本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥和診療領(lǐng)域，具體涉及一種抗EpCAM和CD3特異性雙靶向抗體及其制備方法和應(yīng)用、含該雙靶向抗體表達(dá)盒的微環(huán)DNA及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

EpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)上皮細(xì)胞粘附分子，也稱為TACSTD1(tumor-associated calcium signal transducer1)，CD326(cluster of differentiation)，17-A，ESA，EGP40，EPCAM是一種由GA-733-2基因編碼的分子量為40kDa的跨膜糖蛋白，作為嗜同種的鈣非依賴性的上皮細(xì)胞間粘附分子在上皮癌變過程中發(fā)揮著作用。

EpCAM最早作為腫瘤相關(guān)抗原被發(fā)現(xiàn),因其在各種類型疾病的腫瘤組織中高水平表達(dá),引起了特別的關(guān)注。目前大量的實(shí)驗(yàn)證實(shí)EpCAM可以作為診斷和治療腫瘤的標(biāo)記蛋白,許多從原發(fā)性肝腫瘤組織中分離建系的人原發(fā)性肝癌細(xì)胞系中含有EpCAM的表達(dá),并且這種表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞的某些典型特性,尤其對腫瘤發(fā)生和發(fā)展具有決定性的作用。此外，以EpCAM+/CD44+為表型的結(jié)直腸癌干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)以后，它具有干細(xì)胞功能的特征已在多個(gè)方面得到證實(shí)。最近的研究表明，EpCAM蛋白在胚胎干細(xì)胞高度表達(dá)，在上皮性腫瘤細(xì)胞內(nèi)，其多向分化潛能是通過抑制p53蛋白表達(dá)和提高小鼠胚胎成纖維細(xì)胞的分化能力實(shí)現(xiàn)的，表明EpCAM跨膜信號是通過抑制p53-p21信號途徑實(shí)現(xiàn)程序重排的。因此EpCAM被認(rèn)為是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物。

Edrecolomab(ED)是一種來源于鼠的抗EpCAM的單克隆IgG2抗體，它能識別人類腫瘤相關(guān)抗原17-1A。此單抗已在德國上市，并在乳腺癌和結(jié)直腸癌使用，剛開始報(bào)道不管是單獨(dú)使用或者結(jié)合其他輔助化療在無復(fù)發(fā)及總體生存方面有顯著的優(yōu)勢。但在后來的四個(gè)大宗的前瞻性隨機(jī)臨床試驗(yàn)中，不管是單獨(dú)使用還是聯(lián)合化療，ED對術(shù)后Ⅱ、Ⅲ期結(jié)直腸癌都是無效的。

在鼠源性抗體臨床試驗(yàn)效果不佳的情況下，人源性抗EpCAM單克隆IgG1抗體Adecatumumab(MT201)的問世給腫瘤臨床免疫導(dǎo)向治療帶來了新的希望。在體外實(shí)驗(yàn)中有比ED更強(qiáng)烈的抗體依賴細(xì)胞毒性反應(yīng)，目前已在乳腺癌、子宮漿液性乳頭狀癌、卵巢癌、前列腺癌等治療中顯示出一定的效果，目前在乳腺癌治療中研究較多。Schmidt等在其Ⅱ期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，接受高劑量和高表達(dá)EpCAM的患者腫瘤進(jìn)展能力明顯降低，與治療相關(guān)的不良反應(yīng)較低或輕微。結(jié)果表明，單劑型的MT201治療進(jìn)展期乳腺癌，盡管并不能客觀的使腫瘤消退，但能減緩腫瘤進(jìn)展，為下一步對過表達(dá)EpCAM和低瘤荷其他腫瘤的MT201治療提供理論支持。目前其他腫瘤的Ⅱ、Ⅲ期臨床研究還在進(jìn)行中，前景令人矚目，在胃腸腫瘤方面還未見報(bào)道，故其在治療中的地位需要更深入地研究。

近年來，在腫瘤免疫治療領(lǐng)域，出現(xiàn)了利用雙靶向抗體(Bispecific antibody,BsAb)介導(dǎo)T細(xì)胞 殺滅癌細(xì)胞的新療法。人體免疫系統(tǒng)中，細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocyte，CTL)扮演著重要的角色，具有T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)，能特異性識別并結(jié)合表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞，并分泌穿孔素和顆粒酶殺滅靶細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞由于缺少免疫粘附分子和共刺激分子等原因,使得機(jī)體免疫無法有效識別和活化，從而使得CTL無法清除癌細(xì)胞。BsAb能夠同時(shí)與T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞特異性抗原結(jié)合，可在T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間形成免疫突觸(immune synapse)，發(fā)揮T細(xì)胞受體(TCR)一樣的功能，從而激活T細(xì)胞免疫機(jī)制，介導(dǎo)T細(xì)胞殺死靶細(xì)胞。

卡妥索單抗(Catumaxomab)是一種能與EpCAM分子、CD3抗原以及FC受體特異性結(jié)合的三功能雙特異性抗體，是目前報(bào)道的第一個(gè)上市的BsAb抗體。于2009年在歐盟獲得批準(zhǔn)用于治療EPCAM陽性腫瘤的惡性腹水患者，取得了良好的效果。

Strhlein等研究惡性腹水灌注Catumaxomab的Ⅰ期臨床效果，采取劑量遞增(10～200μg)腹腔治療消化道來源的惡性腹水，隨訪2年后結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Catumaxomab治療能清除腹腔灌洗樣本中腫瘤細(xì)胞，延遲疾病進(jìn)展，延長生存時(shí)間。Parsons等研究癌性腹水灌注Catumaxomab的Ⅱ、Ⅲ期臨床效果，觀察EpCAM陽性的上皮源性惡性腹水258例，最初觀察終點(diǎn)是免穿刺生存時(shí)間，對照組允許觀察終點(diǎn)過后給予腹腔穿刺灌注Catumaxomab治療。結(jié)果顯示，免穿刺生存時(shí)間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，兩組腹水的癥狀和體征都有明顯的減輕，中位總生存時(shí)間延長，生存受益。對照組終點(diǎn)過后的治療延長了免穿刺時(shí)間?？傮w治療不良反應(yīng)通常來說輕微或者少見，可完全逆轉(zhuǎn)。因此，癌性腹水腹腔灌注Catumaxomab能夠延長免穿刺生存時(shí)間和免穿刺時(shí)間，并能夠明顯地減輕腹水的癥狀和體征。

