本發(fā)明屬于小麥轉基因技術領域。具體涉及利用小麥基因提高擬南芥的DON耐受性和FHB抗性。所述的基因分離克隆自TaMetRS基因，該基因被證實是一種具有新功能的MetRS基因，在植物的防御反應和脫毒過程中起著重要的作用。TaMetRS基因受到DON的誘導，定位于細胞核，參與細胞防御反應的調控。超表達該基因可以提高擬南芥對DON的耐受性及FHB的抗性。利用本發(fā)明的基因，可望提高植物的赤霉病抗性，為轉基因小麥抗病育種提供新的安全的基因資源。

背景技術：

小麥是世界上最重要的糧食作物之一，小麥赤霉病(Fusarium head blight，FHB)是由禾谷鐮刀菌為主引起的真菌性病害，主要發(fā)生在世界溫暖潮濕和半潮濕地區(qū)，在我國主要發(fā)生在長江中下游地區(qū)，嚴重降低小麥產量和品質，威脅糧食安全。禾谷鐮刀菌可以在苗期和花期侵染小麥引起苗腐病和穗腐病，并產生包括單端孢霉烯，玉米烯酮和伏馬菌素等多種真菌毒素。作為單端孢霉烯類毒素中分布最廣的deoxynivalenol(DON)毒素，已經成為世界范圍內糧食及飼料的主要污染源之一。DON毒素能夠抑制真核細胞蛋白質的生物合成，人或動物在食用含有DON毒素的食品后，會導致強烈的嘔吐并破壞免疫系統，嚴重影響人和牲畜的健康。

MetRS基因的基本傳統功能是催化甲硫氨酸(methionion)與相對應的tRNA的連接，形成Met-tRNA_i^Met，在蛋白的生物合成過程中起著至關重要的作用。但是同時MetRS在也具有其它重要的作用。MetRS可能在rRNA的生物合成中起著重要的作用，在哺乳動物中MetRS具有抑制癌細胞的活性，同時MetRS是人類非洲錐蟲病抗寄生蟲藥物的靶標。但是到至今為止，還沒有MetRS基因與DON抗性和FHB抗性有關的相關報道。在申請人的前期研究中，從小麥懸浮細胞的抑制差減雜交文庫(suppression subtractive hybridization，SSH)中篩選到一個390bp的EST片段，受到DON的強烈的誘導，后來通過3’RACE和5’RACE克隆到了基因的全長，將該基因命名為TaMetRS。鑒于在小麥中的TaMetRS基因能否提高植物的FHB抗性尚無報道，因此，從小麥中分離到TaMetRS基因，并鑒定它具有新的功能，在擬南芥中超表達該基因后，能夠提高擬南芥的DON耐受性和FHB抗性，對于培育小麥抗病新品種具有非常重要的意義。

技術實現要素：

本發(fā)明的目的涉及一個小麥的TaMetRS基因在控制植物赤霉病抗性改良中的應用。本發(fā)明分離和應用一種包含TaMetRS基因的DNA片段，該片段賦予擬南芥幼苗DON的抗性及花期FHB的抗性。其中所述的TaMetRS基因的核苷酸序列如列表SEQ ID NO：1所示，序列長度為2186bp，其中該基因的編碼區(qū)是SEQ ID NO：1中70-1860位堿基對應的序列，該基因編碼的蛋白質序列如列表SEQ ID NO：2所示，編碼596個氨基酸。

具體地，本發(fā)明的技術方案如下所述：

一種受到真菌毒素deoxynivalenol(DON)誘導的小麥基因TaMetRS在植物赤霉病抗性改良中的應用，該基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1中1-2186位堿基對應的序列。

一種受到真菌毒素deoxynivalenol(DON)誘導的小麥基因TaMetRS在植物赤霉病抗性改良中的應用，該基因編碼的蛋白質的序列如序列表SEQ ID NO：2所示。

本發(fā)明所述的應用的植物是擬南芥。

本發(fā)明的應用包括下列步驟：

利用PCR擴增小麥基因TaMetRS的編碼區(qū)域，并在兩端分別添加EcoRI和BamHI酶切位點，連接到中間載體PTRAkc-VDM1-ERH中，得到植物超量表達載體PTRAkc-35SS-TaMetRS，利用農桿菌介導的遺傳轉化方法轉化擬南芥，獲得TaMetRS基因超量表達的轉基因擬南芥，通過噴霧接種禾谷鐮刀菌5035的孢子液，驗證了轉基因擬南芥的抗赤霉病能力。其中，所述的植物超量表達載體PTRAkc-35SS-TaMetRS包含有SEQ ID NO：1中70-1860位堿基對應的序列編碼區(qū)域。

