本發(fā)明涉及甾族化合物，具體涉及五環(huán)三萜類化合物以及該化合物在制備治療炎癥性血管疾病藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

毛冬青為冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬植物Ilex pubescens Hook.et Arn.，別名烏尾丁、六月霜、細(xì)葉冬青、毛披樹、水火藥、火烙木等，主產(chǎn)于廣東、江西、福建、廣西等地，是我國(guó)南方常用中藥。其藥用部位為根，具有活血通絡(luò)、消腫止痛、清熱解毒之功效，臨床上廣泛用于治療冠心病、心絞痛、血栓閉塞性脈管炎等。

有文獻(xiàn)報(bào)道過毛冬青部位的抗炎作用(Wang JR,Zhou H,Jiang ZH,Wong YF,Liu L.In vivo anti-inflammatory and analgesic activities of a purified saponon fraction derived from the root of Ilex pubescens.Biol.Pharm.Bull.2008,21,643-650.)，同時(shí)有文獻(xiàn)報(bào)道從中分離得到的三萜皂苷類化合物具有抗腫瘤(Zhou Y,Chai XY,Zeng K,Zhang JY,Li N,Jiang Y,Tu PF,llexpublesnins C-M,eleven new triterpene saponins from the roots of Ilex pubescens.Planta.Med.2013,79,70-77.)、抗血栓(熊天琴,陳元元,李紅俠.毛冬青皂苷B3的抗血栓作用研究,中草藥.2012,43,1758-1788)和抑制黃嘌呤氧化酶(Zhou Z L,Feng Z C,Yin W Q,Zhang H L.A new triterpene saponin from the leaves of Ilex pubescens and its XOD inhibitory activity.Chem.Nat.Compd.2013,49(4):682-684.)作用。

齊墩果烷型三萜皂苷類化合物在植物界分布較廣，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道從1996年至2012年期間，共從自然界發(fā)現(xiàn)齊墩果烷型三萜類化合物超過上千個(gè)(Dinda B,Debnath S,Mohanta BC,Harigaya Y.Naturally Occurring Triterpenoid Saponins.Chemistry Biodiversity.2010,2327-2580.Hill RA,Connolly JD.Triterpenoids.Nat.Prod.Rep.2015,32:273-327)。關(guān)于該類化合物抗炎活性的報(bào)道并不是特別多，國(guó)外學(xué)者Son(Kwak WJ,Son KH.Loniceroside C,an Antiinflammatory Saponin from Lonicera japonica.Chem.Pharm.Bull.2003,51:333-335.)從忍冬(Lonicera japonica)的地上部分分離得到兩個(gè)齊墩果烷型三萜類化合物，分別是Loniceroside A和Loniceroside C，并用巴豆油誘導(dǎo)小鼠耳水腫實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)其抗炎活性，結(jié)果顯示在100mg/kg的劑量下，其抑制率分別為30.2％和31.0％。有學(xué)者(Wang HL,Yu BY.Two New Triterpenoid Saponins Isolated from Polygala japonica.Chem.Pharm.Bull.2006,54:1739-1742.)從遠(yuǎn)志屬植物瓜子金(Polygala japonica)中發(fā)現(xiàn)6個(gè)齊墩果烷型型三萜類化合物，在角叉菜膠誘導(dǎo)小鼠急 性足跖腫脹模型中，皂苷3、4、5在0.1mol/kg的劑量下表現(xiàn)出較為顯著的抗炎活性。有學(xué)者(Wei F,Lin RC.Antiinflammatory Triterpenoid Saponins from the Seeds of Aesculus chinensis.Chem.Pharm.Bull.2004,52:1246-1248.)從七葉樹(Aesculus chinensis)的種子中發(fā)現(xiàn)四個(gè)齊墩果烷型三萜類化合物，它們分別是escin 1a、escin 1b、isoescin 1a和isoescin 1b，在二甲苯誘導(dǎo)小鼠耳水腫模型中，在30mg/kg的劑量下抑制率為67.3％-79.3％。有學(xué)者(Shi SP,Tu PF.Triterpene Saponins from Clematis mandshurica.J.Nat.Prod.2006,69:1591-1595)從辣蓼鐵線蓮的根莖中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)齊墩果烷型三萜類化合物，分別是clematomandshurica saponins A和B，在LPS誘導(dǎo)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞模型中，它們抑制COX-2的IC₅₀值分別為2.66和2.58μM。有學(xué)者(Wu C,Li YL.Triterpenoid Saponins from the stem Barks of Schefflera heptaphylla.Planta Med.2013,79:1348-1355)從鴨腳木的樹皮中發(fā)現(xiàn)兩個(gè)齊墩果烷型三萜類化合物Heptoleoside B和C，在LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞模型中，在40μM的濃度下，對(duì)NO的抑制率分別為22.5％和45.2％，但是所得兩個(gè)齊墩果烷型三萜皂苷化合物的抗炎活性仍不理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題提供一種齊墩果烷型三萜皂苷類化合物，該化合物治療炎癥性血管疾病的效果顯著。