然而，卡妥索單抗(Catumaxomab)，一種抗CD3和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的BsAb，為由大鼠和小鼠抗體序列的雜交獲得，并于2009年在歐盟獲得批準(zhǔn)用于治療EpCAM陽性腫瘤的惡性腹水患者。另外一個(gè)處于臨床II期研究的BsAb抗體：Solitomab，一種抗CD3和上皮細(xì)胞粘附分子(EpCAM)的小鼠雙特異性抗體，目前效果尚在觀察。綜合來說，這兩種BsAb的抗原結(jié)合區(qū)序列都是來源于鼠單抗，長期應(yīng)用會(huì)產(chǎn)生部分的移植物抗宿主反應(yīng)(graft versus host reaction,GVHR)。目前還沒有抗原結(jié)合區(qū)序列來自于人源單抗的EpCAM的雙靶向抗體的報(bào)道。本發(fā)明旨在提供一個(gè)高效、低成本、來自于人源的抗EpCAM和CD3特異性雙靶向抗體及其制備方法和應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

第一方面，本發(fā)明提供了一種特異性雙靶向抗體，所述特異性雙靶向抗體具有特異性與人類CD3結(jié)合的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和特異性與EpCAM抗原結(jié)合的第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

本發(fā)明提供了的特異性雙靶向抗體(Bispecific antibody,BsAb)，能夠同時(shí)與CD3和EpCAM抗原結(jié)合；特異地識別并結(jié)合EpCAM抗原陽性細(xì)胞，同時(shí)也結(jié)合表達(dá)CD3的T細(xì)胞，可在T細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間形成免疫突觸(immune synapse)，發(fā)揮T細(xì)胞受體(T cell receptor，TCR)一樣的功能，從而激活T細(xì)胞免疫機(jī)制，介導(dǎo)T細(xì)胞發(fā)揮殺傷EpCAM陽性腫瘤細(xì)胞的作用，從而清除EpCAM陽性腫瘤細(xì)胞。

本發(fā)明所述的“雙靶向”表示“能夠同時(shí)與CD3和EpCAM抗原結(jié)合”。

在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明提供了的特異性雙靶向抗體，可與CD3和EpCAM結(jié)合；該特異性雙靶向抗體在文中亦稱為“抗-CD3/抗-EpCAM特異性雙靶向抗體”。“抗-CD3/抗-EpCAM特異性雙靶向抗體” 的抗-EpCAM部分可用于靶向表達(dá)EpCAM的細(xì)胞，如HepG2肝癌細(xì)胞系，而特異性雙靶向抗體分子的抗-CD3部分可用于活化T細(xì)胞。通過與EpCAM陽性細(xì)胞上的cMET和T細(xì)胞上的CD3的同時(shí)結(jié)合，促進(jìn)活化的T細(xì)胞定向殺死(細(xì)胞裂解)被靶向的EpCAM陽性細(xì)胞。

本發(fā)明的抗-CD3/抗-EpCAM特異性雙靶向抗體，特別地，用于診斷、治療EpCAM陽性腫瘤細(xì)胞，以及治療、預(yù)防和/或控制與EpCAM的異常表達(dá)和/或由EpCAM的異常表達(dá)引發(fā)的生理紊亂的方法和組合物。這樣的紊亂包括但不限于:癌癥、非癌過度增生性細(xì)胞紊亂。

本發(fā)明的示例性特異性雙靶向抗體列于文中的表1和表2。本發(fā)明提供的特異性雙靶向抗體中，第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域和第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域均包括的重鏈可變區(qū)(HCVR)和輕鏈可變區(qū)(LCVR))。表1表2列出了本發(fā)明提供的特異性雙靶向抗體的HCVR、LCVR的氨基酸序列，及其在序列表中的序列號。表2列出了編碼本發(fā)明所述的HCVR、LCVR氨基酸序列對應(yīng)的核苷酸序列，及其在序列表中的序列號。

本發(fā)明提供的特異性雙靶向抗體的氨基酸序列包括：至少一條第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的HCVR氨基酸序列、至少一條第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的LCVR氨基酸序列、至少一條第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的HCVR氨基酸序列、以及至少一條第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的LCVR氨基酸序列；具體HCVR和LCVR優(yōu)選為任一選自表1的氨基酸序列。

編碼本發(fā)明提供的特異性雙靶向抗體的核苷酸序列包括：至少一條第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的HCVR核苷酸序列、至少一條第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的LCVR核苷酸序列、至少一條第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的HCVR核苷酸序列、以及至少一條第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的LCVR核苷酸序列；具體HCVR和LCVR優(yōu)選為任一選自表2的核苷酸序列。

表1 序列表中的氨基酸序列

在本發(fā)明一實(shí)施例中，3條不同序列的抗-CD3/抗-EpCAM特異性雙靶向抗體，在表1中編號分別為 BsAb-1、BsAb-2、BsAb-3，其中BsAb-1是經(jīng)過篩選出的最佳效果的特異性雙靶向抗體。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，表1各序列具體為：

具體地，在表1各序列中，高變區(qū)為如下帶下劃線序列：

SEQUENCE NO.1中，

CD3.HCVR

DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTLTVSS；

SEQUENCE NO.2中，

CD3.LCVR

DIQLTQSPAIMSASPGEKVTMTCRASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKVASGVPYRFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK；

SEQUENCE NO.3中，

EPCAM-HCVR

EVQLLEQSGAELVRPGTSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGLEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARLRNWDEPMDYWGQGTTVTVSS；

SEQUENCE NO.4中，

EPCAM-LCVR

DIELVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSYPLTFGAGTKLEIK；

SEQUENCE NO.5中，

EPCAM-HCVR

EVQLLEQSGAELVRPGTSVRLSCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGHGIEWLGDIFPGSGNIRYNEKFKGKATITADKSSSTAYMQLSSLTFEDSAVYFCARIKNWDEPMDYWGQGTTVTVSS；

