本發(fā)明涉及調(diào)節(jié)蛋白激酶活性、且用于預(yù)防和治療與蛋白激酶相關(guān)疾病的化合物。具體而言，本發(fā)明涉及一種用于治療腫瘤的大環(huán)衍生物，屬于調(diào)節(jié)間變性淋巴瘤激酶(ALK)活性的化合物，并提供了該類化合物的制備方法，及該類化合物用于預(yù)防或治療與ALK相關(guān)的疾病的制藥用途。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤是一種嚴(yán)重威脅人類健康的常見病和多發(fā)病，其特點(diǎn)是細(xì)胞或變異細(xì)胞異常增殖。腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等與細(xì)胞內(nèi)外的一系列信號傳導(dǎo)通路中某個(gè)環(huán)節(jié)出現(xiàn)異常密切相關(guān)。在這些信號傳導(dǎo)途徑中，一類重要的分子就是蛋白激酶，蛋白激酶的異常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)，也是導(dǎo)致一系列其它與炎癥或增殖反應(yīng)有關(guān)的人類疾病的主要原因；開發(fā)靶向蛋白激酶的藥物是治療相關(guān)疾病的主要手段，已有很多藥物獲批上市，這類藥物具有靶點(diǎn)清晰、療效明確、安全性高的特點(diǎn)，因此越來越受到臨床醫(yī)療實(shí)踐的認(rèn)可和支持。間變性淋巴瘤激酶(ALK)是蛋白激酶家族的重要成員，現(xiàn)有研究表明ALK的過度表達(dá)、突變和融合蛋白與多種腫瘤直接相關(guān)，包括但不限于成神經(jīng)細(xì)胞瘤、間變性大細(xì)胞淋巴瘤(ALCL)、非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)和炎性肌纖維母細(xì)胞瘤(IMT)等等。針對ALK融合基因的第一代藥物克唑替尼(Crizotinib)及第二代藥物色瑞替尼(Ceritinib)已分別于2011年和2014年上市，用于ALK陽性肺癌患者的治療獲得顯著的無進(jìn)展生存和客觀有效率，證實(shí)了該靶點(diǎn)明確的臨床價(jià)值。盡管藥效顯著，由于腫瘤異質(zhì)性特點(diǎn)及腫瘤細(xì)胞對環(huán)境壓力的適應(yīng)，有越來越多的研究報(bào)道表明，腫瘤耐藥、疾病繼續(xù)發(fā)展幾乎依舊是此類患者必然的命運(yùn)；此外，現(xiàn)有藥物的嚴(yán)重不良反應(yīng)，如消化道不良反應(yīng)發(fā)生率過高、肝臟毒性及QT間期延長等問題，也限制了該類藥物的應(yīng)用。有鑒于此，繼續(xù)研制具有良好ALK抑制活性及安全性的新化合物并將其開發(fā)上市以應(yīng)對上述問題具有重要的社會效益和價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明目的在于提供一種結(jié)構(gòu)新穎的用于治療腫瘤的大環(huán)衍生物，通過基團(tuán)的取代修飾，合成并篩選出一系列具有抗腫瘤活性的化合物。為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：一種用于治療腫瘤的大環(huán)衍生物，為具有如下結(jié)構(gòu)通式的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽：其中，環(huán)A選自含有1-3個(gè)N原子的五元雜環(huán)；X、Y各自獨(dú)立地選自共價(jià)鍵、-O-、-S-、-NR5-、-CR6R7-、-CO-、-SO2-、-CONR5-、-SO2NR5-中的一種或幾種，且X和Y各不相同；n選自0～5中的任一整數(shù)值；R1選自中的一種；R2、R3各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、C1-6環(huán)烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、氰基、氨基中的一種或幾種；R4選自C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、氨基、羥基、酰胺基、磺胺基、芳基、雜環(huán)基中的一種或幾種；R5選自氫、C1-6烷基、羰基、C1-6烷羰基、C3-6環(huán)烷基中的一種；R6、R7各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、羥基、氰基、芳基、雜環(huán)基中的一種或幾種；R8選自氫、C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、?；⒒腔?、芳基、雜環(huán)基中的一種或幾種；R9選自氫、鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、C1-6環(huán)烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、羥基、羰基、氰基、氨基中的一種或幾種；雜環(huán)基為選自N、O雜原子的3-12元雜環(huán)。優(yōu)選的，為任一具有如下結(jié)構(gòu)通式的化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽：其中，X、Y各自獨(dú)立地選自共價(jià)鍵、-O-、-S-、-NR5-、-CR6R7-、-CO-、-SO2-、-CONR5-、-SO2NR5-中的一種或幾種，且X和Y各不相同；n選自0～5中的任一整數(shù)值；P、Q各自獨(dú)立地選自CR5、N；R1選自中的一種；R2、R3各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、C1-6環(huán)烷氧基、氰基、氨基、C1-6烷基取代的氨基、C3-6環(huán)烷取代的氨基中的一種；R4選自C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、氨基、羥基、芳基、雜環(huán)基中的一種或幾種；R5選自氫、C1-6烷基、羰基、C1-6烷羰基、C3-6環(huán)烷基中的一種；R6、R7各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、羥基、氰基、芳基、雜環(huán)基中的一種或幾種；R8選自氫、C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、酰基、磺基、芳基、雜環(huán)基中的一種或幾種；R9選自氫、鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、C1-6環(huán)烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、羥基、羰基、氰基、氨基中的一種或幾種；雜環(huán)基為選自N、O雜原子的3-12元雜環(huán)。