本發(fā)明要解決上述問題的技術(shù)方案是：

一種齊墩果烷型三萜皂苷類化合物，其分子結(jié)構(gòu)如式Ⅰ所示：

本發(fā)明所述的齊墩果烷型三萜皂苷類化合物的分子式C₄₁H₆₄O₁₄，HR-ESI-MS m/z[M+Na]⁺:803.4190，化學(xué)名稱為3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β,19α-二羥基齊墩果烷-24-醛基-12-烯-28-酸-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

本發(fā)明所述的齊墩果烷型三萜皂苷類化合物可以通過化學(xué)合成的方法。本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以通過本領(lǐng)域的知識(shí)確定合成步驟和工藝條件。本發(fā)明所述的齊墩果烷型三萜皂苷類化合物還可以從毛冬青(Ilex pubescens Hook et Arn.)中分離得到，具體分離方法由下步驟組成：

(1)取毛冬青根，依次用12、10和8倍濃度為70％的乙醇回流提取2h，合并乙醇提取液，回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，得總浸膏；

(2)將總浸膏溶解在水中，過D-101型大孔樹脂柱，依次用濃度為30％的乙醇、濃度為60％的乙醇和濃度為95％的乙醇洗脫；收集濃度為60％的乙醇洗脫液過200～300目的硅膠柱，以氯仿-甲醇為溶劑按氯仿︰甲醇為100︰1～0︰1的梯度進(jìn)行洗脫；收集氯仿︰甲醇為9︰1的洗脫液過Sephadex LH-20柱，以甲醇為洗脫劑洗脫，收集洗脫液濃縮后過ODS柱，收集甲醇：水為52：48的洗脫液，濃縮后得到白色粉末狀結(jié)晶即可。

上述分離方法中所述的乙醇的濃度均為體積濃度。

上述分離方法中所述的毛冬青是冬青科(Aquifoliaceae)冬青屬(Ilex)植物毛冬青的干燥根。

本發(fā)明所述的齊墩果烷型三萜皂苷類化合物，具有抗炎作用，可用于制備預(yù)防和治療治療炎癥性血管疾病的藥物。所述的藥物是由(Ⅰ)式所示齊墩果烷型三萜皂苷類化合物和藥學(xué)上可以接受的輔料組成的常用的劑型，如，注射劑、片劑或膠囊劑等。所述制劑中(I)式所示的化合物的重量百分含量為10％～50％。

下面通過實(shí)驗(yàn)來證明(Ⅰ)式所示齊墩果烷型三萜皂苷類化合物所具有的技術(shù)效果。采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞模型，研究化合物對(duì)細(xì)胞中一氧化氮合成酶(iNOS)和環(huán)氧酶-2(COX-2)蛋白表達(dá)量的影響，考察本發(fā)明所述化合物的抗炎作用，具體實(shí)驗(yàn)方法如下所述。

材料和方法

1、樣品1來源于具體實(shí)施例1所示制備方法。對(duì)照品clematomandshurica saponins B為文獻(xiàn)(Shi SP,Tu PF.Triterpene Saponins from Clematis mandshurica.J.Nat.Prod.2006,69:1591-1595)所報(bào)道化合物，具體結(jié)構(gòu)式如下式(Ⅱ)所示。陽(yáng)性對(duì)照藥DEX為地塞米松。

clematomandshurica saponins B

2、鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)，保存在含有10％FBS、100units/ml盤尼西林G、100mg/ml鏈霉素及2mM L-左旋谷酰胺培養(yǎng)液中，在飽和濕度、37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)。