SEQUENCE NO.6中，

EPCAM-LCVR

DIELVMTQSPSSLTVTMGERVTMSCKSSQSLLNSGNQKNYITWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDKFTGSSSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYCQNDYSQPITFGAGTKLEIK；

SEQUENCE NO.7中，

EPCAM-HCVR

EVQLLEQSGAELVKPGSSVKISCKASGYAFTNYWLGWVKQRPGKGIEWIGDIFPGSGNIHYNEKFKGKATLTADKSGSTAYMGLSSLTFEDSAVYFCARLKNWDEPSDYWGQGTTVTVSS；

SEQUENCE NO.8中，

EPCAM-LCVR

DIELVMTQSPSSLTVTAGERVTMSCKGSQSLLNSGNQKNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWASTRESGVPDKFTGSGSGTDFTITISSVQAEDLAVYTCQNDTGYPLTFGAGTKLEIK；

表2 序列表中的核苷酸序列

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，表2各序列具體為：

SEQUENCE NO.9，

CD3.HCVR

GACATCAAACTGCAGCAGTCAGGGGCTGAACTGGCAAGACCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGACTTCTGGCTACACCTTTACTAGGTACACCATGCACTGGGTCAAACAGAGGCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTAATCCTAGCAGAGGTTATACTAATTACAATCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACATTGACTACAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGCAACTGAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGCGCAAGATATTATGATGATCATTACTGCCTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA；

SEQUENCE NO.10，

CD3.LCVR

GACATTCAGCTGACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATGACCTGCAGAGCCAGTTCAAGTGTCAGTTACATGAACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGCACCTCCCCCAAAAGATGGATTTATGACACATCCAAAGTGGCTTCTGGAGTCCCTTATCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCATACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAACAGTGGAGTAGTAACCCTCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAA；

SEQUENCE NO.11中，

EPCAM-HCVR

GAGGTGCAGCTGCTCGAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGTGAGGCCTGGGACTTCAGTGAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGATACGCCTTCACTAACTACTGGCTTGGTTGGGTCAAGCAGAGGCCTGGACATGGACTTGAGTGGATTGGAGATATTTTCCCTGGAAGTGGTAATATCCACTACAATGAGAAGTTCAAGGGCAAAGCCACACTGACTGCAGACAAATCTTCCAGCACAGCCTATATGCAGCTCAGTAGCCTGACATTTGAGGACTCTGCTGTCTATTTCTGCGCAAGACTGAGGAACTGGGACGAGCCTATGGACTACTGGGGCCAAGGGACCACAGTCACCGTCTCCTCC；

SEQUENCE NO.12中，

EPCAM-LCVR

GAGCTCGTGATGACACAGTCTCCATCCTCCCTGACTGTGACAGCAGGAGAGAAGGTCACTATGAGCTGCAAGTCCAGTCAGAGTCTGCTTAACAGTGGAAATCAAAAGAACTACTTGACCTGGTACCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCTAAACTGTTGATCTACTGGGCATCCACTAGGGAATCTGGGGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGAACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGCCAGAATGATTATAGTTATCCTCTCACCTTCGGTGCTGGGACCAAACTTGAGATCAAA；

SEQUENCE NO.13中，

GAGGTGCAGCTGCTGGAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGCGCCCCGGCACCAGCGTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCACCAACTACTGGCTGGGCTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCCACGGCATCGAGTGGCTGGGCGACATCTTCCCCGGCAGCGGCAACATCCGCTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCATCACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCTTCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCATCAAGAACTGGGACGAGCCCATGGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC；

SEQUENCE NO.14中，

GACATCGAGCTGGTGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGACCGTGACCATGGGCGAGCGCGTGACCATGAGCTGCAAGAGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACATCACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCCGCGAGAGCGGCGTGCCCGACAAGTTCACCGGCAGCAGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCAGCAGCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACTACTGCCAGAACGACTACAGCCAGCCCATCACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG；

SEQUENCE NO.15中，

GAGGTGCAGCTGCTGGAGCAGAGCGGCGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCAGCAGCGTGAAGATCAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACGCCTTCACCAACTACTGGCTGGGCTGGGTGAAGCAGCGCCCCGGCAAGGGCATCGAGTGGATCGGCGACATCTTCCCCGGCAGCGGCAACATCCACTACAACGAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCGGCAGCACCGCCTACATGGGCCTGAGCAGCCTGACCTTCGAGGACAGCGCCGTGTACTTCTGCGCCCGCCTGAAGAACTGGGACGAGCCCAGCGACTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC；

SEQUENCE NO.16中，

GACATCGAGCTGGTGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGACCGTGACCGCCGGCGAGCGCGTGACCATGAGCTGCAAGGGCAGCCAGAGCCTGCTGAACAGCGGCAACCAGAAGAACTACCTGACCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGCCCCCCAAGCTGCTGATCTACTGGGCCAGCACCCGCGAGAGCGGCGTGCCCGACAAGTTCACCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTTCACCATCACCATCAGCAGCGTGCAGGCCGAGGACCTGGCCGTGTACACCTGCCAGAACGACACCGGCTACCCCCTGACCTTCGGCGCCGGCACCAAGCTGGAGATCAAG；

具體地，SEQUENCE NO.9-16分別編碼SEQUENCE NO.1-8的氨基酸序列。

鑒于序列同源性，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，如下實(shí)施方案應(yīng)納入本發(fā)明保護(hù)范圍：

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的HCVR為與表1中所示的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中任一HCVR氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的LCVR為與表1中所示的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中任一LCVR氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的HCVR為與表1中所示的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中任一HCVR氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的LCVR為與表1中所示的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中任一LCVR氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的編碼第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域HCVR的序列為與表2中所示的第一抗原結(jié) 合結(jié)構(gòu)域中任一HCVR核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的核苷酸序列。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的編碼第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域LCVR的序列為與表2中所示的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中任一LCVR核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的核苷酸序列。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的編碼第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域HCVR的序列為與表2中所示的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中任一HCVR核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的核苷酸序列。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的編碼第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域LCVR的序列為與表2中所示的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域中任一LCVR核苷酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的核苷酸序列。