更優(yōu)選的，當(dāng)為結(jié)構(gòu)通式(2)或(3)或(4)時(shí)，X、Y各自獨(dú)立地選自共價(jià)鍵、-O-、-S-、-NR5-、-CR6R7-、-CO-、-SO2-、-CONR5-、-SO2NR5-中的一種，且X和Y各不相同；n選自0～5中的任一整數(shù)值；P、Q各自獨(dú)立地選自CR5、N中的一種；R1選自中的一種；R2、R3各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基、氰基、C1-6環(huán)烷基酰胺基中的一種；R4選自C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、氨基、羥基中的一種或幾種；R5選自氫、C1-6烷基中的一種；R6、R7各自獨(dú)立地選自氫、鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、羥基、苯基、雜環(huán)基中的一種；R8選自氫、C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、酰胺基、磺胺基、苯基、雜環(huán)基中的一種；R9選自氫、鹵素、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基、C1-6烷氧基、鹵代C1-6烷氧基、羥基、氰基、氨基中的一種或幾種；雜環(huán)基為選自N、O雜原子的3-6元雜環(huán)。優(yōu)選的，前述的大環(huán)衍生物通式結(jié)構(gòu)(1)或(2)或(3)或(4)中，芳基為苯基、萘基或蒽基；雜環(huán)基為嗎啉基、哌啶基、吡啶基、嘧啶基、吡喃基、噻吩基、呋喃基、吡咯基、吡唑基、咪唑基或噻唑基。優(yōu)選的，前述的大環(huán)衍生物通式結(jié)構(gòu)(1)或(2)或(3)或(4)中，鹵素為氟、氯、溴、碘中的一種。用于治療腫瘤的大環(huán)衍生物，選自如下編號為REX-MA-1～REX-MA-24的列表化合物：上述列表化合物，其結(jié)構(gòu)式具體如下：本發(fā)明還提供了一種化合物為如前所述的結(jié)構(gòu)通式(2)或(3)或(4)的合成方法，總反應(yīng)路線如下：通式(2)：通式(3)：通式(4)：基于上述總反應(yīng)路線，包括如下合成方案：(1)合成方案一：化合物2-3或3-3或4-3的合成(即化合物2-1或3-1或4-1)和(即化合物2-2)或(即化合物3-2)或(即化合物4-2)溶解于有機(jī)溶劑，加入堿，高溫溫反應(yīng)N小時(shí)后，加淬滅劑，萃取、干燥、減壓、旋干，純化得到化合物1-3。合成方案一中，有機(jī)溶劑選自二甲亞砜、N,N-二甲基甲酰胺、異丙醇、正丁醇、叔丁醇中的一種或幾種；堿選自三乙胺、吡啶、二異丙基胺、N,N-二異丙基乙胺、1,8-二氮雜二環(huán)十一碳-7-烯中的一種或幾種；萃取劑選自二氯甲烷、純水、乙酸乙酯中的一種或幾種。合成方案一中，高溫反應(yīng)的溫度為90-120℃，反應(yīng)時(shí)間N為5-10小時(shí)。(2)合成方案二：目標(biāo)化合物(2)或(3)或(4)的合成將(即化合物2-3)或(即化合物3-3)或(即化合物4-3)和(即化合物2-4或3-4或4-4)溶解于有機(jī)溶劑，緩慢加入配體和堿，氮?dú)庵脫Q、再加入催化劑，加熱反應(yīng)N小時(shí)后，加淬滅劑，萃取、干燥、減壓、旋干，純化得到目標(biāo)化合物(2)或(3)或(4)。合成方案二中，有機(jī)溶劑選自二甲亞砜、N,N-二甲基甲酰胺、甲苯、二氧六環(huán)、乙二醇二甲醚中的一種或幾種；配體選自三叔丁基膦、4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽、2-二環(huán)己基膦-2',6'-二甲氧基聯(lián)苯、2-雙環(huán)己基膦-2',4',6'-三異丙基聯(lián)苯、2-二叔丁基膦-2'-(N,N-二甲胺基)-聯(lián)苯中的一種或幾種；堿選自碳酸鈉、碳酸鉀、磷酸鉀、醋酸鉀、碳酸銫、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀中的一種或幾種；催化劑選自醋酸鈀、二氯化鈀、雙三苯基磷二氯化鈀、四(三苯基膦)鈀、雙(二亞芐基丙酮)鈀、三(二亞芐基丙酮)二鈀中的一種或幾種；萃取劑選自二氯甲烷、純水、乙酸乙酯中的一種或幾種。合成方案二中，加熱反應(yīng)的溫度為90-120℃，反應(yīng)時(shí)間N為16-24小時(shí)。本合成路線中，X、Y、P、Q、n、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8的定義均如前所述。本發(fā)明所述的“化合物”，包括所有立體異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、互變異構(gòu)體和同位素。本發(fā)明所述的“化合物”，可以是不對稱的，例如，具有一個(gè)或多個(gè)立體異構(gòu)體。除非另有說明，所有立體異構(gòu)體都包括，如對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體。本發(fā)明中含有不對稱碳原子的化合物，可以光學(xué)活性純的形式或外消旋形式被分離出來。光學(xué)活性純的形式可以從外消旋混合物拆分，或通過使用手性原料或手性試劑合成。本發(fā)明所述的“化合物”，還包括互變異構(gòu)體形式?；プ儺悩?gòu)體形式來源于一個(gè)單鍵與相鄰的雙鍵交換并一起伴隨一個(gè)質(zhì)子的遷移。本發(fā)明還包括所有同位素的原子，無論是在中間體或最后的化合物。同位素的原子包括具有相同的原子數(shù)、但不同質(zhì)量數(shù)的。例如，氫的同位素包括氘和氚。含有前述通式結(jié)構(gòu)的化合物，本文中所用的術(shù)語具有如下含義：術(shù)語“鹵素”，指氟、氯、溴或碘，優(yōu)選氟、氯或溴。術(shù)語“氰基”，指-CN。術(shù)語“羥基”，指-OH。術(shù)語“烷基”，指由碳原子和氫原子組成的直鏈或支鏈的飽和烴基團(tuán)，如C1-20烷基，優(yōu)選為C1-6烷基，例如甲基、乙基、丙基(包括正丙基和異丙基)、丁基(包括正丁基、異丁基、仲丁基或叔丁基)、戊基(包括正戊基、異戊基、新戊基)、正己基、2-甲基己基等。所述烷基可以是非取代的、或是被一個(gè)或多個(gè)取代基所取代，取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羥基、羰基、羧基、芳基、雜芳基、氨基、鹵素、磺?；?、亞磺?；?、磷?；?。術(shù)語“氨基”，指-NH2、-NH(烷基)和-N(烷基)2，烷基的含義如前所述。-NH(烷基)的結(jié)構(gòu)形式為具體例子包括但不限于-NHCH3、-NHCH(CH3)2、-NHC2H5等；-N(烷基)2的結(jié)構(gòu)形式為具體例子包括但不限于-N(CH3)2、-N(CH3)C2H5等。術(shù)語“芳基”，指具有完全共軛的π電子體系的全碳單環(huán)或稠合環(huán)，通常具有6-14個(gè)碳原子，優(yōu)選具有6-12個(gè)碳原子，最優(yōu)選具有6個(gè)碳原子。芳基可以是非取代的、或被一個(gè)或多個(gè)取代基所取代，取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羥基、羰基、羧基、芳基、芳烷基、氨基、鹵素、磺?；喕酋；⒘柞；?。非取代的芳基的實(shí)例包括但不限于苯基、萘基和蒽基。術(shù)語“雜環(huán)基”，指具有3-12個(gè)(整數(shù))環(huán)原子的單環(huán)或稠合環(huán)，其中有1、2或3個(gè)環(huán)原子選自N、O、S中的一個(gè)或多個(gè)，其余環(huán)原子為C，且具有完全共軛的π-電子體系。雜環(huán)基可以是飽和的、或非飽和的基團(tuán)，也可以是非取代的、或被一個(gè)或多個(gè)取代基所取代，取代基包括但不限于烷基、烷氧基、氰基、羥基、羰基、羧基、芳基、芳烷基、氨基、鹵素、磺?