本發(fā)明涉及一種五元雜環(huán)取代的N-烷基酰胺類WNT通路抑制劑，屬于調(diào)節(jié)Wnt信號通路活性的化合物，并提供了該類化合物的制備方法，及該類化合物用于在制備拮抗Wnt信號通路的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：Wnt信號通路在多細胞生物體軸分化、組織器官發(fā)生、腫瘤形成等生命過程中具有重要作用。Wnt基因編碼表達的蛋白是一類分泌型糖蛋白，由19個成員組成，通過與細胞膜上Frizzled(Fzd)家族蛋白及低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LDLreceptorrelatedprotein，LRP)受體結(jié)合，激活典型Wnt/β-catenin通路、平面極通路、Wnt/Ca2+通路等多種細胞內(nèi)信號途徑，調(diào)控著包括增殖、分化、死亡、遷移、極化等多種細胞功能(NusseRoel,VarmusHaroldE.(1992).Wntgenes.Cell,69(7),1073-1087.)。經(jīng)研究報道發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)性疾病、炎癥纖維化疾病、代謝性疾病以及多種類型癌癥的發(fā)病機制中都有涉及到典型Wnt/β-catenin信號通路β-catenin-TCF/LCF轉(zhuǎn)錄復(fù)合物的激活的失調(diào)(Kahn,M.(2014).CanwesafelytargettheWntpathway？Naturereviews.Nat.Rev.Drug.Discovery,13(7),513-532.)。在癌癥研究領(lǐng)域中，Wnt信號參與腫瘤早期證據(jù)來源于小鼠乳腺癌中分離得到因病毒插入而激活的癌基因Int1；近10％的結(jié)直腸癌、頭頸癌、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤患者癌癥發(fā)生與Wnt信號調(diào)控元件R-spondin家族和RNF43/ZNRF3的功能突變誘導相關(guān)(BMadan,ZKe,NHarmston,etal.(2015).Wntaddictionofgenetically definedcancersreversedbyPORCNinhibition.Oncogene,1-11.)。然而，這類患者目前臨床上尚無針對性的Wnt信號通路小分子靶向藥物治療，非選擇性的細胞毒制劑及其聯(lián)合治療方案所帶來的胃腸道反應(yīng)、骨髓造血抑制等方面的不良反應(yīng)嚴重影響患者的生存質(zhì)量。目前，進入臨床試驗階段藥物候選物還處于安全性和概念性藥效驗證的臨床I/II期階段，例如，針對Wnt信號通路上游靶點PORCN設(shè)計的LGK974(ClinicalTrials.govIdentifier:NCT01351103)，ETC-1922159(ClinicalTrials.govIdentifier:NCT02521844)；針對Wnt信號通路下游靶點CBP/β-catenin設(shè)計的PRI-724(ClinicalTrials.govIdentifier:NCT02413853)。鑒于此，繼續(xù)研制具有可以調(diào)控Wnt信號通路的藥物，尋找到一種作用機制明確、藥效顯著的化合物，具有重要的臨床價值和社會意義。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種結(jié)構(gòu)新穎的五元雜環(huán)取代的酰胺類WNT通路抑制劑，通過基團的取代修飾，合成并篩選出一系列具有抗腫瘤活性的化合物。為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：一種五元雜環(huán)取代的N-烷基酰胺類WNT通路抑制劑，為具有如下結(jié)構(gòu)通式的化合物及其藥學上可接受的鹽：其中，環(huán)A和環(huán)B各自獨立地選自芳香環(huán)、或含1-2個N、O雜原子的芳香雜環(huán)；X、Y、Z各自獨立地選自CR4、NR5、S原子、O原子中的一種，且S原子和O原子不同時存在；n選自1～2中的任一整數(shù)值；R1為取代或未取代的芳基、雜環(huán)基，芳基、雜環(huán)基上的取代基團選自鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、 C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、羥基、氰基、氨基、?；?、磺基中的一種或幾種；R2、R3各自獨立地選自鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、C3-6環(huán)烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、羥基、氨基、酰基、芳基、雜環(huán)基中的一種或幾種；R4、R5各自獨立地選自氫、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、C3-6環(huán)烷基中的一種；雜環(huán)基為選自N、O、S雜原子的3-12元雜環(huán)。