可以理解的，由于“核苷酸序列”具有堿基簡并、突變等情況，行業(yè)內(nèi)普通技術(shù)人員可調(diào)整某些堿基的種類，所述的堿基變化雖然導(dǎo)致了密碼子的變化，但不會(huì)引起密碼子翻譯的氨基酸的變化，很常見的，亮氨酸的密碼子就具有多種密碼子，比如：UUA、UUG、CUU。

此外，本發(fā)明所述的EpCAM抗體氨基酸序列來自于人源抗體氨基酸序列，在人體應(yīng)用中能降低宿主抗移植物反應(yīng)(host versus graft reaction，HVGR)。核苷酸序列經(jīng)過密碼子優(yōu)化，利于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述特異性雙靶向抗體的氨基酸序列為：任選自表1中的序列，按如下連接形式為(a)～(h)中的一種組合所得(“V_LCD3”表示特異性雙靶向抗體的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的LCVR；“V_H CD3”表示特異性雙靶向抗體的第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的HCVR；“V_LEpCAM”表示特異性雙靶向抗體的第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的LCVR；“V_HEpCAM”表示特異性雙靶向抗體的第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的HCVR)：

(a)V_LEpCAM-linker1-V_HEpCAM-linker2-V_LCD3-linker1-V_HCD3，

(b)V_HEpCAM-linker1-V_LEpCAM-linker2-V_LCD3-linker1-V_HCD3，

(c)V_LEpCAM-linker1-V_HEpCAM-linker2-V_HCD3-linker1-V_LCD3，

(d)V_HEpCAM-linker1-V_LEpCAM-linker2-V_HCD3-linker1-V_LCD3，

(e)V_LCD3-linker1-V_HCD3-linker2-V_LEpCAM-linker1-V_HEpCAM，

(f)V_LCD3-linker1-V_HCD3-linker2-V_HEpCAM-linker1-V_LEpCAM，

(g)V_HCD3-linker1-V_LCD3-linker2-V_LEpCAM-linker1-V_HEpCAM，

(h)V_HCD3-linker1-V_LCD3-linker2-V_HEpCAM-linker1-V_LEpCAM，

其中，橫杠“-”代表各氨基酸序列順序排列。

在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，第一抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域或第二抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的HCVR(V_H)和LCVR(V_L)之間的Linker(Linker1)的氨基酸序列為(GGGGS)_n(n＝1-4)、(GGS)₄或(Gly)n(n＝6-8)，但不限于此。

在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中，各抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的Linker(Linker2)的氨基酸序列為(GGGGS)n(n＝1-4)，但不限于此。

在本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施例中，雙特異性單鏈抗體氨基酸序列為具有與(a)～(h)任一所示序列的同源性 不小于90％、95％、98％或99％的氨基酸序列。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，各抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的HCVR(V_H)和LCVR(V_L)之間、各抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間通過linker相連，Linker為連接肽，該連接肽主要采用了以甘氨酸和絲氨酸為主構(gòu)成的多肽序列，其中，甘氨酸是分子量最小、側(cè)鏈最短的氨基酸，可增加側(cè)鏈的柔韌性；絲氨酸是親水性最強(qiáng)的氨基酸，可增加肽鏈的親水性。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述特異性雙靶向抗體的N段具有免疫球蛋白κ鏈信號肽的氨基酸序列。

本發(fā)明提供的所述特異性雙靶向抗體的N端加上了免疫球蛋白輕鏈κ鏈的分泌信號肽，從而保證抗體的表達(dá)并分泌到宿主細(xì)胞外。

第二方面，本發(fā)明還提供了一種制備如第一方面所述的特異性雙靶向抗體的方法，該方法包括：將第一方面所述的特異性雙靶向抗體序列用于構(gòu)建表達(dá)所述的特異性雙靶向抗體的重組表達(dá)載體；導(dǎo)入宿主細(xì)胞；在表達(dá)條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，表達(dá)，分離純化，獲得所述特異性雙靶向抗體。

第三方面，本發(fā)明還提供了如第一方面所述的特異性雙靶向抗體按下述一種或多種方法進(jìn)行應(yīng)用：

(1)將所述特異性雙靶向抗體單獨(dú)進(jìn)行應(yīng)用；

(2)將所述特異性雙靶向抗體與化療、放療、手術(shù)、生物治療、免疫治療中的一種或幾種聯(lián)合應(yīng)用；

(3)采用體內(nèi)投遞的方式將所述特異性雙靶向抗體直接投遞到患者體內(nèi)進(jìn)行治療；

(4)先通過體外轉(zhuǎn)染技術(shù)將所述特異性雙靶向抗體與免疫效應(yīng)細(xì)胞混合，然后將所述混有特異性雙靶向抗體的免疫效應(yīng)細(xì)胞輸回患者體內(nèi)實(shí)施治療。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，如第三方面所述的應(yīng)用(3)和(4)中，向患者施用如上所述的抗體，可向患者施用多于一次。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，如第三方面所述的應(yīng)用(3)中，所述的投遞的方式為靶向投遞，包括但不限于采用可靶向投遞的liposome脂質(zhì)體(或其多聚體)等行業(yè)常用載體進(jìn)行投遞。

通過向包括人的哺乳動(dòng)物施用本發(fā)明第一方面提供的抗體或第四方面提供的藥物組合物，可預(yù)防或治療肝癌或其他EpCAM的相關(guān)疾病，比如EpCAM表達(dá)異常或紊亂相關(guān)的疾病。

第四方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，包括至少一種如第一方面所述的特異性雙靶向抗體，及可藥用的載劑、賦形劑或稀釋劑。