本發(fā)明中的培養(yǎng)基組分及配比如下所示：

農桿菌培養(yǎng)基(YEB)：營養(yǎng)肉湯5g+酵母提取物5g+蛋白胨5g+蔗糖5g，(15g/L瓊脂)pH 7.0；1/2MS篩選培養(yǎng)基：MS大量(20×)25mL+MS有機(200×)5mL+MS鐵鹽(200×)2.5mL+MS微量(200×)2.5mL+100mg/L肌醇+20g/L蔗糖+50mg/L Kana，(6.3g/L瓊脂)pH 5.8。

上述培養(yǎng)基在添加完各組分后，補加蒸餾水定容至1L，在121℃高壓蒸汽下滅菌18分鐘。培養(yǎng)基中涉及到的抗生素的滅菌采用過濾滅菌，在超凈工作臺內的無菌環(huán)境下加入到冷卻到60℃的高壓滅菌后的培養(yǎng)基中使用。

本發(fā)明的優(yōu)點在于：

本發(fā)明克隆的TaMetRS基因可以提高擬南芥植株對真菌毒素DON的耐受性，并且顯著提高了轉基因擬南芥植株對赤霉病病原菌禾谷鐮刀菌的抗性。

本發(fā)明所使用的植物超表達載體pTRAkc-35SS-TaMetRS能夠在擬南芥中高效表達TaMetRS基因，使提高植物的赤霉病抗性成為可能。

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明做進一步說明。

附圖說明

序列表SEQ ID NO：1是本發(fā)明克隆的小麥基因TaMetRS(甲硫氨酰tRNA合成酶基因)的核苷酸序列，序列長度為2186bp，它對應的氨基酸序列(即編碼區(qū))是SEQ ID NO：1中70-1860位堿基對應的序列，編碼596個氨基酸。

序列表SEQ ID NO：2是本發(fā)明的小麥基因TaMetRS(甲硫氨酰tRNA合成酶基因)編碼的的蛋白質序列。

序列表SEQ ID NO：3是從小麥的懸浮細胞的抑制差減雜交文庫(SSH)中篩選得到390bp的EST片段的核苷酸序列。

圖1：是本發(fā)明分離克隆TaMetRS基因及功能鑒定的總體技術路線圖。

圖2：TaMetRS基因的全長序列克隆。附圖標記說明：圖2中的A圖為3’RACE產物；圖2中的B圖為5’RACE產物，圖2中的C圖為TaMetRS基因的全長cDNA。

圖3.TaMetRS基因在鄭麥9023(Z9)和蘇麥3號(S3)兩個小麥品種中，接種DON，禾谷鐮刀菌5035和Tri5－孢子液后的表達模式。圖3中的A圖為小麥品種Z9和S3接種DON毒素后TaMetRS基因的表達模式；圖3中的B圖為小麥品種Z9和S3接種不同的禾谷鐮刀菌菌株5035和Tri5－后的表達模式。

圖3表明本發(fā)明的TaMetRS基因能被DON和產毒菌株禾谷鐮刀菌5035誘導表達，而Tri5基因缺失的菌株Tri5－對TaMetRS基因的表達沒有影響。

圖4：中間載體PTRAkc-VDM1-ERH的結構圖譜。

圖5：本發(fā)明構建的植物超量表達載體PTRAkc-35SS-TaMetRS的結構圖譜。

圖6：轉基因擬南芥的分子鑒定及表達量分析。。附圖標記說明：圖6中的A圖為轉基因擬南芥的PCR鑒定，引物為TaMetRS-F2/TaMetRS-R2，目的產物大小為1800bp；圖6中的B圖為轉基因擬南芥中TaMetRS基因的表達量分析，擴展TaMetRS基因的引物為TaMetRS-F3/TaMetRS-R3，目的片段大小為bp；內參基因Actin的擴增引物為Actin-F/Actin-R，目的片段大小為135bp。