；?、亞磺?；?、磷?；７侨〈碾s環(huán)基的實(shí)例包括但不限于吡咯基、吲哚基、吡咯烷基、咪唑基、吡唑基、四唑基、吡啶基、喹啉基、異喹啉基、哌啶基、嘧啶基、吡嗪基、哌嗪基、呋喃基、吡喃基、嗎啉基。術(shù)語“共價(jià)鍵”，指原子間通過共用電子對所形成的相互作用。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，包含如前所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽作為活性成份，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。本發(fā)明所述的“藥物組合物”，指一種或多種本發(fā)明的化合物或其鹽與在本領(lǐng)域中通常接受的用于將生物活性化合物輸送至有機(jī)體(例如人)的載體的制劑。藥物組合物的目的是有利于對有機(jī)體給藥輸送。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”，指與活性成份共同給藥的、且有利于活性成份給藥的物質(zhì)，包括但不限于國家食品藥品監(jiān)督管理局許可的可接受的用于人或動物(例如家畜)的任何助流劑、增甜劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、矯味增強(qiáng)劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、崩解劑、助懸劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。例如包括但不限于碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖和各類淀粉、纖維素衍生物、明膠、植物油和聚乙二醇。本發(fā)明所述的藥物組合物，可配制成固態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)制劑，如片劑、丸劑、膠囊劑、粉劑、顆粒劑、膏劑、乳劑、懸浮劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸入劑、凝膠劑、微球及氣溶膠等等。本發(fā)明所述的藥物組合物，可以采用本領(lǐng)域熟知的方法制造，如常規(guī)的混合法、溶解法、制粒法、制糖衣藥丸法、磨細(xì)法、乳化法、冷凍干燥法等。本發(fā)明所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽或其藥物組合物的給藥途徑，包括但不限于口服、直腸、透黏膜、經(jīng)腸給藥，或者局部、經(jīng)皮、吸入、腸胃外、舌下、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)給藥。優(yōu)選的給藥途徑是口服給藥。對于口服給藥，可以通過將活性化合物與本領(lǐng)域熟知的藥學(xué)上可接受的載體混合，來配制該藥物組合物。這些載體能使本發(fā)明的化合物被配制成片劑、丸劑、錠劑、糖衣劑、膠囊劑、液體、凝膠劑、漿劑、懸浮劑等，以用于對患者的口服給藥。例如，用于口服給藥的藥物組合物，可采用如下方式獲得片劑：將活性成分與一種或多種固體載體合并，如果需要將所得混合物制粒，并且如果需要加入少量的賦形劑加工成混合物或顆粒，以形成片劑或片芯。片芯可與任選適合腸溶的包衣材料結(jié)合，加工成更有利于有機(jī)體(例如人)吸收的包衣制劑形式。本發(fā)明還提供了一種如前所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療或預(yù)防與蛋白激酶相關(guān)的疾病的藥物中的用途。一種如前所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備用于治療或預(yù)防與間變性淋巴瘤激酶(ALK激酶)相關(guān)的疾病的藥物中的用途。優(yōu)選的，前述與ALK激酶相關(guān)的疾病選自細(xì)胞增殖性疾病，優(yōu)選腫瘤。優(yōu)選的，前述細(xì)胞增殖性疾病包括非小細(xì)胞肺癌、間變性大細(xì)胞淋巴瘤、炎性肌纖維母細(xì)胞瘤、鼻咽癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌、彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤、肝癌、胃癌、食道癌、胰腺癌、卵巢癌、全身組織細(xì)胞增生癥和神經(jīng)母細(xì)胞瘤。本發(fā)明中，發(fā)明人對合成得到的一系列的大環(huán)衍生物化合物，進(jìn)行ALK激酶抑制活性及ALK相關(guān)突變位點(diǎn)的結(jié)合率測定實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)部分化合物對ALK表現(xiàn)出較高的抑制活性，對ALK突變位點(diǎn)(如L1196M)表現(xiàn)出較好的結(jié)合率，對ROS1也具有顯著的抑制活性；此外，還進(jìn)行了淋巴癌、肺癌細(xì)胞株的細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和斑馬魚表型篩選實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)部分化合物在體內(nèi)的抗腫瘤活性顯著。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的用于治療腫瘤的大環(huán)衍生物，基于靶標(biāo)的合理藥物設(shè)計(jì)，通過基團(tuán)的取代修飾，獲得了一系列結(jié)構(gòu)新穎的化合物；并結(jié)合激酶活性實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、斑馬魚表型篩選實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化篩選出一系列具有抗腫瘤活性的化合物。因此，可用于開發(fā)成新一代的蛋白激酶抑制劑，對于靶向治療或預(yù)防由ALK介導(dǎo)的疾病具有極大的臨床應(yīng)用價(jià)值，市場潛力可觀。附圖說明圖1為Albino斑馬魚虹膜色素細(xì)胞在脊背上的分布圖圖2為REX-C1/REX-C3對斑馬魚虹膜色素細(xì)胞影響的量效關(guān)系圖(mean±sem)圖3為REX-C1/REX-C3對斑馬魚虹膜色素細(xì)胞的影響圖具體實(shí)施方式以下是本發(fā)明的具體實(shí)施例，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的描述，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍并不限于這些實(shí)施例。凡是不背離本發(fā)明構(gòu)思的改變或等同替代均包括在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明提供的目標(biāo)化合物制備方法中，液相色譜采用WatersSymmetryC18色譜柱。薄層色譜采用GF254(0.25毫米)。核磁共振色譜(NMR)使用Bruker-400核磁共振儀測定；液質(zhì)連用(LC/MS)使用WatersZQ質(zhì)譜檢測器(柱子：WatersSymmetryC18，毫米，5微米，35℃)，采用ESI(+)離子模式。