優(yōu)選的，為任一具有如下結(jié)構(gòu)通式的化合物及其藥學上可接受的鹽：其中，環(huán)B選自芳香環(huán)、或含1-2個N、O雜原子的芳香雜環(huán)；X、Y、Z各自獨立地選自CR4、NR5、S原子、O原子中的一種，且S原子和O原子不同時存在；n選自1～2中的任一整數(shù)值；R1取代或未取代的苯基、雜環(huán)基，苯基、雜環(huán)基上的取代基團選自鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、羥基、氰基、氨基、?；⒒腔械囊环N或幾種；R2、R3各自獨立地選自鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、C3-6環(huán)烷基、羥基、氨基、?；?、苯基、雜環(huán)基中的一種或幾種；R4、R5各自獨立地選自氫、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基中的一種；雜環(huán)基為選自N、O、S雜原子的3-6元雜環(huán)。更優(yōu)選的，結(jié)構(gòu)通式(2)中，選自中的一種；X、Y、Z各自獨立地選自CR4、NR5、S原子、O原子中的一種，且S原子和O原子不同時存在；n選自1～2中的任一整數(shù)值； R1為中的一種；R2、R3各自獨立地選自氫、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、酰胺基、C1-6烷基酰胺基、雜環(huán)基中的一種；R4、R5各自獨立地選自氫、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基中的一種；R6選自氫、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、酰胺基中的一種；雜環(huán)基為選自N、O雜原子的3-6元雜環(huán)。優(yōu)選的，芳基為苯基、萘基或蒽基；所述的雜環(huán)基為嗎啉基、哌啶基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、咪唑基或噻唑基。優(yōu)選的，鹵素為氟、氯、溴、碘中的一種。一種五元雜環(huán)取代的N-烷基酰胺類WNT通路抑制劑，選自編號為REX-W-1～REX-W-8的如下特征化合物：REX-W-1：N-((5-(2-甲基吡啶-4-基)噻唑-2-基)甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-酰胺；REX-W-2：N-((4-甲基-5-(2-甲基吡啶-4-基)噻唑-2-基)甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-酰胺；REX-W-3：N-((2-(2-甲基吡啶-4-基)噻唑-5-基)甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-酰胺；REX-W-4：N-((3-(2-甲基吡啶-4-基)-1,2,4-惡二唑-5-基)甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-酰胺；REX-W-5：N-((5-(2-甲基吡啶-4-基)-1,2,4-惡二唑-3-基)甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-酰胺；REX-W-6：N-((5-(2-甲基吡啶-4-基)-1,3,4-噻二唑-2-基)甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-酰胺；REX-W-7：N-((4-甲基-2-(2-甲基吡啶-4-基)噻唑-5-基)甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-酰胺；REX-W-8：N-((3-(2-甲基吡啶-4-基)-1-氫-吡唑-5-基)甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-酰胺。前述編號為REX-W-1～REX-W-8的化合物，結(jié)構(gòu)式具體如下：本發(fā)明所述的“化合物”，包括所有立體異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體和同位素。本發(fā)明所述的“化合物”，可以是不對稱的，例如，具有一個或多個立體異構(gòu)體。除非另有說明，所有立體異構(gòu)體都包括，如對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體。本發(fā)明中含有不對稱碳原子的化合物，可以光學活性純的形式或外消旋形式被分離出來。光學活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或通過使用手性原料或手性試劑合成。本發(fā)明所述的“化合物”，還包括互變異構(gòu)體形式?；プ儺悩?gòu)體形式來源于一個單鍵與相鄰的雙鍵交換并一起伴隨一個質(zhì)子的遷移。本發(fā)明還包括所有同位素的原子，無論是在中間體或最后的化合物。同位素的原子包括具有相同的原子數(shù)、但不同質(zhì)量數(shù)的。例如，氫的同位素包括氘和氚。