本發(fā)明提供的藥物組合物可根據(jù)常規(guī)方法制成藥物制劑。制劑過程中，優(yōu)選將抗體與載體混合或用載體稀釋，或裝入容器形式的載體中。當(dāng)載體作為稀釋劑時(shí)，其可以為固體、半固體或液體，用作用于抗體的囊泡、賦形劑或培養(yǎng)基。因此，制劑可以是片劑、丸劑、粉劑、袋裝劑、膠囊、酏劑、混懸劑、乳劑、溶液劑、糖漿劑、氣溶膠、軟和硬明膠膠囊、注射用無菌溶液、無菌粉劑等形式。合適的載體、賦形劑或稀釋劑的實(shí)例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、硅酸鈣、纖維素、甲基纖維素、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羥基苯甲酸甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸鎂和礦物油。制劑還可以包括填充劑、抗凝血?jiǎng)櫥瑒?、潤濕劑、調(diào)味劑、乳化劑、防腐劑等。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的藥物組合物還包括第二治療劑，第二治療劑為任何有利地與所述的特異性雙靶向抗體組合的活性劑。包括但不限于結(jié)合和/或活化CD3訊號傳遞的其他活性劑(包括其他抗體或其抗原結(jié)合片段等)，和/或不直接與CD3結(jié)合，但卻活化或刺激免疫細(xì)胞活化的活性劑。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的第二治療劑包括與抗體協(xié)同作用的干擾劑、抗EpCAM單克隆抗體、抗EpCAM多克隆抗體、核苷類似物、DNA聚合酶抑制劑、siRNA制劑、用作抗病毒劑的治療用疫苗、細(xì)胞因子、毒素、化學(xué)治療劑、放射治療劑、激素、抗體Fc片段、TLR激動(dòng)劑、含CpG的分子或免疫共刺激分子。

第五方面，本發(fā)明提供了一種診斷試劑，包括至少一種如第一方面所述的特異性雙靶向抗體，及診斷劑，所述的診斷劑包括但不限于熒光團(tuán)、發(fā)色團(tuán)、染料、放射性同位素、化學(xué)發(fā)光分子、順磁性離子或自旋捕獲試劑。

第六方面，本發(fā)明提供了一種抗體藥物，為任一如第一方面所述的特異性雙靶向抗體，與人類CD3結(jié)合并于體外誘導(dǎo)人類T細(xì)胞增殖。

第七方面，本發(fā)明提供了一種抗體藥物，為任一如第一方面所述的特異性雙靶向抗體，與人類CD3結(jié)合并于體外誘導(dǎo)T細(xì)胞介導(dǎo)的對EpCAM陽性細(xì)胞進(jìn)行殺傷。

第八方面，本發(fā)明提供了一種核酸分子，編碼如第一方面所述的特異性雙靶向抗體的氨基酸序列；在某些實(shí)施方式中，所述的核酸分子編碼的氨基酸序列，為與如第一方面所述特異性雙靶向抗體的氨基酸序列具有至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同源性的氨基酸序列。

第九方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)如第一方面所述的特異性雙靶向抗體的重組載體；在某些實(shí)施方式中，所述的重組載體具有本發(fā)明第八方面提供的任一核酸分子序列。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的載體為微環(huán)DNA重組母質(zhì)?；蛭h(huán)DNA。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒是在微環(huán)DNA空質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中插入本發(fā)明第八方面提供的任一核酸分子序列組合而成。具體插入方法可采用常規(guī)的基因克隆，也可采用無縫克隆(Seamless cloning)。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述微環(huán)DNA空質(zhì)粒優(yōu)選為p2ФC31質(zhì)?；騪MC.BESPX質(zhì)粒。具體地，所述空質(zhì)粒p2ФC31構(gòu)建方法參照Chen ZY等,Molecular Therapy,8(3),495-500(2003)、Chen ZY等,Human Gene Therapy,16(1),126-131(2005)和美國專利US7897380 B2。具體地，所述空質(zhì)粒pMC.BESPX構(gòu)建方法及全基因序列參照Chen ZY等,Nature Biotechnology,28,(12),1289-1291(2010)。

本發(fā)明典型實(shí)施例中采用的p2ФC31質(zhì)粒、pMC.BESPX質(zhì)粒分別獲得的p2ФC31重組母質(zhì)粒、pMC.BESPX重組母質(zhì)粒，區(qū)別在于：p2ФC31載體上具有編碼ФC31重組酶和I-Sce1內(nèi)切酶的核苷酸序列，而pMC.BESPX載體上沒有編碼ФC31重組酶和I-Sce1內(nèi)切酶的核苷酸序列，所以采用pMC.BESPX載體制備的微環(huán)DNA母質(zhì)粒更加優(yōu)質(zhì)，大大減少了重組酶和內(nèi)切酶的核苷酸序列的污染；但是pMC.BESPX需配套使用了大腸桿菌E.coli ZYCY10P3S2T工程菌，ZYCY10P3S2T工程菌具有編碼ФC31重組酶和I-Sce1內(nèi)切酶功能，無ФC31重組酶(即phiC31組酶)和I-Sce1內(nèi)切酶核苷酸編碼序列的pMC.BESPX重組母質(zhì)粒需要配套使用ZYCY10P3S2T工程菌才能產(chǎn)生體內(nèi)位點(diǎn)特異性重組(而大腸桿菌E.coli TOP 10無此功能)并最終生產(chǎn)出微環(huán)DNA；相應(yīng)的，p2ФC31重組母質(zhì)?？膳涮资褂肨OP 10即可產(chǎn)生體內(nèi)位點(diǎn)特異性重組，并最終生產(chǎn)出微環(huán)DNA。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的微環(huán)DNA為本發(fā)明提供的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒通過特異性重組位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性重組產(chǎn)生。本發(fā)明提供的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒具有特異性重組位點(diǎn)，所述的“微環(huán)DNA重組母 質(zhì)?！蓖ㄟ^特異性重組位點(diǎn)的位點(diǎn)特異性重組產(chǎn)生微環(huán)DNA和骨架DNA序列。p2ФC31重組母質(zhì)粒生產(chǎn)微環(huán)DNA的方法參照Chen ZY等,Molecular Therapy,8(3),495-500(2003)、Chen ZY等,Human Gene Therapy,16(1),126-131(2005)和美國專利US7897380 B2。pMC.BESPX重組母質(zhì)粒生產(chǎn)微環(huán)DNA的方法參照Chen ZY等,Nature Biotechnology,28,(12),1289-1291(2010)。

如本文所用，“骨架DNA序列”具有標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒中負(fù)責(zé)細(xì)菌質(zhì)粒的復(fù)制、或篩選含質(zhì)粒的宿主等功能的DNA序列，比如細(xì)菌復(fù)制序列、抗性基因、未甲基化的CpG基序等。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，所述的重組載體還包含表達(dá)目的多肽(本發(fā)明中為特異性雙靶向抗體)所需的所有必要元件的基因表達(dá)系統(tǒng)，通常其包括以下元件：啟動(dòng)子、編碼多肽的基因序列，終止子；此外還可選擇性包括信號肽編碼序列等；這些元件是操作性相連的。