此外，凡涉及易氧化或易水解的原料的所有操作都在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。除非另有說明，本發(fā)明使用的原料都是市售原料、無需進(jìn)一步純化可以直接使用。實(shí)施例一、【編號為REX-MA-2】的制備合成路線如下：合成方案一：中間體1-3的合成步驟一：化合物1-2的制備將化合物1-1(20.0g,328.0mmol)溶解在2.0L1,4-二氧六環(huán)和水的混合溶劑中(1,4-二氧六環(huán)：水＝10：1)，加入氫氧化鈉(20.0g,328.0mmol)，在冰水浴中滴加而碳酸二叔丁酯(77.0g,354.0mmol)，反應(yīng)體系在0℃攪拌2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入2.0L飽和硫酸氫鈉溶液，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物1-2(45.4g,86.0％)。MSm/z[ESI]：162.1[M+1]。步驟二：化合物1-3的制備將化合物1-2(24.6g,152.7mmol)溶解在1.5L二氯甲烷中，在冰水浴中分別滴加三乙胺(42.7ml,305.4mmol)、對甲苯磺酰氯(44.3g,229.1mmol)，移去冰水浴，室溫?cái)嚢?小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水1.0L，用二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物1-3(39.9g,83.0％)。MSm/z[ESI]：316.1[M+1]。合成方案二：中間體2-7的合成步驟一：化合物2-2的制備將化合物2-1(10.0g,88.0mmol)溶解在150ml四氫呋喃中，在冰水浴中分別滴加氫化鈉(5.8g,96.0mmol)，移去冰水浴，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水200ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物2-2(15.2g,71.0％)。MSm/z[ESI]：244.1[M+1]。步驟二：化合物2-3的制備將化合物2-2(15.2g,62.3mmol)和N-氯代丁二酰亞胺(9.9g,74.5mmol)溶解在300ml干燥的四氫呋喃溶液中，在-78℃條件下滴加二(三甲基硅基)氨基鋰(98.8ml，1.0M)，滴加完畢再次溫度下繼續(xù)攪拌兩小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水200ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物2-3(16.9g，97.0％)。MSm/z[ESI]：278.1[M+1]。步驟三：化合物2-4的制備將化合物2-3(16.9g，61.3mmol)溶解在300ml二甲亞砜溶液中，氮?dú)鈼l件下分別加入異丙基亞磺酸鈉(15.7g,120.2mmol)，四甲基乙二胺(1.7g，19.5mmol)，三氟甲磺酸銅(3.9g,10.8mmol)，反應(yīng)體系在80℃條件下攪拌12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水300ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物2-4(15.6g，73.0％)。MSm/z[ESI]：350.1[M+1]。步驟四：化合物2-5的制備將化合物2-4(12.2g，36.0mmol)溶解在300ml乙醇和水的混合溶液中(乙醇:水＝1.6:1)，分別加入氯化銨(7.5g，72.1mmol)，鐵粉(47.1g，72.1mmol)，反應(yīng)體系在65℃條件下攪拌2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水500ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物2-5(10.1g,88.0％)。MSm/z[ESI]：320.1[M+1]。步驟五：化合物2-6的制備將化合物2-5(9.4g，29.5mmol)溶解在鹽酸甲醇溶液中(200ml，4M)，室溫條件下攪拌12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH到8左右，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純得到化合物2-6(7.8g,88.0％)。MSm/z[ESI]：226.0[M+1]。步驟六：化合物2-7的制備將化合物2-6(3.4g，15.1mmol)溶解在150mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，0℃條件下加入碳酸鉀(3.0g,21.6mmol)，在該溫度下繼續(xù)攪拌45分鐘，緩慢加入化合物1-3(6.8g,21.6mmol)，90℃條件下攪拌12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水150ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物2-7(1.7g,33.0％)。MSm/z[ESI]：333.2[M+1]。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.01(s,1H),4.75(m,1H),4.20(m,2H),3.87(s,2H),3.56(m,2H),3.35(m,1H),1.50(s,9H),1.43(d,J＝7.2Hz,6H).合成方案三：中間體3-6的合成步驟一：化合物3-2的制備將化合物3-1(9.3g,53.3mmol)溶解在100ml濃硫酸中，在冰水浴中分別滴濃硝酸(3.5g,44.5mmol)，滴加完畢反應(yīng)在0-10℃條件下攪拌2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水0.5L，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物3-2(11.7g,99.0％)。MSm/z[ESI]：219.9[M+1]。步驟二：化合物3-3的制備將化合物3-2(11.7g,53.4mmol)和碳酸銫(69.5g，213.2mmol)溶解在200ml干燥的異丙醇中，將反應(yīng)體系在50℃條件下攪拌14小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水0.5L，用1N的鹽酸將體系pH調(diào)到3左右，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物3-3(10.7g,77.3％)。MSm/z[ESI]：260.0[M+1]。步驟三：化合物3-4的制備將化合物3-3(10.7g,41.4mmol)溶解在200ml干燥的甲醇中，室溫氮?dú)鈼l件下緩慢滴加濃硫酸(2.3ml)，滴加完畢將反應(yīng)在83℃條件下攪拌18小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入飽和碳酸氫鈉溶液100ml,加入冰水0.5L，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物3-4(10.7g,95.0％)。MSm/z[ESI]：274.0[M+1]。