含有前述通式結(jié)構(gòu)的化合物，本文中所用的術(shù)語具有如下含義：術(shù)語“鹵素”，指氟、氯、溴或碘，優(yōu)選氟、氯或溴。術(shù)語“氰基”，指-CN。術(shù)語“羥基”，指-OH。術(shù)語“烷基”，指由碳原子和氫原子組成的直鏈或支鏈的飽和烴基團，如 C1-20烷基，優(yōu)選為C1-6烷基，例如甲基、乙基、丙基(包括正丙基和異丙基)、丁基(包括正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基)、戊基(包括正戊基、異戊基、新戊基)、正己基、2-甲基己基等。所述烷基可以是非取代的、或是被一個或多個取代基所取代，取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羥基、羰基、羧基、芳基、雜芳基、氨基、鹵素、磺酰基、亞磺酰基、磷酰基。術(shù)語“氨基”，指-NH2、-NH(烷基)和-N(烷基)2，烷基的含義如前所述。-NH(烷基)的結(jié)構(gòu)形式為具體例子包括但不限于-NHCH3、-NHCH(CH3)2、-NHC2H5等；-N(烷基)2的結(jié)構(gòu)形式為具體例子包括但不限于-N(CH3)2、-N(CH3)C2H5等。術(shù)語“芳基”，指具有完全共軛的π電子體系的全碳單環(huán)或稠合環(huán)，通常具有6-14個碳原子，優(yōu)選具有6-12個碳原子，最優(yōu)選具有6個碳原子。芳基可以是非取代的、或被一個或多個取代基所取代，取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羥基、羰基、羧基、芳基、芳烷基、氨基、鹵素、磺?；?、亞磺?；?、磷?；７侨〈姆蓟膶嵗ǖ幌抻诒交?、萘基和蒽基。術(shù)語“雜環(huán)基”，指具有3-12個(整數(shù))環(huán)原子的單環(huán)或稠合環(huán)，其中有1、2或3個環(huán)原子選自N、O中的一個或多個，其余環(huán)原子為C，且具有完全共軛的π-電子體系。雜環(huán)基可以是飽和的、或非飽和的基團，也可以是非取代的、或被一個或多個取代基所取代，取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羥基、羰基、羧基、芳基、芳烷基、氨基、鹵素、磺?；喕酋；?、磷?；?。非取代的雜環(huán)基的實例包括但不限于吡咯基、吲哚基、吡咯烷基、咪唑基、吡唑基、四唑基、吡啶基、喹啉基、異喹啉基、哌啶基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、呋喃基、吡喃基、嗎啉基。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含如前所述的化合物或其藥學上可接 受的鹽作為活性成份，以及一種或多種藥學上可接受的載體。本發(fā)明所述的“藥物組合物”，指一種或多種本發(fā)明的化合物或其鹽與在本領(lǐng)域中通常接受的用于將生物活性化合物輸送至有機體(例如人)的載體的制劑。藥物組合物的目的是有利于對有機體給藥輸送。術(shù)語“藥學上可接受的載體”，指與活性成份共同給藥的、且有利于活性成份給藥的物質(zhì)，包括但不限于國家食品藥品監(jiān)督管理局許可的可接受的用于人或動物(例如家畜)的任何助流劑、增甜劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、矯味增強劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、崩解劑、助懸劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。例如包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各類淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。本發(fā)明所述的藥物組合物，可配制成固態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)制劑，如片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、膏劑、乳劑、懸浮劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球及氣溶膠等等。本發(fā)明所述的藥物組合物，可以采用本領(lǐng)域熟知的方法制造，如常規(guī)的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣藥丸法、磨細法、乳化法、冷凍干燥法等。本發(fā)明所述的化合物或其藥學上可接受的鹽或其藥物組合物的給藥途徑，包括但不限于口服、直腸、透黏膜、經(jīng)腸給藥，或者局部、經(jīng)皮、吸入、腸胃外、舌下、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)給藥。優(yōu)選的給藥途徑是口服給藥。對于口服給藥，可以通過將活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學上可接受的載體混合，來配制該藥物組合物。