如本文所用，所述的“可操作地連接”是指兩個(gè)或多個(gè)核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如：啟動(dòng)子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動(dòng)子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動(dòng)子區(qū)域被“可操作地連接”到該核酸序列上。優(yōu)選地，所述信號肽為免疫球蛋白κ鏈信號肽。優(yōu)選地，所述標(biāo)簽為His標(biāo)簽、GST標(biāo)簽、c-myc標(biāo)簽和Flag標(biāo)簽中的至少一種。以上的信號肽和標(biāo)簽種類為本發(fā)明人的優(yōu)選方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)具體需要選擇合適的信號肽和標(biāo)簽。

第十方面，本發(fā)明提供了一種具有如第九方面所述載體的宿主細(xì)胞(優(yōu)選為真核細(xì)胞或包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞)；還提供了將如第九方面所述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的方法；還提供了通過在允許產(chǎn)生抗體的條件下培養(yǎng)具有所述載體的宿主細(xì)胞，并分離力所產(chǎn)生的抗體的方法。

第十一方面，本發(fā)明提供了一種檢測試劑盒，包括固體檢測支持物，所述的固體檢測支持物包含至少一種如第一方面所述的特異性雙靶向抗體。在一些實(shí)施方式中，所述固體支持物是可連接大分子如抗體、蛋白質(zhì)、多肽、肽、多核苷酸的固體表面，如磁性珠、膠乳珠、微量滴定板孔、玻璃平板、尼龍、瓊脂糖、聚丙烯酰胺、二氧化硅顆粒、硝酸纖維素膜等。

第十二方面，本發(fā)明提供了一種在待測樣品中檢測異常細(xì)胞的方法，其包括使所述樣品與至少一種如第一方面所述的特異性雙靶向抗體相接觸。在一些實(shí)施方式中，所述的樣品來自肝臟或經(jīng)切除的腫瘤床。

如本發(fā)明所述，“異常細(xì)胞”是具有對于該細(xì)胞類型為非典型特征(包括非典型生長、非典型位置處的典型生長或針對非典型靶標(biāo)的典型作用)的任何細(xì)胞。這樣的細(xì)胞包括癌細(xì)胞、良性增生細(xì)胞或發(fā)育異常細(xì)胞、炎性細(xì)胞或自身免疫細(xì)胞。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，采用如第十二方面所述的方法對移植前捐贈(zèng)的組織或器官進(jìn)行篩選，以提供基本不含EpCAM的組織或器官。

在本發(fā)明一些實(shí)施例中，采用如第十二方面所述的方法對血液供給品進(jìn)行篩選，以提供基本不含EpCAM的血液供給品。

第十三方面，如第一方面所述的特異性雙靶向抗體或如第九方面所述的重組載體在制備診斷、預(yù)防、治療EpCAM相關(guān)疾病的試劑或藥物中的應(yīng)用。

如本發(fā)明所述的，所述的“EpCAM疾病”包括但不限于EpCAM表達(dá)異?；蛭蓙y相關(guān)疾病，比如，EpCAM抗原陽性的肝癌。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案，通過設(shè)計(jì)一組特異性雙靶向抗體，并將抗體表達(dá)框(DNA序列)插入微環(huán)DNA載體(優(yōu)選為Kay MA*,He CY and Chen ZY*(*通訊作者).A Robust system for production of minicircle DNA vecrtors.Nat Biotechnology,28:1287,2010)中。由微環(huán)DNA表達(dá)的抗體具有以下特性：1)特異性結(jié)合EpCAM陽性抗原；2)特異性結(jié)合T細(xì)胞；3)介導(dǎo)T細(xì)胞對EpCAM抗原陽性細(xì)胞發(fā)揮殺傷作用。此外，在一些實(shí)施例中，由于抗體表達(dá)框帶有分泌信號肽的編碼序列，抗體表達(dá)后能分泌至胞外、保持生物活性。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1制備的微環(huán)母質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例2制備的微環(huán)DNA的質(zhì)粒圖譜；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例3提供的Western Blot檢測培養(yǎng)基上清中BsAb抗體表達(dá)水平的結(jié)果；

圖4-5為本發(fā)明實(shí)施例4提供的EpCAM×CD3 BsAb細(xì)胞結(jié)合實(shí)驗(yàn)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果；

圖6本發(fā)明實(shí)施例5提供的EpCAM×CD3 BsAb聯(lián)合DCIK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

具體實(shí)施方式

以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明實(shí)施例中無特別說明外，所用試劑及耗材均為市售商品。

實(shí)施例1

具有編碼EpCAM×CD3 BsAb抗體核苷酸序列的微環(huán)母質(zhì)粒的構(gòu)建，包括如下步驟：

1)設(shè)計(jì)BsAb抗體基因表達(dá)盒

本發(fā)明實(shí)施例1的BsAb抗體基因表達(dá)盒除含有編碼BsAb的核苷酸序列之外，還包括啟動(dòng)子、分泌信號肽、蛋白純化標(biāo)簽、polyA加尾信號的編碼序列。

在一具體實(shí)施方式中，本發(fā)明實(shí)施例1的BsAb抗體基因表達(dá)盒包括依次連接的：

編碼免疫球蛋白κ鏈信號肽的核苷酸序列(Murine Ig kapa-chain signal peptide，SEQ ID NO:17)-BsAb抗體的基因序列(V_LEpCAM-linker1-V_HEpCAM-linker2-V_HCD3-linker1-V_LCD3；具體核苷酸序列對應(yīng)表2中的EpCAM LCVR-linker1-EpCAM HCVR-linker2-CD3 HCVR-linker3-CD3 LCVR-編碼組氨酸6-His標(biāo)簽的核苷酸序列(SEQ ID NO:18)-雙重終止密碼子(TAGTGA)；其中，

編碼免疫球蛋白κ鏈信號肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO:17所示。

編碼組氨酸6-His標(biāo)簽的核苷酸序列，如SEQ ID NO:18所示。

本發(fā)明實(shí)施例1的BsAb抗體基因表達(dá)盒還包括巨細(xì)胞病毒CMV啟動(dòng)子的核苷酸序列，位于Signal peptide分泌信號肽的N段；序列為SEQ ID NO:19。