步驟四：化合物3-5的制備將化合物3-4(10.7g,39.2mmol)溶解在300ml1,4-二氧六環(huán)和水的混合溶劑中(1,4-二氧六環(huán)：水＝3：1)，室溫氮?dú)鈼l件下分別加入磷酸鉀(16.6g,78.2mmol)，1-甲基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-硼酸頻哪醇酯(8.7g,39.1mmol)，[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物(3.2g,3.9mmol)，加料完畢將反應(yīng)體系在105℃條件下反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水0.5L，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物3-5(5.0g,38.6％)。MSm/z[ESI]：335.2[M+1]。步驟五：化合物3-6的制備將化合物3-5(5.0g,15.0mmol)溶解在200ml甲醇中，室溫氫氣條件下加入鈀碳(2.5g,水含量58.8％)，加料完畢將反應(yīng)體系在常溫一個(gè)大氣壓的氫氣條件下反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用硅藻土過濾，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物3-6(4.1g,89.0％)。MSm/z[ESI]：307.2[M+1]。1HNMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.24(s,1H),6.82(s,1H),4.64-4.57(m,1H),3.84(s,3H),3.75(m,2H),3.53-3.45(m,1H),3.02-2.99(d,2H,J＝11.6Hz),2.36(s,3H),2.18-2.12(m,2H),1.86-1.73(m,4H),1.37-1.35(d,6H,J＝6.0Hz).合成方案四：REX-MA-2的合成步驟一：化合物4-2的制備將化合物4-1(2.2g,12.0mmol)和化合物2-7(2.0g,6.0mmol)溶解在60ml干燥的異丙醇中，加入N，N–二異丙基乙胺(4.1ml，24.0mmol)，加料完畢將反應(yīng)體系在95℃條件下攪拌6小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水200ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物4-2(5.1g,89.0％)。MSm/z[ESI]：479.1[M+1]。步驟二：化合物4-3的制備將化合物4-2(2.6g,5.3mmol)和化合物3-7(1.8g,5.8mmol)溶解在60ml干燥的1,4-二氧六環(huán)中，在氮?dú)鈼l件下分別加入醋酸鈀(119.0mg,0.5mmol)，4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽(613.3mg,1.1mmol)，磷酸鉀(2.3g,10.6mmol)，加料完畢將反應(yīng)體系在100℃條件下攪拌16小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水100ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物4-3(2.3g,59.0％)。MSm/z[ESI]：749.3[M+1]。步驟三：化合物4-4的制備將化合物4-3(2.3g,3.1mmol)溶解在60ml1,4-二氧六環(huán)和水的混合溶劑中(1，4-二氧六環(huán):水＝1:1)，在氮?dú)鈼l件下加入氫氧化鈉(496.0mg，12.4mmol)，加料完畢將反應(yīng)體系在90℃條件下攪拌2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后濃縮除去有機(jī)溶劑，向體系中加入冰水30ml，用1N的鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系pH到3左右，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后得到的產(chǎn)物不經(jīng)提純直接投入到下一步反應(yīng)。MSm/z[ESI]：735.3[M+1]。步驟四：化合物4-5的制備將化合物4-4(未提純)溶解在30ml甲醇中，在氮?dú)鈼l件下加入鹽酸1,4-二氧六環(huán)溶液(30ml,4.0M)，加料完畢將反應(yīng)體系在40℃條件下攪拌3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后濃縮除去有機(jī)溶劑，向體系中加入無水乙腈30ml，濃縮后得到的產(chǎn)物不經(jīng)提純直接投入到下一步反應(yīng)。MSm/z[ESI]：635.3[M+1]。步驟五：化合物REX-MA-2的制備將化合物4-5(未提純)溶解在30ml干燥的N，N–二甲基甲酰胺中，在氮?dú)鈼l件下分別加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.8g,4.6mmol)，N，N–二異丙基乙胺(5.3ml,31.0mmol)，加料完畢將反應(yīng)體系在室溫條件下攪拌24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入冰水60ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物REX-MA-2(305.6mg,經(jīng)步驟三、四、五三步反應(yīng)后收率為16.0％)。MSm/z[ESI]：617.2[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.94(s,1H),8.33(s,1H),8.16(s,1H),8.09(s,1H),7.84(s,1H),7.05(s,1H),6.40(s,1H),4.92–4.71(m,1H),4.47(s,2H),3.73(s,2H),3.58–3.34(m,5H),2.90–2.63(m,6H),2.50(d,J＝12.8Hz,3H),1.41-1.24(m,8H),0.87(s,3H).實(shí)施例二、【編號為REX-MA-5】的制備合成路線如下：合成方案一：化合物REX-MA-5的合成步驟一：化合物REX-MA-5的制備參照實(shí)施例一的制備方法先制得化合物REX-MA-2，再取化合物REX-MA-2(100.0mg,0.16mmol)溶解在2.0ml干燥的四氫呋喃溶液中，加入1M硼烷四氫呋喃溶液(1.60ml,1.60mmol),將反應(yīng)體系在50℃攪拌18小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入無水甲醇淬滅，淬滅后直接濃縮，將濃縮液轉(zhuǎn)移到密封管中，加入無水甲醇2.0ml，在100℃攪拌6小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后濃縮,用硅膠柱提純得到化合物REX-MA-5(63.6mg,66.0％)。