這些載體能使本發(fā)明的化合物被配制成片劑、丸劑、錠劑、糖衣劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、漿劑、懸浮劑等，以用于對患者的口服給藥。例如，用于口服給藥的藥物組合物，可采用如下方式獲得片劑： 將活性成分與一種或多種固體載體合并，如果需要將所得混合物制粒，并且如果需要加入少量的賦形劑加工成混合物或顆粒，以形成片劑或片芯。片芯可與任選適合腸溶的包衣材料結(jié)合，加工成更有利于有機體(例如人)吸收的包衣制劑形式。本發(fā)明還提供了一種如前所述的化合物或其藥學上可接受的鹽在制備拮抗Wnt信號通路的藥物中的應(yīng)用。優(yōu)選的，制藥用途為用于治療癌癥，包括非小細胞肺癌、間變性大細胞淋巴瘤、炎性肌纖維母細胞瘤、鼻咽癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、彌漫大B細胞淋巴瘤、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、卵巢癌、全身組織細胞增生癥和神經(jīng)母細胞瘤。本發(fā)明中，發(fā)明人對合成得到的一系列的五元雜環(huán)取代的N-烷基酰胺類WNT通路抑制劑，從分子水平測定Wnt通路STF報告基因的抑制活性，發(fā)現(xiàn)部分化合物對Wnt通路具有顯著的抑制活性；此外，還進行了斑馬魚表型篩選實驗，通過對斑馬魚的剪尾再生抑制試驗和體軸發(fā)育抑制試驗，發(fā)現(xiàn)部分化合物在體內(nèi)的抗腫瘤活性顯著。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的五元雜環(huán)取代的N-烷基酰胺類WNT通路抑制劑，基于靶標的合理藥物設(shè)計，通過基團的取代修飾，獲得了一系列結(jié)構(gòu)新穎的化合物；并結(jié)合STF報告基因?qū)嶒?、斑馬魚表型篩選實驗，優(yōu)化篩選出一系列具有抗腫瘤活性的化合物。因此，可用于開發(fā)成新一代的Wnt通路抑制劑，對于靶向治療或預(yù)防由Wnt通路介導的疾病具有極大的臨床應(yīng)用價值，市場潛力可觀。附圖說明圖1為處理48h后AB型斑馬魚體軸發(fā)育抑制圖圖2為處理48h后AB型斑馬魚體軸發(fā)育抑制量效關(guān)系圖(mean±sd)圖3為處理7dpf后AB型斑馬魚剪尾再生抑制圖圖4為處理7dpf后AB型斑馬魚剪尾再生抑制量效關(guān)系圖(mean±sd)具體實施方式以下是本發(fā)明的具體實施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的描述，但是本發(fā)明的保護范圍并不限于這些實施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明提供的目標化合物制備方法中，液相色譜采用WatersSymmetryC18色譜柱。薄層色譜采用GF254(0.25毫米)。核磁共振色譜(NMR)使用Bruker-400核磁共振儀測定；液質(zhì)連用(LC/MS)使用WatersZQ質(zhì)譜檢測器(柱子：WatersSymmetryC18，毫米，5微米，35℃)，采用ESI(+)離子模式。此外，凡涉及易氧化或易水解的原料的所有操作都在氮氣保護下進行。除非另有說明，本發(fā)明使用的原料都是市售原料、無需進一步純化可以直接使用。實施例1、N-((3-(2-甲基吡啶-4-基)-1,2,4-惡二唑-5-基)甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-酰胺【編號為REX-W-4】的制備合成路線如下：步驟一：化合物1-2的制備分別將化合物1-1(5.0g,36.1mmol)、三甲基鋁正己烷溶液(36.1ml,2N)、四三苯基膦鈀(0.9g，0.7mmol)溶解在100ml干燥的1,4-二氧六環(huán)溶液中，升溫回流4個小時，反應(yīng)結(jié)束后加入1N稀鹽酸淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物1-2(2.5g,57.6％)。MSm/z[ESI]：119.1[M+1]。步驟二：化合物1-3的制備將化合物1-2(2.5g,20.8mmol)、三乙胺(8.6ml,62.4mmol)、鹽酸羥胺(2.9g,41.6mmol)溶解在50ml95％的乙醇中，回流條件下攪拌2小時，反應(yīng)結(jié)束后濃縮出去乙醇，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物1-3(2.9g,93.4％)。MSm/z[ESI]：152.1[M+1]。步驟三：化合物1-4的制備分別將化合物1-3(2.9g,19.4mmol)、BOC-甘氨酸(3.4g,19.4mmol)、N,N-二異丙基乙胺(10.1ml,58.2mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(8.8g,23.3mmol)溶解在100ml干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，升溫至100℃攪拌過夜，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水150ml淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物1-4(2.9g,52.1％)。