圖7：T2代轉基因擬南芥幼苗在不同濃度DON(0ppm、5ppm、10ppm及15ppm)條件下處理2周后的表型。

圖8：T3代擬南芥接種禾谷鐮刀菌5035孢子液后，7天和10天的表型

具體實施方式

以下實施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在分離克隆包含有TaMetRS基因完整編碼區(qū)段以及驗證TaMetRS基因功能的方法。根據以下的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。

實施例1：分離克隆TaMetRS基因的全長序列。

從小麥的懸浮細胞的抑制差減雜交文庫(SSH)中篩選得到390bp的EST片段，受到DON的強烈誘導(申請人的前期工作，未發(fā)表)，該序列如下：

AAAAGATGTCTTGCAACAGCTGAATCTCTGTCCGAATGAGCATATTTCTTTTGCCGATGAAAAGGGGGAGAGTGACAAGGCGAAAAGGCCTTGGGATCTTATACCATCAAACCACAGGATTGGGAAAATTGTGCCTTTGTTCACAGAGTTGAAAGATGATGCAGTGGATAGCTTCAGGGAAACATTTGCAGGCAGTCAGGCCGAAAGAAACGCAAGGGCTAATTAAAGAAGCCAATGAAGTTGTTGCCTAACTGGAAGCTGCAAAACATTTCTTGCAAAGTTGATCACAATACTTAATCAAATGACATTGAGATCCAGAAATGTGAGTTCGAAGGATGAATCACAATGTATATTTTACTGATTATTAGTGATGATGCATTCAGAAAATGT

根據該序列，申請人設計了兩條上游引物和兩條下游引物，分別是:3’RACE-F1/3’RACE-F2及5’RACE-R1/5’RACE-R2(見表1)，按照RACE試劑盒(購自Clontech公司)說明書操作，PCR反應體系的總體積為50μL，cDNA模板1uL(約100ng)、10×KOD plus buffer酶反應緩沖液5uL、2.5mM dNTP 5uL、10uM引物1.5uL、1uL KOD酶，加雙蒸水至50μL。反應程序為：94℃變性5min，94℃30s、60℃30s、72℃3min、35個循環(huán)，72℃延伸5min。PCR擴增結果如圖2，3’RACE得到501bp的片段(圖2中的A圖)，5’RACE得到1858bp的片段(圖2中的B圖)，二者拼接之后得到2186bp的片段(序列見SEQ ID NO：1)，設計引物TaMetRS-F1/TaMetRS-R1(表1)擴增TaMetRS全長并測序得到2186bp的片段(圖2中的C圖)。

