本申請涉及全基因組選擇育種技術(shù)。具體而言，本申請涉及利用全基因組選擇育種技術(shù)選育含有重組核酸片段的水稻植株，以及由此而獲得的重組核酸片段及其檢測方法。

背景技術(shù)：

長期以來，傳統(tǒng)育種的選擇方法主要依賴于田間表現(xiàn)型的評價(jià)，根據(jù)育種家個(gè)人經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行取舍，其最大的缺點(diǎn)在于耗時(shí)長，效率較低。要提高選擇的效率，最理想的方法應(yīng)是能夠直接對基因型進(jìn)行選擇。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記為實(shí)現(xiàn)對基因型的直接選擇提供了可能。近年來，已開始應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇方法來改良個(gè)別目標(biāo)性狀，能夠顯著的縮短育種年限。

稻瘟病是水稻最嚴(yán)重的病害之一，全球每年由稻瘟病引起的水稻產(chǎn)量損失占11％～30％，因此稻瘟病及其抗性的研究顯得尤為重要。隨著對稻瘟病研究的逐步深入，許多水稻抗稻瘟病基因DNA片段相繼被定位和克隆。其中，水稻第6染色體的Pi2區(qū)間被定位和克隆了很多稻瘟病抗性基因，如Pi2、Piz-t、Pi9、Pigm、Pi50，該區(qū)間包含一個(gè)稻瘟病抗性基因的基因簇(Qu等，Genetics.2006,172:1901-1914；Wang等，Phytopathology.2012,102:779-786；Xiao等，Mol Breeding.2012,30:1715-1726；Liu等，Mol Genet Genomics.2002,267:472-480；Jiang等，Rice.2012,5:29-35；Zhu等，Theor Appl Genet.2012,124:1295-1304；Deng等，Theor Appl Genet.2006,113:705-713)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

一方面，本申請?zhí)峁┝酥亟M核酸片段，其選自：i)包含SEQ ID NO:1所示序列401-484位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序 列；ii)包含SEQ ID NO:1所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；iii)包含SEQ ID NO:2所示序列194-420位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；iv)包含SEQ ID NO:2所示序列的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列；以及以上片段的組合。

在一實(shí)施方案中，所述重組核酸片段為基因組重組核酸片段。

此外，本申請?zhí)峁┝藱z測所述重組核酸片段的引物，其選自：(I)特異性識別SEQ ID NO:1所示序列1-401位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列484-649位核苷酸的序列的反向引物；(II)以下第一組引物對與第二組引物對的組合，其包含(a)第一組引物對：特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-401位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第402-483位核苷酸的序列的反向引物；和(b)第二組引物對：特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第402-483位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第484-649位核苷酸的序列的反向引物；(III)特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第400-401位或第401-402位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第483-484位或第484-485位核苷酸的序列的反向引物；(IV)特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第400-401位或第401-402位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第484-649位核苷酸的序列的反向引物；(V)特異性識別SEQ ID NO:1所示序列第1-401位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:1所示序列第483-484位或第484-485位核苷酸的序列的反向引物；和/或任選地，(VI)特異性識別SEQ ID NO:2所示序列1-194位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列420-852位核苷酸的序列的反向引物；(VII)以下第三組引物對與第四組引物對的組合，其包含(c)第三組引物對：特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-194位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第195-419位核苷酸的序列的反向引物；和(d)第四組引物對：特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第195-419位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第420-852位核苷酸的序列的反向引 物；(VIII)特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第193-194位或第194-195位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第420-421位核苷酸的序列的反向引物；(IX)特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第193-194位或第194-195位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第419-420位或第420-852位核苷酸的序列的反向引物；(X)特異性識別SEQ ID NO:2所示序列第1-194位核苷酸的序列的正向引物和特異性識別包含SEQ ID NO:2所示序列第419-420位或第420-421位核苷酸的序列的反向引物。

在一實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增SEQ ID NO:1所示序列的引物對為，例如，5’-ATTTTAGAGCCAGCAGTTAGATAC-3’，和5’-CTTAAAGGAAGTGAATACATACGG-3’。用于檢測SEQ ID NO:1所示序列的測序引物為，例如，5’-TGCTCGGTAATTTGAGGTAA-3’和5’-TGTATGATAAGTGGGACCAG-3’。

在另一實(shí)施方案中，用于擴(kuò)增SEQ ID NO:2所示序列的引物對為，例如，5’-ACAATAAAGGGAGCTGGGTGAT-3’，和5’-CATGATTACTTGCGAGCTGTCT-3’。用于檢測SEQ ID NO:2所示序列的測序引物為，例如，5’-ACAATAAAGGGAGCTGGGTGAT-3’和5’-ATCAAGAGCGGGTGTACGAG-3’。