本發(fā)明實(shí)施例1的BsAb抗體基因表達(dá)盒還包括牛生長激素多聚核苷酸poly A(BGH poly A)的核苷酸序列，位于終止密碼子(TGATAG)的C端；序列為SEQ ID NO:20。

為了增強(qiáng)微環(huán)DNA載體的表達(dá)效率，添加了元件chimeric intron(介于CMV啟動(dòng)子和Signal peptide 分泌信號肽之間；文獻(xiàn)報(bào)道，在多種細(xì)胞上能增強(qiáng)10-20倍)，序列為SEQ ID NO:21。

本發(fā)明實(shí)施例1的BsAb抗體基因表達(dá)盒中，linker1為(GGGGS)₃，核苷酸序列為SEQUENCE NO.22所示核苷酸序列。

linker2為GGGGS，核苷酸序列為SEQUENCE NO.23所示核苷酸序列。

Linker3為(GGGGS)₃，核苷酸序列為SEQUENCE NO.22所示核苷酸序列。

具體地，各序列如下：

SEQUENCE NO.17中，

Murine Ig kapa-chain signal peptide

ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT；

SEQUENCE NO.18中，

6-His

CATCATCACCATCATCAT；

SEQUENCE NO.19中，

CMV promoter

GTCAATATTGGCCATTAGCCATATTATTCATTGGTTATATAGCATAAATCAATATTGGCTATTGGCCATTGCATACGTTGTATCTATATCATAATATGTACATTTATATTGGCTCATGTCCAATATGACCGCCATGTTGGCATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACACCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAATAACCCCGCCCCGTTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGGTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACTAGTAGCTTTATTGCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGCT；

SEQUENCE NO.20中，

BGH poly A

GGTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGAACCAGCTG；

SEQUENCE NO.21中，

chimeric intron

AACGCAGTCAGTGCTCGACTGATCACAGGTAAGTATCAAGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGGCCAATAGAAACTGGGCTTGTCGAGACAGAGAAGATTCTTGCGTTTCTGATAGGCACCTATTGGTCTTACTGACATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGGGTACCGAAGCCGCTAGCGCTACCGGTC；

SEQUENCE NO.22中，

Linker1

GGTGGTGGTGGTTCTGGCGGCGGCGGCTCCGGTGGTGGTGGTTCT；

SEQUENCE NO.23中，

Linker2

GGAGGTGGTGGATCC；

2)將所述的BsAb抗體基因表達(dá)盒插入p2ФC31空載體或pMC.BESXP空載體的attB和attP位點(diǎn)之間，具體步驟包括A)或B)中的任一一種：

A)

具體步驟參照發(fā)明人在2014年遞交的PCT申請(申請?zhí)枺篜CT/CN2014/083741)說明書：

實(shí)施例1“一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒p2ФC31.Bab的構(gòu)建方法”，至獲得本發(fā)明實(shí)施例2的具有編碼EpCAM×CD3 BsAb抗體核苷酸序列的p2ФC31微環(huán)母質(zhì)粒；以及

實(shí)施例6“一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA重組母質(zhì)粒pMC.Bab的構(gòu)建方法”的步驟；至獲得本發(fā)明實(shí)施例2的具有編碼EpCAM×CD3 BsAb抗體核苷酸序列的pMC.BESXP微環(huán)母質(zhì)粒。

本發(fā)明步驟1-2)與上述PCT申請不同的地方僅在于，本發(fā)明實(shí)施例2步驟1-2)將上述PCT申請實(shí)施例1或6中的“BiTE的基因序列”替換為本發(fā)明實(shí)施例2的“EpCAM×CD3 BsAb的基因序列”。

B)

直接采用酶切-連接的方法，在BsAb抗體基因表達(dá)盒兩端設(shè)計(jì)SmaI-ApaI兩個(gè)酶切位點(diǎn)與pMC.BESXP空載體或p2ФC31空載體，將合成的BsAb抗體基因表達(dá)盒通過酶切-連接的方式插入p2ФC31空載體或pMC.BESXP空載體的attB和attP位點(diǎn)之間；分別獲得本發(fā)明實(shí)施例1的具有編碼EpCAM×CD3 BsAb抗體核苷酸序列的p2ФC31微環(huán)母質(zhì)?；騪MC.BESXP微環(huán)母質(zhì)粒。

本發(fā)明實(shí)施例1制備的pMC.BESXP微環(huán)母質(zhì)粒的質(zhì)粒圖譜如圖1所示(命名為p-EpCAM×CD3)。

實(shí)施例2

具有編碼EpCAM×CD3 BsAb抗體核苷酸序列的微環(huán)DNA的構(gòu)建

參照發(fā)明人在2014年遞交的PCT申請(申請?zhí)枺篜CT/CN2014/083741)說明書：

實(shí)施例2和實(shí)施例7“一種含基因工程抗體基因表達(dá)盒的微環(huán)DNA的制備方法”，分別至獲得本發(fā)明實(shí)施例2的具有編碼EpCAM×CD3 BsAb抗體核苷酸序列的微環(huán)DNA。

本發(fā)明與上述PCT申請實(shí)施例2和實(shí)施例7不同的地方僅在于，本發(fā)明實(shí)施例3將上述PCT申請實(shí)施例2或7中的微環(huán)母質(zhì)粒替換為本發(fā)明實(shí)施例1提供的微環(huán)母質(zhì)粒。

本發(fā)明實(shí)施例2制備的微環(huán)圖譜如圖2所示。

實(shí)施例3

BsAb抗體的表達(dá)和純化，包括如下步驟：

(1)EpCAM×CD3 BsAb抗體在HEK 293T細(xì)胞中的表達(dá)

采用X-treme GENEHP DNA Transfection Reagent質(zhì)粒轉(zhuǎn)染試劑盒(Roche公司)將實(shí)施例3的微環(huán)DNA(圖2所示微環(huán)母質(zhì)粒制備的微環(huán)DNA)轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，HEK 293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染EpCAM BsAb微環(huán)載體 72小時(shí)后，Western Blot檢測培養(yǎng)基上清和細(xì)胞質(zhì)中BsAb抗體表達(dá)水平，結(jié)果如圖3所示，BsAb-1、BsAb-2細(xì)胞質(zhì)中均有表達(dá)，但只有BsAb-1在培養(yǎng)基上清(分泌表達(dá))。