表1基因克隆所用到的引物

表1的說明：引物名稱后的英文字母F，R分別代表正向引物和反向引物。

實施例2：檢測小麥品種中TaMetRS基因的表達模式

申請人選擇兩種小麥品種，鄭麥9023(對FHB感病，國審品種，國審麥2003027，參見Cheng等，Tissue-specific and pathogen-inducible expression of a fusion protein containing a Fusarium-specific antibody and a fungal chitinase protects wheat against Fusarium pathogens and mycotoxins.Plant Biotechnology Journal.2015.doi:10.1111/pbi.12289)和蘇麥3號(對FHB抗病，1970年由江蘇地區(qū)農科所選育，對赤霉病高抗，參見Cheng等，Tissue-specific and pathogen-inducible expression of a fusion protein containing a Fusarium-specific antibody and a fungal chitinase protects wheat against Fusarium pathogens and mycotoxins.Plant Biotechnology Journal.2015.doi:10.1111/pbi.12289)，作為表達譜分析的材料。種子催芽后，置于4℃冰箱春花處理(催芽和春花處理是本領域的常識)2周，移栽至溫室。在小麥楊花初期，選擇生長狀態(tài)一致的小麥穗子，用剪刀剪去麥穗中部小穗的麥芒，用微量注射器注入10uL，5×10⁵個/mL的孢子液或是無菌水或是15uL 1.5mg/mL的DON溶液，每株接種一個做過標記的中部小穗，套上透明塑料袋保濕3天后揭掉袋子，接種孢子液的小穗分別于24h，48h，72h和96h取樣，接種DON毒素的小穗于4h，12h，24h和48h取樣。將所取的樣品首先置于液氮中凍存，然后置于-80℃冰箱保存。利用Trizol(購自Invitrogen公司)試劑提取總RNA(試驗步驟按照Trizol試劑說明書操作)。利用反轉錄酶SuperScript^TMⅢ(購自Invitrogen公司)將其反轉錄合成cDNA(方法根據Invitrogen公司反轉錄酶試劑說明書)，反應條件為：65℃5min，50℃60min,70℃10min。以上述反轉錄合成的cDNA為模板，用引物對TaMetRS-F3/TaMetRS-R3(見表1)基因進行特異的PCR擴增。同時用引物Actin-F/Actin-R對小麥Actin基因(AB181991)做特異擴增(擴增產物長135bp)，以作為內參基因進行定量分析。反應條件為：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，45個循環(huán)。反應過程中進行熒光檢測實時定量分析(熒光檢測實時定量分析為本領域常用方法，參見文獻：Li等，Resistance to Fusarium head blight and seedling blight in wheat is associated with activation of a cytochrome P450gene.Phytopathology.2010.100:183-191)。結果表明(圖3)，TaMetRS基因受到DON毒素的強烈誘導，接種4h后在Z9和S3中分別誘導表達43倍和22倍，在24h時到達誘導高峰值，分別為700倍和600倍，在48h時誘導表達開始降低。TaMetRS基因同時也受到禾谷鐮刀菌5035產毒真菌(由申請人所在試驗室1999年在武漢分離與保存的一種高致病力禾谷鐮刀菌菌株，參見Xu等，Disruption of the chitin synthase gene Chs1from Fusarium asiaticum results in an altered structure of cell walls and reduced virulence.Fungal Genetics and Biology.2010.47:205-215)的誘導，但是非產毒菌Tri5^－(由申請人所在試驗室構建與保存的一種禾谷鐮刀菌Tri5基因缺失突變菌株，參見Xu等，Disruption of the chitin synthase gene Chs1from Fusarium asiaticum results in an altered structure of cell walls and reduced virulence.Fungal Genetics and Biology.2010.47:205-215)對其表達沒有影響。在禾谷鐮刀菌5035在麥穗中開始產毒后(36h)，TaMetRS基因開始誘導表達，而且該基因的誘導表達只與DON有關，與小麥品種及其FHB抗性(即遺傳背景)沒有關系。

實施例3：TaMetRS基因超量表達載體的構建和轉化擬南芥

PTRAkc-35SS-TaMetRS植物表達載體的構建

為了能更好的分析TaMetRS基因的功能，申請人將TaMetRS基因在擬南芥中超量表達。從轉基因植株的表型研究該基因的功能。超量表達載體構建方法如下：以小麥品種鄭麥9023(Z9)DON處理12h后的總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，用引物TaMetRS-F2/TaMetRS-R2(請見表1)，擴增出包含TaMetRS基因完整編碼區(qū)的cDNA片段(見序列表SEQ ID NO:1所示的序列)，在該cDNA片段的兩端分別添加EcoRI和BamHI酶切位點，反應條件為：94℃預變性5min；94℃30sec，58℃30sec，72℃1min，35個循環(huán)；72℃延伸5min。PCR產物電泳后，切取1800bp左右的目的片段，用DNA片段回收試劑盒(購自Axgen公司)，向凝膠中加入3倍體積的DE-A緩沖液(試劑盒自帶)，75℃水浴溶解6min，使凝膠完全溶解后，加入1.5倍體積的DE-B緩沖液(試劑盒自帶)，移入回收柱中，以12000rpm離心1min，棄流出的液體，向回收柱中加入500ul washing buffer 1，12000rpm離心1min，再向回收柱中加入700ul washing buffer 2，12000rpm再離心1min，重復用washing buffer 2洗滌一次，加入25ul elution buffer，靜置2min后，12000rpm離心2min，得到純化的PCR產物即TaMetRS基因，將上述純化后的PCR產物分別用EcoRI和BamHI酶切后，無水乙醇沉淀回收。同時也將載體PTRAkc-VDM1-ERH(見圖4，由華中農業(yè)大學麥類作物分子生物技術試驗室改造)分別用EcoRI和BamHI酶切后，切膠回收，最后將酶切好的目的片段用T4DNA ligase(Transgene)連接到載體骨架中，構建得到超量表達載體，其后轉化大腸桿菌DH5α，通過篩選陽性克隆，得到重組載體的PTRAkc-35SS-TaMetRS(圖5)。