MSm/z[ESI]：603.3[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.44(s,1H),7.23(s,1H),6.76(s,1H),6.39(s,1H),5.85(s,1H),5.40(s,1H),4.82–4.75(m,1H),3.73(s,2H),3.18–3.07(m,8H),2.92–2.66(m,14H),1.44-1.28(m,8H).實(shí)施例三、【編號為REX-MA-21】的制備合成路線如下：合成方案一：中間體1-3的合成步驟一：化合物1-2的制備將化合物1-1(24.6g,328.0mmol)溶解在2.0L1,4-二氧六環(huán)和水的混合溶劑中(1,4-二氧六環(huán)：水＝10：1)，加入氫氧化鈉(20.0g,328.0mmol)，在冰水浴中滴加而碳酸二叔丁酯(77.0g,354.0mmol)，反應(yīng)體系在0℃攪拌2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入2.0L飽和硫酸氫鈉溶液，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物1-2(50.5g,88.0％)。MSm/z[ESI]：176.1[M+1]。步驟二：化合物1-3的制備將化合物1-2(26.7g,152.7mmol)溶解在1.5L二氯甲烷中，在冰水浴中分別滴加三乙胺(42.7ml,305.4mmol)、對甲苯磺酰氯(44.3g,229.1mmol)，移去冰水浴，室溫?cái)嚢?小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水1.0L，用二氯甲烷萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物1-3(42.7g,85.0％)。MSm/z[ESI]：330.1[M+1]。合成方案二：中間體2-7的合成步驟一：化合物2-2的制備將化合物2-1(10.0g,88.0mmol)溶解在150ml四氫呋喃中，在冰水浴中分別滴加氫化鈉(5.8g,96.0mmol)，移去冰水浴，室溫?cái)嚢?2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水200ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物2-2(15.2g,71.0％)。MSm/z[ESI]：244.1[M+1]。步驟二：化合物2-3的制備將化合物2-2(15.2g,62.3mmol)和N-氯代丁二酰亞胺(9.9g,74.5mmol)溶解在300ml干燥的四氫呋喃溶液中，在-78℃條件下滴加二(三甲基硅基)氨基鋰(98.8ml，1.0M)，滴加完畢再次溫度下繼續(xù)攪拌兩小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水200ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物2-3(16.9g，84.0％)。MSm/z[ESI]：278.1[M+1]。步驟三：化合物2-4的制備將化合物2-3(16.9g，61.3mmol)溶解在300ml二甲亞砜溶液中，氮?dú)鈼l件下分別加入甲基亞磺酸鈉(12.3g,120.2mmol)，四甲基乙二胺(1.7g，19.5mmol)，三氟甲磺酸銅(3.9g,10.8mmol)，反應(yīng)體系在80℃條件下攪拌12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水300ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物2-4(15.0g，76.0％)。MSm/z[ESI]：322.1[M+1]。步驟四：化合物2-5的制備將化合物2-4(11.6g，36.0mmol)溶解在300ml乙醇和水的混合溶液中(乙醇:水＝1.6:1)，分別加入氯化銨(7.5g，72.1mmol)，鐵粉(47.1g，72.1mmol)，反應(yīng)體系在65℃條件下攪拌2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水500ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物2-5(9.3g,89.0％)。MSm/z[ESI]：292.1[M+1]。步驟五：化合物2-6的制備將化合物2-5(8.6g，29.5mmol)溶解在鹽酸甲醇溶液中(200ml，4M)，室溫條件下攪拌12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入飽和碳酸氫鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH到8左右，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純得到化合物2-6(5.1g,87.0％)。MSm/z[ESI]：198.0[M+1]。步驟六：化合物2-7的制備將化合物2-6(3.0g，15.1mmol)溶解在150mlN，N-二甲基甲酰胺溶液中，0℃條件下加入碳酸鉀(3.0g,21.6mmol)，在該溫度下繼續(xù)攪拌45分鐘，緩慢加入化合物1-3(7.1g,21.6mmol)，90℃條件下攪拌12小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水150ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物2-7(1.7g,36.0％)。MSm/z[ESI]：319.1[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.08(s,1H),4.69(s,1H),4.12(t,J＝6.8Hz,2H),3.85(s,2H),3.24–3.06(m,5H),2.13–1.91(m,2H),1.44(s,9H).合成方案三：中間體3-6的合成步驟一：化合物3-2的制備將化合物3-1(9.3g,53.3mmol)溶解在100ml濃硫酸中，在冰水浴中分別滴濃硝酸(3.5g,44.5mmol)，滴加完畢反應(yīng)在0-10℃條件下攪拌2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水0.5L，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物3-2(11.7g,99.0％)。MSm/z[ESI]：219.9[M+1]。步驟二：化合物3-3的制備將化合物3-2(11.7g,53.4mmol)和碳酸銫(69.5g，213.2mmol)溶解在200ml干燥的異丙醇中，將反應(yīng)體系在50℃條件下攪拌14小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水0.5L，用1N的鹽酸將體系pH調(diào)到3左右，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物3-3(10.7g,77.3％)。MSm/z[ESI]：260.0[M+1]。步驟三：化合物3-4的制備將化合物3-3(10.7g,41.4mmol)溶解在200ml干燥的甲醇中，室溫氮?dú)鈼l件下緩慢滴加濃硫酸(2.3ml)，滴加完畢將反應(yīng)在83℃條件下攪拌18小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入飽和碳酸氫鈉溶液100ml,加入冰水0.5L，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物3-4(10.7g,95.0％)。