3、化合物溶解在DMSO中，母液濃度配成30mM，工作濃度為30μM。

4、RAW264.7細(xì)胞以8×10⁴個(gè)/孔接種于24孔板中培養(yǎng)24h，細(xì)胞經(jīng)過測(cè)試樣品和陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松(0.5μM)預(yù)處理1h，然后用100ng/ml的LPS刺激18h，設(shè)空白組合正常組。

5、Western Blot方法：LPS刺激之后，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液將細(xì)胞總蛋白提取出來，通過Bio-Rad蛋白質(zhì)定量法測(cè)得濃度，凝膠電泳之后轉(zhuǎn)膜，5％脫脂牛奶進(jìn)行封閉，然后用iNOS、COX-2一抗和鼠特異性抗體在4℃條件下孵育過夜，室溫二抗孵育，蛋白表達(dá)含量用Odyssey v3.0軟件進(jìn)行分析。

6、統(tǒng)計(jì)分析：上述檢測(cè)結(jié)果用X±S表示，樣品組合空白對(duì)照組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)學(xué)分析，P＜0.05表示具有顯著性差異。

表1 iNOS和COX-2蛋白表達(dá)抑制率

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明化合物1能夠顯著性抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中iNOS和COX-2蛋白的表達(dá)。表明該化合物均具有較好的節(jié)抗炎作用。同時(shí)與已報(bào)道化合物clematomandshurica saponins B相比，雖然兩個(gè)化合物對(duì)COX-2抑制率相差不大，但是化合物1對(duì)iNOS的抑制率明顯要大于clematomandshurica saponins B，也就是說化合物1具有多靶標(biāo)的特點(diǎn)。

附圖說明

圖1本發(fā)明所述化合物的¹H-NMR圖(400MHz)。

圖2本發(fā)明所述化合物的¹³C-NMR圖(100MHz)。

圖3本發(fā)明所述化合物的DEPT圖。

圖4本發(fā)明所述化合物的COSY NMR圖。

圖5本發(fā)明所述化合物的HSQC NMR圖。

圖6本發(fā)明所述化合物的HMBC NMR圖。

圖7本發(fā)明所述化合物的NOESY NMR圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)驗(yàn)用毛冬青(Ilex pubescens Hook et Arn.)根采自廣東省從化市。

例1：

一、化合物的制備

(1)取毛冬青根，依次用12、10和8倍的濃度為70％的乙醇回流提取2h，合并乙醇提取液，過濾后回收乙醇并減壓濃縮至無醇味，得總浸膏2.2kg；

(2)將總浸膏溶解在水中，過D-101型大孔樹脂柱，依次用濃度為30％的乙醇、濃度為60％的乙醇和濃度為95％的乙醇洗脫；收集濃度為60％的乙醇洗脫液減壓回收溶劑，得稠浸膏566g，該稠浸膏過200～300目的硅膠柱，以氯仿-甲醇為溶劑按氯仿︰甲醇為100︰1～0︰1的梯度進(jìn)行洗脫；收集氯仿︰甲醇為9︰1的洗脫液濃縮后過Sephadex LH-20柱，以甲醇為洗脫劑洗脫，收集洗脫液濃縮后過ODS柱，收集甲醇：水為52：48的洗脫液，濃縮后得到白色粉末狀結(jié)晶16mg。