另一方面，本申請?zhí)峁┝诉x育含有重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以不含目的基因組片段的水稻受體植物親本作為輪回親本，將其與含有目的基因組片段的水稻供體植物進(jìn)行雜交，然后將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交，再將所得到的回交種進(jìn)行自交的步驟，其中利用分子標(biāo)記對重組植株進(jìn)行前景選擇和背景選擇。例如，所述重組核酸片段如前所述。

在上述方法中，用于所述前景選擇的分子標(biāo)記選自Pi31、W068C06B和Pi2S122中的一種或多種；和/或利用水稻全基因組育種芯片進(jìn)行所述背景選擇。

在一實(shí)施方案中，本申請?zhí)峁┑倪x育含有抗稻瘟病基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，其包括以下步驟：1)將輪回親本與供體植物進(jìn)行雜交，再將所得到的雜交種與輪回親本進(jìn)行回交，獲得回交一 代，利用正向選擇標(biāo)記Pi31和負(fù)向選擇標(biāo)記W068C06B、Pi2S122對其進(jìn)行抗稻瘟病基因組片段的單側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對其進(jìn)行背景選擇；2)選擇背景回復(fù)較好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過75％)與輪回親本再次進(jìn)行回交，獲得回交二代，利用正向選擇標(biāo)記Pi31對其進(jìn)行檢測，選擇含有抗稻瘟病基因組片段的重組單株，然后利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE6K，對其進(jìn)行背景選擇；3)選擇背景回復(fù)好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過87.5％)與輪回親本又一次進(jìn)行回交，獲得回交三代，利用正向選擇標(biāo)記Pi31和負(fù)向標(biāo)記W068C06B、Pi2S122對其進(jìn)行抗稻瘟病基因組片段的另一側(cè)同源重組片段篩選，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對其進(jìn)行背景選擇；以及4)選擇導(dǎo)入片段小，且背景回復(fù)好的重組單株(背景回復(fù)值超過93.75％)，將選中的重組單株自交一次，獲得自交種，利用正向選擇標(biāo)記Pi31對其進(jìn)行檢測，并利用水稻全基因組育種芯片，例如RICE60K，對其進(jìn)行背景選擇，最終獲得含抗稻瘟病基因組重組核酸片段純合且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過99％)的水稻植株。

在另一實(shí)施方案中，利用分子標(biāo)記對重組植株進(jìn)行前景選擇時(shí)采用的擴(kuò)增引物，包括：用于擴(kuò)增分子標(biāo)記Pi31的引物對，其中正向引物為5’-ATCCAAACCCGTTGTTGCAC-3’，反向引物為5’-CGGCAATTGCCACGATGATA-3’；用于擴(kuò)增分子標(biāo)記W068C06B的引物對，其中正向引物為5’-CCTATCGCTGACAAAGAG-3’，反向引物為5’-CACCCAGCCAGTTCATCTA-3’；以及用于擴(kuò)增分子標(biāo)記Pi2S122的引物對，其中正向引物為5’-GACTTGAAAACCAGTGCGTG-3’，反向引物為5’-CCTACCTAATGGAAAGGATTGC-3’。

又一方面，本申請?zhí)峁┝藱z測重組核酸片段的方法，其包括根據(jù)如前所述的重組核酸片段設(shè)計(jì)特異性引物，以待測基因組為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，并分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。具體地，例如，所述引物如前所述?？蛇x擇地，利用Sanger測序法分析PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。

具體而言，本申請?zhí)峁┑臋z測重組核酸片段的方法中，用于擴(kuò)增及檢測SEQ ID NO:1所示序列的引物組合如下：擴(kuò)增引物，包括正向引物：5’-ATTTTAGAGCCAGCAGTTAGATAC-3’，反向引物：5’-CTTAA AGGAAGTGAATACATACGG-3’；測序引物，包括正向引物：5’-TGCTCGGTAATTTGAGGTAA-3’，和反向引物：5’-TGTATGATAAGTGGGACCAG-3’。所述方法以待測樣品基因組DNA為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用上述測序引物對獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，若測序結(jié)果與SEQ ID NO:1序列一致或互補(bǔ)，則待測樣品中含有SEQ ID NO:1所示同源重組片段。

另外，在本申請?zhí)峁┑臋z測重組核酸片段的方法中，用于擴(kuò)增及檢測SEQ ID NO:2所示序列的引物組合如下：擴(kuò)增引物，包括正向引物：5’-ACAATAAAGGGAGCTGGGTGAT-3’，反向引物：5’-CATGATTACTTGCGAGCTGTCT-3’；測序引物，包括正向引物：5’-ACAATAAAGGGAGCTGGGTGAT-3’，和正向引物：5’-ATCAAGAGCGGGTGTACGAG-3’。所述方法以待測樣品基因組DNA為模板，利用上述擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后利用上述測序引物對獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，若測序結(jié)果與SEQ ID NO:2序列一致或互補(bǔ)，則待測樣品中含有SEQ ID NO:2所示同源重組片段。