MSm/z[ESI]：291.1[M+1]。步驟四：化合物1-5的制備將化合物1-4(2.9g,10.1mmol)溶解在50ml干燥的二氯甲烷中，緩慢加 入三氟乙酸10.0ml,室溫攪拌2小時，反應(yīng)結(jié)束后濃縮，用硅膠柱提純，得到化合物1-5(1.8g，95.2％)。MSm/z[ESI]：191.1[M+1]。步驟五：化合物REX-W-4的制備分別將化合物1-5(1.8g,9.6mmol)、4-苯基苯甲酸(1.9g,9.6mmol)、N,N-二異丙基乙胺(5.0ml,28.8mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(4.4g,11.5mmol)溶解在50ml干燥的二甲亞砜中，室溫攪拌2小時，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水200ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到目標化合物REX-W-4(1.3g,35.9％)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.47(t,J＝5.6Hz,1H),8.66(d,J＝5.2Hz,1H),8.01(d,J＝8.0Hz,2H),7.79-7.84(m,3H),7.71-7.77(m,3H),7.48-7.54(m,2H),7.39-7.45(m,1H),4.87(d,J＝5.6Hz,2H),2.57(s,3H).實施例2、N-((5-(2-甲基吡啶-4-基)-1,2,4-惡二唑-3-基)甲基)-[1,1'-聯(lián)苯]-4-酰胺【編號為REX-W-5】的制備合成路線如下：步驟一：化合物1-2的制備分別將鹽酸羥胺(2.7g,38.4mmol)、碳酸鈉(10.6g,96.0mmol)溶解在100ml水中，冰浴條件下將化合物1-1(5.0g,32.0mmol)滴加到體系中并攪拌 4小時，反應(yīng)結(jié)束后用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物1-2(4.0g,66.0％)。MSm/z[ESI]：190.1[M+1]。步驟二：化合物1-3的制備分別將化合物1-2(4.0g,21.1mmol)、2-甲基吡啶-4-甲酸(2.9g,21.1mmol)、N,N-二異丙基乙胺(11.0ml,63.3mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(9.7g,11.5mmol)溶解在150ml干燥的二甲亞砜中，室溫攪拌2小時，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水200ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物1-3(1.1g,19.6％)。MSm/z[ESI]：291.1[M+1]。步驟三：化合物1-4的制備將化合物1-3(1.1g,3.8mmol)溶解在30ml干燥的二氯甲烷中，緩慢加入三氟乙酸10.0ml,室溫攪拌2小時，反應(yīng)結(jié)束后濃縮，用硅膠柱提純，得到化合物1-5(1.8g，91.8％)。MSm/z[ESI]：191.1[M+1]。步驟四：化合物REX-W-5的制備分別將化合物1-5(1.8g,3.5mmol)、4-苯基苯甲酸(0.8g,4.2mmol)、N,N-二異丙基乙胺(1.8ml,10.5mmol)、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.6g,4.2mmol)溶解在50ml干燥的二甲亞砜中，室溫攪拌2小時，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水100ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物REX-W-5(235.7mg,18.2％)。MSm/z[ESI]：371.1[M+1]。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6):δ＝9.29(t,J＝6.0Hz,1H),8.76(d,J＝5.2 Hz,1H),7.96-8.03(m,3H),7.85-7.89(m,1H),7.79-7.83(m,2H),7.73-7.77(m,2H),7.48-7.53(m,2H),7.40-7.45(m,1H),4.73(d,J＝6.0Hz,2H),2.63(s,3H).實施例3斑馬魚表型篩選實驗斑馬魚是一種脊椎動物，與人類基因組同源性高達85％，與人類有近似的組織器官功能和信號傳導通路，并且具有產(chǎn)卵量高、發(fā)育迅速、胚胎透明等獨特優(yōu)勢，使得斑馬魚成功地應(yīng)用于人類疾病研究和活體藥物高通量篩選。Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物，是一類在進化過程中高度保守的信號通路，參與生物體內(nèi)調(diào)控有關(guān)細胞生長、凋亡、自我更新和生存基因的表達，維持生物體中正常的胚胎發(fā)育和組織修復(fù)再生等生理功能(WolframGoessling,TristaE.North,SabineLoewer,etal.