二、化合物的鑒定

所得到的白色粉末狀結(jié)晶Liebermann-Burchard反應(yīng)呈陽(yáng)性，最終顯示紫紅色，說明其為三萜類化合物。

參見圖1～5，IR顯示有羥基吸收(3429cm^-1)，羰基吸收(1705cm^-1)，雙鍵吸收(1632cm^-1)。高分辨質(zhì)譜給出分子式C₄₁H₆₄O₁₄，[M+Na]⁺:803.4190，根據(jù)分子式計(jì)算出該分子的不飽和度為9。該化合物通過酸水解，衍生化后用TLC和HPLC分析并與糖標(biāo)準(zhǔn)品的衍生物對(duì)照，證明其糖單元為D-木糖和D-葡萄糖。參見表1，¹³C-NMR譜中共顯示41個(gè)碳信號(hào)，其中11個(gè)歸屬為糖，剩下30個(gè)碳信號(hào)提示可能為三萜苷元。參見表1，¹H-NMR譜中顯示有6個(gè)角甲基信號(hào)[δ_H 0.79,0.96,1.08,1.16,1.60,1.63]。一組三取代雙鍵(δ_H 5.51,δ_C 123.6,C-12；δ_C 144.2,C-13)，一個(gè)醛基(δ_H 10.38,δ_C 206.4,CHO-24)，一個(gè)酯羰基(δ_C 177.6,COOR-28)，一個(gè)木糖的端基質(zhì)子信號(hào)(δ_H 4.84,δ_C 108.2,CH-Xyl-1)和一個(gè)葡萄糖的端基質(zhì)子信號(hào)(δ_H 6.36,δ_C 96.2,CH-Glc-1)，其耦合常數(shù)為7.2和8.0提示D-木糖和D-葡萄糖均為β-構(gòu)型。以上信息提示該化合物可能為同時(shí)具有羧基、醛基和羥基的齊墩果烷型三萜皂苷。與已知化合物ilexpublesnin L比較碳譜數(shù)據(jù)，兩者化學(xué)位移很相似，區(qū)別在于3位不同的糖單元。

參見圖6，HMBC譜顯示烯氫δ_H 5.51(1H,br s,H-12)與δ_C 24.9(C-11)、δ_C 42.4(C-14)和δ_C 45.0(C-18)均有遠(yuǎn)程相關(guān)，提示雙鍵處于C-12與C-13之間。HMBC譜顯示連氧氫δ_H 3.59(1H,m,H-19)與δ_C 46.8(C-17)和δ_C 29.1(C-29)均有遠(yuǎn)程相關(guān)，提示羥基處于C-19位。HMBC譜顯示δ_H 4.84(d,J＝7.2Hz,CH-xyl-1)與δ_C 87.0(C-3)有遠(yuǎn)程相關(guān)確定木糖連接在C-3位上。

參見圖7，ROESY譜顯示其相關(guān)峰有H-C(3)/H-C(5)、H-C(5)/H-C(9)、H-C(9)/H-C(27)、H-C(20)/H-C(27)提示19位氧取代、23-Me和27-Me處于α位，相關(guān)峰H-C(24)/H-C(25)、H-C(25)/H-C(26)、H-C(19)/H-C(30)提示3位氧取代、24-CHO、25-Me、26-Me和30-Me處于β位。綜上確定新化合物的結(jié)構(gòu)為3-O-β-D-吡喃葡萄糖基-3β,19α-二羥基齊墩果烷-24-醛基-12-烯-28-酸-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。

表2化合物Ⅰ的¹H NMR和¹³C NMR數(shù)據(jù)(Pyridine-d₅,J＝Hz)

例2：(注射劑)

取采用上述實(shí)施例1所述方法得到的化合物1000mg，加1000ml的注射用水，用碳酸鈉調(diào)pH值至7～7.5，攪拌使溶解，除菌濾過，灌封，經(jīng)100℃15分鐘流通蒸汽滅菌，制成每支2mg/2ml的注射液供注射使用。

例3：(膠囊劑)

取采用上述實(shí)施例1所述方法得到的化合物5000mg與4000mg微晶纖維素、500mg羧甲基淀粉鈉、400mg十二烷基硫酸鈉等輔料充分混合，采用輥壓法進(jìn)行干法制粒，再與適量硬脂酸鎂混勻，填充入3#空心膠囊，制成規(guī)格為100mg/粒的膠囊劑供口服使用。

例4：(片劑)

取采用上述實(shí)施例1所述方法得到的化合物5000mg與4000mg淀粉、200mg交聯(lián)PVP、300mg羧甲基淀粉鈉混合均勻，用5％PVP的75％乙醇溶液作為粘合劑，制軟材，以18目篩制粒，60℃干燥后1h，20目整粒后加入適量滑石粉，混勻，壓片，制成規(guī)格為100mg/片的片劑供口服使用。