MSm/z[ESI]：274.0[M+1]。步驟四：化合物3-5的制備將化合物3-4(10.7g,39.2mmol)溶解在300ml1,4-二氧六環(huán)和水的混合溶劑中(1,4-二氧六環(huán)：水＝3：1)，室溫氮?dú)鈼l件下分別加入磷酸鉀(16.6g,78.2mmol)，1-甲基-1,2,3,6-四氫吡啶-4-硼酸頻哪醇酯(8.7g,39.1mmol)，[1,1'-雙(二苯基膦)二茂鐵]二氯化鈀二氯甲烷絡(luò)合物(3.2g,3.9mmol)，加料完畢將反應(yīng)體系在105℃條件下反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水0.5L，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物3-5(5.0g,38.6％)。MSm/z[ESI]：335.2[M+1]。步驟五：化合物3-6的制備將化合物3-5(5.0g,15.0mmol)溶解在200ml甲醇中，室溫氫氣條件下加入鈀碳(2.5g,水含量58.8％)，加料完畢將反應(yīng)體系在常溫一個(gè)大氣壓的氫氣條件下反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后用硅藻土過濾，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物3-6(4.1g,89.0％)。MSm/z[ESI]：307.2[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.24(s,1H),6.82(s,1H),4.64-4.57(m,1H),3.84(s,3H),3.75(m,2H),3.53-3.45(m,1H),3.02-2.99(d,2H,J＝11.6Hz),2.36(s,3H),2.18-2.12(m,2H),1.86-1.73(m,4H),1.37-1.35(d,6H,J＝6.0Hz).合成方案四：REX-MA-21的合成步驟一：化合物4-2的制備將化合物4-1(2.2g,12.0mmol)和化合物2-7(2.0g,6.0mmol)溶解在60ml干燥的異丙醇中，加入N，N–二異丙基乙胺(4.1ml，24.0mmol)，加料完畢將反應(yīng)體系在95℃條件下攪拌6小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水200ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物4-2(5.1g,91.0％)。MSm/z[ESI]：465.1[M+1]。步驟二：化合物4-3的制備將化合物4-2(2.5g,5.3mmol)和化合物3-7(1.8g,5.8mmol)溶解在60ml干燥的1,4-二氧六環(huán)中，在氮?dú)鈼l件下分別加入醋酸鈀(119.0mg,0.5mmol)，4,5-雙(二苯基膦)-9,9-二甲基氧雜蒽(613.3mg,1.1mmol)，磷酸鉀(2.3g,10.6mmol)，加料完畢將反應(yīng)體系在100℃條件下攪拌16小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入冰水100ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物4-3(2.4g,61.0％)。MSm/z[ESI]：735.3[M+1]。步驟三：化合物4-4的制備將化合物4-3(2.3g,3.1mmol)溶解在60ml1,4-二氧六環(huán)和水的混合溶劑中(1，4-二氧六環(huán):水＝1:1)，在氮?dú)鈼l件下加入氫氧化鈉(496.0mg，12.4mmol)，加料完畢將反應(yīng)體系在90℃條件下攪拌2小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后濃縮除去有機(jī)溶劑，向體系中加入冰水30ml，用1N的鹽酸溶液調(diào)節(jié)體系pH到3左右，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后得到的產(chǎn)物不經(jīng)提純直接投入到下一步反應(yīng)。MSm/z[ESI]：721.3[M+1]。步驟四：化合物4-5的制備將化合物4-4(未提純)溶解在30ml甲醇中，在氮?dú)鈼l件下加入鹽酸1,4-二氧六環(huán)溶液(30ml,4.0M)，加料完畢將反應(yīng)體系在40℃條件下攪拌3小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后濃縮除去有機(jī)溶劑，向體系中加入無水乙腈30ml，濃縮后得到的產(chǎn)物不經(jīng)提純直接投入到下一步反應(yīng)。MSm/z[ESI]：621.3[M+1]。步驟五：化合物REX-MA-2的制備將化合物4-5(未提純)溶解在30ml干燥的N，N–二甲基甲酰胺中，在氮?dú)鈼l件下分別加入2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.8g,4.6mmol)，N，N–二異丙基乙胺(5.3ml,31.0mmol)，加料完畢將反應(yīng)體系在室溫條件下攪拌24小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后向體系中加入冰水60ml，用乙酸乙酯萃取，飽和食鹽水洗，無水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱提純，得到化合物REX-MA-21(280.0mg,經(jīng)步驟三、四、五這三步反應(yīng)后收率為15.0％)。MSm/z[ESI]：603.2[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝8.76(s,1H),8.18(s,1H),8.15(s,1H),8.01(s,1H),7.89(t,J＝5.2Hz,1H),7.68(s,1H),4.36–4.34(m,2H),3.08–3.04(m,6H),2.95(s,3H),1.36-1.33(m,10H),1.23-1.18(m,8H).實(shí)施例四、【編號為REX-MA-22】的制備合成路線如下：合成方案一：化合物REX-MA-22的合成步驟一：化合物REX-MA-22的制備參照實(shí)施例三的制備方法先制得化合物REX-MA-21，再取化合物REX-MA-21(96.4mg,0.16mmol)溶解在2.0ml干燥的四氫呋喃溶液中，加入1M硼烷四氫呋喃溶液(1.60ml,1.60mmol),將反應(yīng)體系在50℃攪拌18小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束向體系中加入無水甲醇淬滅，淬滅后直接濃縮，將濃縮液轉(zhuǎn)移到密封管中，加入無水甲醇2.0ml，在100℃攪拌6小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后濃縮,用硅膠柱提純得到化合物REX-MA-22(64.0mg,68.0％)。MSm/z[ESI]：589.2[M+1]。1H-NMR(400MHz,CDCl3):δ＝7.42(s,1H),7.18(s,1H),6.71(s,1H),6.36(s,1H),4.76–4.68(m,1H),4.08–4.04(m,2H),3.39(s,3H),3.08-3.04(m,8H),1.44-1.41(m,7H),1.23-1.18(m,12H).