(2009).GeneticInteractionofPGE2andWntSignalingRegulatesDevelopmentalSpecificationofStemCellsandRegeneration.Cell,136(6):1136-1147.)。Wnt信號通路失調(diào)與癌癥發(fā)生也密切相關(guān)，例如80％～90％的結(jié)直腸癌中都含有影響Wnt信號通路基因AdenomatousPolyposisColi(APC)功能突變(HansClevers,RoelNusse.(2012).Wnt/β-CateninSignalingandDisease.Cell,149(6):1192-1205.)。研究表明，斑馬魚在體軸發(fā)育和再生修復(fù)方面的表型與Wnt信號通路密切相關(guān)(XiaoleiWang,JesungMoon,MichaelE.Dodge,etal.(2013).TheDevelopmentofHighlyPotentInhibitorsforPorcupine.JournalofMedicinalChemistry,56,2700-2007.)。因此，利用Wnt信號通路的在不同物種間的保守性以及斑馬魚表型篩選方面的優(yōu)勢，我們考察化合物對正常AB型斑馬魚體軸發(fā)育和再生修復(fù)的影響，來 探討化合物在體內(nèi)抗Wnt信號通路活性的強弱。實驗(一)化合物對AB型斑馬魚體軸發(fā)育抑制試驗方法：選取3hpf(hourspostfertilization)的AB型斑馬魚魚卵進行體軸發(fā)育表型試驗，按受試終濃度在100μM～0.001μM范圍內(nèi)給藥組以及溶劑對照組進行隨機分組，每組20個AB魚卵加至6孔板內(nèi)，每孔3mL魚水，DMSO濃度≤1％(v/v)。加藥處理后的AB魚卵至于28.5℃生化培養(yǎng)箱孵育至48hpf時進行圖像采集，利用NIS-ElementsD3.1軟件分析測量各組幼魚體軸長度px值(pixels)。根據(jù)不同濃度化合物對各組幼魚體軸發(fā)育生長的抑制率，運用GraphPadPrism6.0進行非線性擬合計算各化合物在AB型斑馬魚體軸發(fā)育上的IC50值。計算公式為；結(jié)果：本發(fā)明實施例制備的REX-W-4等一系列化合物，對AB型斑馬魚體軸發(fā)育抑制的活性測定結(jié)果見表一；REX-W-4處理AB型斑馬魚48hpf后體軸發(fā)育抑制狀態(tài)見圖1，量效關(guān)系(mean±sd)見圖2。表一實施例化合物對AB型斑馬魚體軸發(fā)育抑制的活性測定CompoundsIC50(μM)Emax(％)LGK-974(對照藥)0.583197.1REX-W-40.360593.0REX-W-53.4272.9注：IC50為計算50％抑制率濃度，Emax為最大抑制率進一步的，本發(fā)明選擇化合物REX-W-4進行斑馬魚剪尾再生表型試驗復(fù)驗。實驗(二)化合物對AB型斑馬魚剪尾再生抑制試驗選取3dpf(dayspostfertilization)的AB型斑馬魚幼魚進行剪尾鰭造模處理， 按受試終濃度在10μM～0.001μM范圍內(nèi)給藥組以及溶劑對照組進行隨機分組，每組15個幼魚加至6孔板內(nèi)，每孔3mL魚水，DMSO濃度≤1％(v/v)。加藥處理后的AB魚卵至于28.5℃生化培養(yǎng)箱孵育至7dpf時進行圖像采集，利用NIS-ElementsD3.1軟件分析測量各組幼魚尾鰭再生長度px值(pixels)。根據(jù)不同濃度化合物對各組幼魚尾鰭再生的抑制率，運用GraphPadPrism6.0進行非線性擬合計算各化合物在AB型斑馬魚剪尾再生上的IC50值。計算公式為；結(jié)果：本發(fā)明實施例制備的REX-W-4化合物，對AB型斑馬魚剪尾再生抑制的活性測定結(jié)果見表二；REX-W-4處理3dpf剪尾造模AB型斑馬魚至7dpf尾鰭再生抑制見圖3，量效關(guān)系(mean±sd)見圖4。表二實施例化合物對AB型斑馬魚剪尾再生抑制的活性測定CompoundsIC50(μM)Emax(％)LGK-974(對照藥)0.462492.8REX-W-40.077393.5實施例4Super-Top-Flash(STF)報告基因試驗化合物LGK-974(對照藥)、REX-W-4等一系列化合物(實施例)采用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染STF報告基因的HEK293T-STF細胞株同L-Wnt3a分泌細胞株共培養(yǎng)方式測定其對Wnt信號通路的抑制活性，該活性采用IC50這一指標來表示，IC50即STF報告基因表達的Luciferase活性被抑制50％時的化合物的濃度。本發(fā)明實施例制備的REX-W-4等一系列化合物，利用CrownBio公司的Wnt報告基因平臺進行測定，測定結(jié)果見表三。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的化合物從分子水平上有較好的Wnt信號通路抑制活性。表三實施例化合物對Wnt通路STF報告基因抑制的活性測定CompoundsIC50(nM)LGK-974(對照藥)0.65REX-W-43.0REX-W-529.37當前第1頁1 2 3