加入90μl的培養(yǎng)基，混勻；再加入200μl的培養(yǎng)基，混勻；配制成20uM起始濃度。b.在96-孔板的B2-B10中加入200μl的含0.2％DMSO(二甲基亞砜)的培養(yǎng)基；在B1中加入300μl上述溶液；c.從孔B1中取出100μl加入B2，混勻，然后取100μl加入到B3，依次稀釋B9；得到依次3倍稀釋的標準品溶液。(2)準備供試化合物溶液：a.分別取一定濃度的供試化合物溶液，用培養(yǎng)基稀釋到終濃度為20μM的化合物溶液；b.在96-孔板的H2-H10中加入200μl的含0.2％DMSO(二甲基亞砜)的培養(yǎng)基；在H1中加入300μl上述溶液；c.從孔H1中取出100μl加入H2，混勻，然后取100μl加入到H3，依次稀釋H9；得到依次3倍稀釋的供試化合物溶液。2.3實驗過程：2.3.1MDA-MB-231細胞分別以4000cells/100ul/well接種至96孔黑色透明底細胞板，37℃培養(yǎng)過夜；2.3.2上述樣品分別以100μl/孔加入接種有細胞的培養(yǎng)板中，輕拍使混勻，37℃孵育72h；2.3.3固定：取出細胞板，去除培養(yǎng)基，每孔加入50μl4％多聚甲醛固定10min；2.3.4加入50μl0.1Mglycine(甘氨酸)中和10min；2.3.51×PBS(磷酸鹽緩沖液PH7.2)洗兩次；2.3.6通透：每孔加50ul0.2％TritonX-100(曲拉通)室溫通透10min；2.3.71×PBS(磷酸鹽緩沖液PH7.2)洗兩次；2.3.85mg/mL的DAPI儲備液1:5000稀釋(終濃度1μg/ml)室溫染色20min2.3.91×PBS(磷酸鹽緩沖液PH7.2)洗三次；2.3.10Incellanalyser掃描并分析。2.4數(shù)據(jù)處理：按如下公式計算各化合物在各濃度點的抑制率，并通過軟件GraphPadPrism5進行曲線擬合得到IC50值。2.5測定結(jié)果：由WO2010075074公開的LY2835219以及實施例12和17的化合物的細胞學活性測定結(jié)果，以IC50表示，具體結(jié)果見表5。表5本發(fā)明代表化合物對人乳腺癌細胞MDB-MA-231增殖的抑制活性(IC50：nM)實施例IC50Ly2835219229.0512182.7217109.822.6實驗結(jié)論：實施例12和17的化合物對MDA-MB-231細胞系具有明顯的增殖抑制活性，相對于對照化合物LY2835219，本發(fā)明代表化合物具有更高的增殖抑制活性。實驗例3本發(fā)明代表化合物的大鼠藥代動力學測定3.1實驗摘要以SD大鼠為受試動物，應用LC/MS/MS方法測定大鼠靜脈注射給藥和灌胃給予代表化合物后不同時刻血漿中的藥物濃度，以研究本發(fā)明化合物在大鼠體內(nèi)的藥代動力學行為，評價其藥動學特征。3.2實驗方案3.2.1供試藥品：本發(fā)明實施例17制備的化合物；對照藥LY2835219,自制。3.2.2供試動物：健康成年SD大鼠12只，雄性，6-8周齡，體重200-250g,購自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2013-00033.2.3供試藥物配制灌胃給藥：稱取適量樣品，加入0.1％羥乙基纖維素/0.5％吐溫80至終體積，配成1mg/ml溶液；靜脈注射：稱取適量樣品，加入10％的N-甲基-2-吡咯烷酮和90％的18％磺丁基-β-環(huán)糊精至終體積，配成0.4mg/ml溶液，供靜脈注射給藥。3.2.4供試藥品給藥靜脈注射給藥：每個供試化合物3只雄性SD大鼠，禁食一夜后分別靜脈注射給藥，劑量為2mg/kg，給藥體積為1ml/kg。灌胃給藥：每個供試化合物3只雄性SD大鼠，禁食一夜后分別灌胃給藥，劑量為5mg/kg,給藥體積為5ml/kg。3.3實驗操作在給藥前及給藥后0.0833、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24小時后，經(jīng)過頸動脈插管取血。全血EDTA-K2抗凝，離心去上清，-20攝氏度冷凍保存，直至樣品分析。用LC-MS/MS進行血漿樣品分析，蛋白沉淀法進行樣品前處理，樣品分析線性范圍1-2000ng/ml.最低定量限為1ng/ml.3.4藥代動力學數(shù)據(jù)結(jié)果本發(fā)明化合物的藥代動力學參數(shù)見表6和表7。表6本發(fā)明化合物17的大鼠單次靜脈給藥PK參數(shù)(Mean±SD)表7本發(fā)明化合物17的大鼠單次灌胃給藥PK參數(shù)(Mean±SD)3.5實驗結(jié)論：本發(fā)明的代表化合物(實施例17制備)，相對于化合物Ly2835219，在大鼠中具有更高的生物利用度和良好的口服吸收效果。實驗例4本發(fā)明代表化合物的小鼠藥代動力學測定4.1實驗摘要以ICR小鼠為受試動物，應用LC/MS/MS方法測定小鼠灌胃、靜脈注射給予本發(fā)明代表化合物后不同時刻血漿中的藥物濃度，以研究本發(fā)明化合物在小鼠體內(nèi)的藥代動力學行為，評價其藥動學特征。