通過檢測確定了待測樣品中含有SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

此外，本申請還提供了檢測重組核酸片段的試劑盒，其包括如前述的引物。

進(jìn)一步地，本申請還提供了篩選含有重組核酸片段的水稻植株或種子的方法，其包括檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段的步驟。在一實(shí)施方案中，采用如前所述的引物來檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在另一實(shí)施方案中，采用如前所述的檢測重組核酸片段的方法來檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。在又一實(shí)施方案中，采用如前所述的試劑盒來檢測待測水稻植株的基因組中是否含有如前所述的重組核酸片段。

在又一方面，本申請?zhí)峁┝送ㄟ^所述方法篩選得到的含有本申請公開的重組核酸片段的水稻植株或其種子。

本申請?zhí)峁┑幕谌蚪M選擇育種技術(shù)的選育含有抗稻瘟病基因組重組核酸片段的水稻植株的方法，具有快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定的優(yōu)勢。僅通過五世代轉(zhuǎn)育，即可僅將目標(biāo)基因組片段導(dǎo)入受體材料，并同時(shí)實(shí)現(xiàn)背景的回復(fù)。本申請改良的受體材料為‘HD9802S’，為水稻早秈型溫敏不育系。利用上述方法，可以在保留‘HD9802S’原有特性的情況下大幅度提高其稻瘟病抗性。同時(shí)，本申請?zhí)峁┑幕蚪M重組核酸片段與稻瘟病抗性緊密相關(guān)，可作為抗性資源應(yīng)用于其他品種的培育。

附圖說明

圖1為本申請實(shí)施例1中CR012600水稻RICE60K全基因組育種芯片檢測結(jié)果；其中，橫坐標(biāo)數(shù)字所指示方框依次表示水稻12條染色體，縱坐標(biāo)數(shù)字為水稻基因組上的物理位置[以兆堿基(Mb)為單位]，灰色線條代表受體親本‘HD9802S’基因型，黑色線條代表供體親本‘R6’基因型，白色線條代表兩親本基因型一致即無多態(tài)性區(qū)段。圖中第6號染色體黑色圓點(diǎn)處線條顯示區(qū)段即為導(dǎo)入的抗稻瘟病基因組重組核酸片段RecCR012600。

圖2為本申請實(shí)施例2中RecCR012600上游同源重組片段測序比對結(jié)果；圖中所示星號代表比對結(jié)果中相同堿基，圖中CR012600為獲得的新品系，HD9802S為受體親本‘HD9802S’，R6為供體親本‘R6’。

圖3為本申請實(shí)施例2中RecCR012600下游同源重組片段測序比對結(jié)果；圖中所示星號代表比對結(jié)果中相同堿基，圖中CR012600為獲得的新品系，HD9802S為受體親本‘HD9802S’，R6為供體親本‘R6’。

圖4為本申請實(shí)施例2中RecCR012600兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖；其中，(A)為上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖；(B)為下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖，上方堿基為供體‘R6’的SNP或InDel標(biāo)記，下方堿基為受體‘HD9802S’的SNP或InDel標(biāo)記?；疑珔^(qū)段為來源于‘HD9802S’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來源于‘R6’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段，橫坐標(biāo)為片段長度，以堿基對數(shù)目(bp)為單位。

圖5為本申請實(shí)施例3中CR012600稻瘟病抗性室內(nèi)鑒定結(jié)果； 圖中所示葉片依次為：(A)稻瘟病感病品種麗江新團(tuán)黑谷；(B)原品種‘HD9802S’；(C)改良新品系CR012600；(D)稻瘟病抗病品種谷梅4號。

具體實(shí)施方式

提供以下定義和方法用以更好地界定本申請以及在本申請實(shí)踐中指導(dǎo)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員。除非另作說明，術(shù)語按照相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法理解。

如本文所用，“核苷酸序列”包括涉及單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，核苷酸序列以5’至3’方向從左向右書寫，包括具有天然核苷酸基本性質(zhì)的已知類似物(例如，肽核酸)，所述類似物以與天然存在的核苷酸類似的方式與單鏈核酸雜交。

在一些實(shí)施方案中，可以對本申請的核苷酸序列進(jìn)行改變，以進(jìn)行保守氨基酸替換。在某些實(shí)施方案中，可以依照單子葉密碼子偏好性對本申請的核苷酸序列進(jìn)行不改變氨基酸序列的替換，例如可以用單子葉植物偏好的密碼子替換編碼同一氨基酸序列的密碼子，而不改變該核苷酸序列所編碼的氨基酸序列。