轉基因植株的遺傳轉化與篩選鑒定

TaMetRS基因的遺傳轉化

通過農桿菌介導的擬南芥遺傳轉化方法將上述超表達載體PTRAkc-35SS-TaMetRS轉入到擬南芥中，農桿菌介導的擬南芥的遺傳轉化方法是參考Zhang Xiuren等人報道的方法(Zhang Xiuren等，Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method，Nature protocols，1:641-646，2006)。具體操作步驟如下：擬南芥培養(yǎng)至頂生花序約3cm時，去除其頂生花序以刺激側生花序生長。在側生花序長至6～10cm時進行轉化。轉化前使土壤吸足水分，并將已授粉的小花及幼嫩角果去除。根癌農桿菌劃線培養(yǎng)至出現單菌落，挑取單菌落至5ml YEB培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)40h，按1：100比例接種至50ml YEB培養(yǎng)基中，28℃、200r/min振蕩培養(yǎng)至OD₆₆₀達0.8左右，6000r/min離心15min收集菌體，用等體積轉化重懸液重懸菌體沉淀。將擬南芥植株蓮座葉以上部分全部浸入重懸液中，保持15sec。轉化后的植株平放于鋪有潤濕濾紙的托盤中，蓋上保鮮膜以保持濕度，1h后，按照同樣的方法再處理一次。黑暗條件下保持24h后將植株取出直立，于22℃、8h光照條件下培養(yǎng)。待植株正常開花結實后收獲種子，干燥后-20℃保存?zhèn)溆谩Ｊ斋@的種子放入離心管中，先用濃度為70％酒精處理1min，再用0.15％次氯酸溶液處理2min，無菌水清洗數次；播種在1/2MS培養(yǎng)基(pH 5.7，含Kan 50mg/ml)上以篩選陽性轉化子，每皿約1000粒種子，4℃春化3～4d后，于22℃、8h光照條件下培養(yǎng)。能正常生長的植株長至5、6片葉后移栽至營養(yǎng)土中。

轉基因陽性植株的分子鑒定與表達量分析

提取轉基因T0植株新鮮葉片提取DNA(使用植物基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司產品)，目的基因引物TaMetRS-F2/TaMetRS-R2進行PCR陽性檢驗，結果見圖6中的A圖。

轉基因陽性植株TaMetRS基因的表達量分析

利用Trizol(購自Invitrogen公司)試劑提取轉基因陽性植株MetRS-1和MetRS-2的總RNA(試驗步驟按照Trizol試劑說明書操作)。利用反轉錄酶SuperScript^TMⅢ(購自Invitrogen公司)將其反轉錄合成cDNA(方法根據Invitrogen公司反轉錄酶試劑說明書)，反應條件為：65℃5min，50℃60min,70℃10min。以上述反轉錄合成的cDNA為模板，用引物對TaMetRS-F3/TaMetRS-R3(見表1)基因進行特異的PCR擴增。同時用引物Actin-F/Actin-R對小麥Actin基因(AB181991)做特異擴增(擴增產物長135bp)，以作為內參基因進行半定量分析。反應條件為：95℃5min；95℃10sec，60℃5sec，72℃34sec，28個循環(huán)。電泳檢測PCR產物的濃度。結果表明(見圖6的B圖)，TaMetRS基因在轉基因植株中大量表達。

實施例4：TaMetRS超量表達轉基因T₂/T₃代株系在DON脅迫下的生長狀況

本實施例選取本發(fā)明的轉TaMetRS基因的超量表達的T₂代株系(編號為MetRS-1)進行了不同濃度的DON脅迫試驗。具體步驟如下：將超量表達轉基因株系(MetRS-1)種子按常規(guī)方法消毒(先用濃度為70％酒精處理1min，再用0.15％次氯酸溶液處理2min，無菌水清洗數次)，在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培 養(yǎng)基上發(fā)芽，將野生型擬南芥(非轉基因，簡稱WT)播于不含卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，在4℃春化處理2天，置于20℃，生長7天后挑選發(fā)芽好且長勢一致的種子轉移到含有0ppm、5ppm、10ppm及15ppm四種不同濃度DON的1/2MS培養(yǎng)基上。生長2周后，測量轉基因植株和野生型植株的根長和鮮重，試驗重復3次，每次每個株系20株苗。試驗結果表明(圖7)，在0ppm和5ppm兩種濃度DON的條件下，野生型和轉基因植株的根長和鮮重沒有明顯差異，但是DON能夠抑制擬南芥的生長。在10ppm及15ppm DON濃度下，野生型和轉基因植株的生長均受到了抑制，但是轉基因植株的根長和鮮重都明顯高于野生型，而且在15ppm DON濃度下差異最大。因此申請人選擇15ppm DON濃度進行后續(xù)的DON脅迫試驗。