4.2實驗方案4.2.1供試藥品：本發(fā)明實施例17制備的化合物；對照藥LY2835219,自制。4.2.2供試動物：健康成年ICR小鼠，12只，雄性，6-8周齡，體重20-25g,購自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2013-00034.2.3供試藥物配制稱取適量樣品，加入0.1％羥乙基纖維素/0.5％吐溫80至終體積，配成0.5mg/ml溶液，供灌胃給藥。稱取適量樣品，加入10％的N-甲基-2-吡咯烷酮和90％的18％磺丁基-β-環(huán)糊精至終體積，配成0.2mg/ml溶液，供靜脈注射給藥。4.2.4供試藥品給藥每個供試藥品，雄性ICR小鼠3只，禁食一夜后分別灌胃給藥，劑量為5mg/kg,給藥體積為10ml/kg；每個供試藥品，雄性ICR小鼠3只，禁食一夜后分別靜脈注射給藥，劑量為2mg/kg，給藥體積為10ml/kg.4.3實驗操作灌胃給藥組于給藥前及給藥后在0.25、0.5、1、2、4、8、12、24小時后，經(jīng)過頸動脈插管取血。全血EDTA-K2抗凝，離心去上清，-20攝氏度冷凍保存，直至樣品分析。靜脈注射給藥組于給藥前及給藥后在0.083h、0.25、0.5、1、2、4、8、12、24小時后，經(jīng)過頸動脈插管取血。血漿樣品處理同灌胃給藥。用LC-MS/MS進行血漿樣品分析，蛋白沉淀法進行樣品前處理，樣品分析線性范圍1-2000ng/ml.最低定量限為1ng/ml.4.4藥代動力學數(shù)據(jù)結(jié)果：見表8和表9。表8本發(fā)明化合物17的小鼠單次靜脈給藥PK參數(shù)(Mean±SD)表9本發(fā)明化合物17的小鼠單次灌胃給藥PK參數(shù)(Mean±SD)4.5實驗結(jié)論：本發(fā)明的代表化合物17，相對于化合物Ly2835219，在小鼠中具有更高的生物利用度，更長的半衰期，具有良好的口服吸收效果。實驗例5本發(fā)明代表化合物17血漿和腦暴漏水平的測定5.1實驗摘要以CD-1小鼠為受試動物，應用LC/MS/MS方法測定小鼠單次灌胃給予本發(fā)明代表化合物后不同時刻血漿和腦組織中的藥物濃度，以研究本發(fā)明化合物在小鼠體內(nèi)的血漿和腦暴漏水平。5.2實驗方案5.2.1供試藥品：本發(fā)明實施例17制備的化合物；對照藥LY2835219,自制。5.2.2供試動物：健康成年CD-1小鼠，24只，雄性，6-8周齡，體重20-25g,購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2013-0016。5.2.3供試藥物配制稱取適量樣品，加入0.1％羥乙基纖維素/0.5％吐溫80至終體積，配成1.0mg/ml溶液。5.2.4供試藥品給藥每個供試藥品，雄性CD-1小鼠12只，禁食一夜后分別灌胃給藥，劑量為10mg/kg,給藥體積為10ml/kg。5.3實驗操作LY2835219：給藥前及給藥后在0.25、1.5、6小時時，經(jīng)過頸動脈插管取血，同時處死3只小鼠，收集整個腦并且搗碎后凍存于液氮中；給藥后10小時，將剩余的動物處死，并且通過心臟穿刺采集全血，收集整個腦并且搗碎后凍存于液氮中。實施例17：給藥前及給藥后在2、4、24小時時，經(jīng)過頸動脈插管取血，同時處死3只小鼠，收集整個腦并且搗碎后凍存于液氮中；給藥后48小時，將剩余的動物處死，并且通過心臟穿刺采集全血，收集整個腦并且搗碎后凍存于液氮中。全血樣品處理：采集的全血EDTA-K2抗凝，離心去上清，-20℃冷凍保存，直至樣品用LC-MS/MS分析。腦部勻漿取樣：腦部勻漿用5倍于腦勻漿溶液體積的PBS(pH＝7.4):MeOH(v:v,2:1)溶液分散，取100μL，用600μLIS沉淀其中的蛋白，混合物在20-25℃,13000rpm離心15分鐘，取50μL上層清液用150μL含有0.3％FA的水混合，4℃離心，取5μL樣品用LC-MS/MS進行分析。樣品分析線性范圍1-2000ng/ml.最低定量限為1ng/ml。5.4血腦暴露水平測定結(jié)果：見表10。表10受試化合物在CD-1小鼠中血漿和腦部的平均暴漏5.5實驗結(jié)論：本發(fā)明的代表化合物(實施例17制備)，相對于化合物LY2835219，具有更好的血腦分布，更高的AUC0-last比值(腦部/血漿)，更高的Cmax比值(腦部/血漿)，而且腦部Tmax和血漿中的Tmax相等，說明藥物在腦部與血漿中具有相似的PK行為。提示本發(fā)明的化合物可以穿過血腦屏障從而抑制腦部腫瘤(腦癌)的生長，治療腦癌?？傊?，本發(fā)明提供了一系列新的具有選擇性CDK4/6激酶抑制活性的化合物，其活性優(yōu)于或與目前處于III期臨床試驗的候選藥物LY2835219相當，部分化合物表現(xiàn)出更好的選擇性。而且優(yōu)選的化合物口服吸收良好、血腦分布好，預示著本發(fā)明的化合物有希望被開發(fā)成新的治療細胞增殖相關疾病，尤其是惡性腫瘤(特別是腦癌)的藥物，為臨床醫(yī)生和患者提供新的選擇。當前第1頁1 2 3