(2)EpCAM BsAb抗體的純化

將有分泌表達(dá)的抗體BsAb-1中量規(guī)模轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，收集培養(yǎng)上清液進(jìn)行低溫超速離心，取上清，再采用His-Tag親和樹脂純化(Omplete His-Tag Purification Resin，Roche)，純化后的抗體采用ELISA法檢測蛋白質(zhì)濃度；純化后蛋白濃度達(dá)到0.6mg/ml，置于-80℃長期保存，備用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。

實(shí)施例4

流式細(xì)胞術(shù)檢測EpCAM×CD3 BsAb-1抗體與K562、HepG2、Jurkat細(xì)胞的結(jié)合活性，包括如下步驟：

a)細(xì)胞培養(yǎng)：K562(DMEM medium+10％FBS培養(yǎng)；懸浮生長，無EpCAM表達(dá)細(xì)胞系；陰性對照)，HepG2(DMEM medium+10％FBS培養(yǎng)；EpCAM表達(dá)陽性肝癌細(xì)胞系)，Jurkat細(xì)胞(1640medium+10％FBS培養(yǎng)；懸浮生長，CD3表達(dá)陽性細(xì)胞系)；

b)胰酶消化HepG2，加含血清培養(yǎng)基中和后離心棄上清得細(xì)胞；Jurkat為懸浮細(xì)胞直接離心收集細(xì)胞；

c)均用預(yù)冷PBS洗涕2次，200g離心5min，收集細(xì)胞，分別計(jì)數(shù)；

d)平均分配每實(shí)驗(yàn)組1×10⁵個(gè)/組樣品，分組如下：

K562，2組:空白組(Blank，pMC.BESXP空載體轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞后的上清；預(yù)先準(zhǔn)備)；EpCAM BsAb組(實(shí)施例3所得純化的EpCAM BsAb抗體；預(yù)先準(zhǔn)備)

HepG2，2組:分組如上，空白組&EpCAM BsAb組(實(shí)施例3所得純化的EpCAM BsAb抗體；預(yù)先準(zhǔn)備)

Jurkat，2組:分組如上，空白組&EpCAM BsAb組(實(shí)施例3所得純化的EpCAM BsAb抗體；預(yù)先準(zhǔn)備)

e)加入上述上清100μl/組冰上孵育30min；

f)加入1ml預(yù)冷PBS洗滌，200g離心5min，收集細(xì)胞，加事先預(yù)冷并稀釋好的APC-mouse anti-6His抗體的PBS 100μl(1:1000稀釋)，冰上孵育30min，

g)加入1ml預(yù)冷PBS洗滌，200g離心5min，收集細(xì)胞，再用200μl PBS重懸。上流式細(xì)胞儀(BD C6)進(jìn)行檢測，觀察結(jié)合情況。

圖4為BsAb結(jié)合CD3陽性細(xì)胞(Jurkat)的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果；圖5為BsAb結(jié)合EpCAM抗原陽性細(xì)胞(HepG2)的流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果。圖4和圖5中，C曲線為空白組；B曲線為BsAb實(shí)驗(yàn)組。由圖可知，BsAb-1具有結(jié)合細(xì)胞表面相關(guān)抗原的功能。

實(shí)施例5

EpCAM×CD3 BsAb-1抗體聯(lián)合DCIK細(xì)胞殺傷HepG2細(xì)胞的方法

本例中靶細(xì)胞(T)為HepG2細(xì)胞；效應(yīng)細(xì)胞(E)為DCIK細(xì)胞(樹突狀細(xì)胞調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子誘導(dǎo)的 殺傷細(xì)胞，dendritic cell activated and cytokine induced killer cell)

步驟：

a)提前1天種靶細(xì)胞(HepG2)于96孔板，細(xì)胞接種量為2×10⁴/孔；同時(shí)設(shè)置分組(如下表3；每組3個(gè)復(fù)孔)：

表3 不同分組

b)第二天更換新鮮opti-DMEM培養(yǎng)基，100μL/孔；

c)效應(yīng)細(xì)胞DCIK(E)計(jì)數(shù)并重懸于opti-DMEM培養(yǎng)基，按照T:E＝1：8的比例，根據(jù)a)中分組加入相應(yīng)數(shù)量的DCIK(1.6×10⁵/孔，100μL/孔)；

d)根據(jù)分組，相應(yīng)孔加入10μl/孔純化的BsAb抗體(濃度分別為0.02、0.04、0.06μg/μL)，混勻；

e)37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育6小時(shí)；

f)加入CCK-8(Dojindo，日本)試劑(20μl/孔)，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱孵育2小時(shí)后，450nm處測定吸光度；

g)根據(jù)CCK-8試劑盒(Dojindo，日本)說明書，統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)目并推算殺傷效率：

殺傷率＝[((T+E)-T&E)/T]×100％

其中，T代表活的靶細(xì)胞數(shù)量；E代表活的效應(yīng)細(xì)胞數(shù)量；則T+E等于活的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞的總數(shù)；T&E代表靶細(xì)胞經(jīng)效應(yīng)細(xì)胞殺傷后的活細(xì)胞數(shù)量。

EpCAM×CD3 BsAb聯(lián)合DCIK細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如圖6所示。

在圖6中，縱軸表示靶細(xì)胞死亡率的相對值；橫坐標(biāo)表示不同組別。

由圖6可知，BsAb 0.02、BsAb 0.04、BsAb 0.06分別對應(yīng)表3-組4中的BsAb抗體濃度分別為0.02、0.04、0.06μg/μl的設(shè)置；DCIK為表3-組3的結(jié)果；由此可知，單純加入效應(yīng)細(xì)胞DCIK，對靶細(xì)胞殺傷效果不佳，僅為28％左右；而同時(shí)加入DCIK和BsAb的組4，靶細(xì)胞殺傷效果分別可達(dá)62％、85％和91％，且隨BsAb抗體濃度的增加，殺傷效果越好。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。