實(shí)施例五、ALK激酶抑制活性及相關(guān)突變位點(diǎn)結(jié)合率的測定對上述實(shí)施例一到四制得的化合物REX-MA-2、REX-MA-5、REX-MA-21、REX-MA-22采用(FRET)方法來測定前述化合物對ALK激酶抑制活性，該抑制活性采用IC50這一指標(biāo)來表示，IC50即ALK激酶的活性被抑制50％時(shí)的化合物的濃度。同時(shí)采用EuKinaseBingingAssay(TR-FRET)測定了本發(fā)明的化合物對ALK相關(guān)突變位點(diǎn)如ALKL1196M的結(jié)合率測定，也采用IC50這一指標(biāo)來表示。LanthaScreenEu激酶結(jié)合實(shí)驗(yàn)通過添加Eu標(biāo)記抗體或者抗標(biāo)簽抗體檢測AlexaFluor偶聯(lián)物或激酶“示蹤劑”結(jié)合。示蹤劑和抗體與激酶的結(jié)合導(dǎo)致高度的FRET，反之使用激酶抑制因子代替示蹤劑會造成FRET丟失。本發(fā)明利用Lifetechnology公司的kinaseassay平臺進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表一。結(jié)果表明，本發(fā)明提供的化合物有較好的ALK抑制活性，并且對ALK的突變位點(diǎn)(如ALKL1196M)也有較好的結(jié)合率。表一實(shí)施例化合物的ALK抑制活性及ALKL1196M結(jié)合率測定ALKIC50(nM)ALKF1196MIC50(nM)REX-MA-234.677.6REX-MA-510782REX-MA-21451843REX-MA-22270196實(shí)施例六、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CellTiterGLO法檢測)待測化合物：本發(fā)明實(shí)施例一制得的化合物REX-MA-2、實(shí)施例二制得的化合物REX-MA-5。細(xì)胞株：人間變性大細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株Karpas-299、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株NCI-H3122，購自南京科佰生物科技有限公司。方法：收集對數(shù)生長期細(xì)胞，計(jì)數(shù)，用完全培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至合適濃度(依照細(xì)胞密度優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果確定)，接種96孔板，每孔加100μl細(xì)胞懸液。細(xì)胞在37℃，100％相對濕度，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育24小時(shí)。用培養(yǎng)基將待測化合物稀釋至所設(shè)置的相應(yīng)作用濃度，按25μl每孔加入細(xì)胞。化合物作用終濃度從10μM開始，3倍梯度稀釋，共10個(gè)濃度點(diǎn)。細(xì)胞置于37℃，100％相對濕度，5％CO2培養(yǎng)箱中孵育72小時(shí)。孵育結(jié)束后按照CellTiterGlo試劑說明書要求，在細(xì)胞版中加入配制好的試劑，充分混勻后室溫避光孵育10分鐘。將細(xì)胞板放入讀板儀進(jìn)行分析，設(shè)定讀取化學(xué)發(fā)光并記錄數(shù)據(jù)。計(jì)算抑制率。根據(jù)各化合物不同濃度對各細(xì)胞生長的抑制率，用graphad6.0計(jì)算各化合物在各細(xì)胞上的IC50值。計(jì)算公式為：結(jié)果：見表二。表二CellTiterGLO法檢測實(shí)施例化合物對Karpas-299/NCI-H3122細(xì)胞株的IC50值IC50(nM)Karpas-299NCI-H3122REX-MA-2315.41463REX-MA-5360.9332實(shí)施例七、斑馬魚表型篩選實(shí)驗(yàn)斑馬魚是一種脊椎動物，與人類基因同源性高達(dá)85％，其信號傳導(dǎo)通路與人類基本近似，生物結(jié)構(gòu)和生理功能與哺乳動物高度相似；其體積小、發(fā)育迅速、胚胎透明、產(chǎn)卵量高，這些獨(dú)特優(yōu)勢使得斑馬魚成為人類疾病研究和活體高通量藥物篩選的最佳模式生物體之一。其中，間變性淋巴瘤激酶ALK(Anaplasticlymphomakinase)在人類與斑馬魚中基因同源性達(dá)76％。斑馬魚的白細(xì)胞酪氨酸激酶ltk(leukocytetyrosinekinase)調(diào)控斑馬魚虹膜色素細(xì)胞的生成(Lopes,S.S.,Yang,X.,etal.(2008).Leukocytetyrosinekinasefunctionsinpigmentcelldevelopment.PLoSGenet,4.)，虹膜色素細(xì)胞在斑馬魚中表現(xiàn)為一種銀色小體，分布在頭部、眼睛、脊柱外側(cè)(反射光觀察)，利用黑色素缺失的Albino斑馬魚，在透色光中可以觀察到銀色小體為黑色，見說明書附圖的圖1。ALK與LTK是sisterkinase，研究者發(fā)現(xiàn)注射外源性的ALK質(zhì)粒同樣可以調(diào)節(jié)虹膜色素細(xì)胞的生成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明ALK抑制劑大多有LTK活性，可以抑制虹膜色素細(xì)胞的生成(Rodrigues,F.S.,Yang,X.,Nikaido,M.,Liu,Q.,&Kelsh,R.N.(2012).Asimple,highlyvisualinvivoscreenforanaplasticlymphomakinaseinhibitors.ACSChemBiol,7,1968-1974.)。因此，利用這一原理，我們考察化合物對正常斑馬魚虹膜色素細(xì)胞的影響，來探討化合物在體內(nèi)抗ALK活性的強(qiáng)弱。實(shí)驗(yàn)(一)化合物對正常斑馬魚虹膜色素細(xì)胞的影響方案：選取6hpf(hourspostfertilization)的魚卵，隨機(jī)分組，然后加入各濃度的受試藥物，至3dpf(dayspostfertilization)時(shí)進(jìn)行圖象采集，然后利用ImageJ軟件分析泄殖孔至尾鰭部位斑馬魚脊背側(cè)虹膜色素細(xì)胞的IOD(integratedoptiondensity)值，采用Graphpadprism6.0進(jìn)行Dunnett’sT-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p<0.05表明具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，虹膜色素抑制率計(jì)算公式如下：計(jì)算結(jié)果見表三和表四，化合物REX-MA-2對斑馬魚虹膜色素細(xì)胞影響的量效關(guān)系圖(mean±sem)見圖2，化合物REX-MA-2對斑馬魚虹膜色素細(xì)胞的影響圖見圖3。表三化合物REX-MA-2對斑馬魚虹膜色素細(xì)胞的影響(mean±sem)comparedwithcontrol,*,p<0.05；**,p<0.01表四化合物REX-MA-21/22對斑馬魚虹膜色素細(xì)胞的影響(mean±sem)comparedwithcontrol,*,p<0.05；**,p<0.01。當(dāng)前第1頁1 2 3