不同轉基因株系(編號為MetRS-1和MetRS-2)T₂/T₃株系在15ppm DON濃度下的脅迫試驗。具體步驟如下：將超量表達轉基因株系(MetRS-1和MetRS-2)T₂/T₃種子消毒(濃度為70％酒精處理1min，0.15％次氯酸處理2min，無菌水清洗數次)，在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，野生型擬南芥(WT)播于不含卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，4℃春化2天，置于20℃，生長7天后挑選發(fā)芽好且長勢一致的種子轉移到含有15ppm DON濃度的1/2MS培養(yǎng)基上。生長2周后，測量轉基因植株和野生型植株的根長和鮮重，試驗重復3次，每次每個株系20株苗。試驗結果表明(表2)，不同轉基因株系(MetRS-1和MetRS-2)T₂/T₃材料在15ppm DON濃度下，根長和鮮重均較野生型要高，說明TaMetRS基因的超量表達確實能夠提高轉基因植株的DON耐受性，具體結果見表2。

表2轉基因株系(MetRS-1和MetRS-2)T₂/T₃材料在15ppm DON濃度下處理2周的根長與鮮重

a表示在0.05水平具有顯著性差異

b表示在0.01水平具有顯著性差異

實施例5：TaMetRS超量表達轉基因T₂代株系的FHB抗性分析

本實施例選取了本發(fā)明的不同轉基因株系(編號為MetRS-1和MetRS-2)T₂/T₃株系，接種禾谷鐮刀菌5035孢子液，濃度為5×10⁵個/ml后，分析植株的發(fā)病情況。具體步驟如下：將超量表達轉基因株系(MetRS-1和MetRS-2)T₂/T₃種子消毒(濃度為70％酒精處理1min，0.15％次氯酸處理2min，無菌水清洗數次)，在含有50mg/L卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上發(fā)芽，野生型擬南芥(WT)播種于不含卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基上，4℃春化處理2天，置于20℃，生長7天后移栽到小缽中。試驗用的土壤為炭泥土：蛭石：珍珠巖＝2：1：1(重量比)混合而成。置于短光照條件(8小時光照/16黑暗)20℃生長35天左右，此時擬南芥開花比較茂盛，選取生長狀態(tài)比較一致的植株，進行禾谷鐮刀菌5035孢子噴霧接種，每株均勻噴霧一次。具體接種方法如下：調整好濃度的孢子液添加0.001％的Silwet L-77，選擇噴霧效果較好的小型噴霧器，均勻噴撒至擬南芥的花序部位，并注意隨時震蕩噴霧器，使孢子液均勻懸浮，避免孢子液的沉 淀；噴霧接種后的擬南芥用大的塑料罩子罩住保濕，避光保濕2天，讓孢子充分萌發(fā)，相對濕度為100％，每天噴水保濕；2天后轉入光照培養(yǎng)，繼續(xù)噴水保濕；接種后的第7天和第10天分別對發(fā)病情況進行調查。每次接種20株，三次重復。

擬南芥調查主要對花序(F)、老角果(OS)及新角果(NS)發(fā)病情況進行統計，最終的發(fā)病指數(Fusarium-Arabidopsis disease，FAD)是三者之和，即FAD value＝F+NS+OS具體打分標準見表3(Urban等，Arabidopsis is susceptible to the cereal ear blight fungal pathogens Fusarium graminearum and Fusarium culmorum，The Plant Journal，32:961-973)。

表3擬南芥接種禾谷鐮刀菌5035調查統計方法

結果表明，轉基因植株在第7天和第10天的FAD值均要低于野生型(表4)。其中，T₂代轉基因株系MetRS-1在第7天和第10天的FAD值為6.59和8.41，與WT相比分別降低了41％和38％，而MetRS-2在第7天和第10天的FAD值為5.10和5.91，與WT相比分別降低了55％和57％，T3代轉基因株系的FAD值也明顯降低(圖8)。因此上述結果說明，在擬南芥中超表達TaMetRS基因可以提高植株的FHB抗性。

表4擬南芥接種禾谷鐮刀菌5035后的發(fā)病指數(FAD)調查

b表示在0.01水平具有顯著性差異。