具體地，本申請涉及對SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2進(jìn)一步優(yōu)化所得的核苷酸序列。該方法的更多細(xì)節(jié)描述于Murray等(1989)Nucleic Acids Res.17:477-498。優(yōu)化核苷酸序列可用于提高抗稻瘟病基因組重組核酸片段在水稻中的表達(dá)。

在一些實(shí)施方案中，本申請還涉及SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的變體。一般來講，特定核苷酸序列的變體將與該特定核苷酸序列具有至少約70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％或更高的序列同一性，或以上的互補(bǔ)序列。這樣的變體序列包括一個(gè)或多個(gè)核酸殘基的添加、缺失或替換，從而可以導(dǎo)致相應(yīng)的氨基酸殘基的添加、移除或替換。通過本領(lǐng)域內(nèi)已知的序列比對程序包括雜交技術(shù)確定序列同一性。實(shí)施方案的核苷酸序列變體與本申請 的序列的差異可以少至1-15個(gè)核苷酸、少至1-10個(gè)(例如6-10個(gè))，少至5個(gè)，少至4、3、2或甚至1個(gè)核苷酸。

本申請還涉及包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列中特定位點(diǎn)的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列，例如，包含SEQ ID NO:1所示序列的401-484位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列，或者包含SEQ ID NO:2所示序列的194-420位核苷酸的序列或其片段或其變體或其互補(bǔ)序列。根據(jù)包含上述特定位點(diǎn)的片段，能夠特異性地鑒定出相應(yīng)的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列。進(jìn)一步地，通過鑒定出含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示序列的重組核酸片段，即可確定待測樣品中包含含有抗性基因的重組核酸片段。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植株并包括可以與水稻育種的所有植物品種。如本文所用，“植株”或“植物”，包括整株植物、植物細(xì)胞、植物器官、植物原生質(zhì)體、植物可以從中再生的植物細(xì)胞組織培養(yǎng)物、植物愈傷組織、植物叢和植物或植物部分中完整的植物細(xì)胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果實(shí)、莖桿、根、根尖、花藥等。

在本申請的方法可以適用于任何需要選育的水稻品種。也就是說，可以將任何缺少某種有利性狀的優(yōu)良品種(即綜合性狀較好，預(yù)計(jì)有發(fā)展前途的品種)用作輪回親本。用另一具有該受體所缺少的有利性狀的品種作為供體親本，并且所提供的有利性狀最好是顯性單基因控制的。在本申請的實(shí)施方案中，采用水稻‘HD9802S’作為輪回親本，采用已被證實(shí)具有良好的稻瘟病抗性的水稻‘R6’作為供體。

在本申請所提供的重組植株的選育方法中，利用分子標(biāo)記對重組植株進(jìn)行前景選擇。前景選擇的可靠性主要取決于標(biāo)記與目標(biāo)基因間連鎖的緊密程度，為提高選擇的準(zhǔn)確率，一般同時(shí)用兩側(cè)相鄰的兩個(gè)標(biāo)記對目標(biāo)基因進(jìn)行跟蹤選擇。

在本申請的實(shí)施方案中，采用的前景選擇標(biāo)記包括正向選擇標(biāo)記和負(fù)向選擇標(biāo)記。在具體實(shí)施方案中，經(jīng)優(yōu)化篩選使用的正向前景選擇標(biāo)記是與目標(biāo)基因組片段緊密連鎖的標(biāo)記Pi31，負(fù)向選擇標(biāo)記是位于目標(biāo)片段上游的標(biāo)記W068C06B，以及位于目標(biāo)片段下游的標(biāo)記 Pi2S122。

在本申請的實(shí)施方案中，利用上述前景選擇標(biāo)記進(jìn)行同源重組的檢測時(shí)，一側(cè)或單側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是Pi31檢出與‘R6’相同帶型，且W068C06B或Pi2S122檢出與‘HD9802S’相同帶型；兩側(cè)或雙側(cè)同源重組的判斷標(biāo)準(zhǔn)是Pi31檢出與‘R6’相同帶型，且W068C06B和Pi2S122檢出與‘HD9802S’相同帶型。

在本申請中，可以使用任何一種可利用的芯片進(jìn)行本申請所提供的育種方法中的背景選擇。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，可以采用本申請人在中國專利申請CN102747138A中公開的水稻全基因組育種芯片RICE6K，或者在PCT國際申請WO/2014/121419中公開的水稻全基因組育種芯片RICE60K。這兩份申請文件中的全部內(nèi)容整體并入本文作為參考。

以下實(shí)施例僅用于說明而非限制本申請范圍的目的。若未特別指明，實(shí)施例均按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件，如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(Sambrook J & Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。

本申請中所使用的水稻植株材料信息均可參見中國水稻品種及其系譜數(shù)據(jù)庫(http://www.ricedata.cn/variety/index.htm)。

本申請中所提到的水稻基因組物理位置均參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版(http://rice.plantbiology.msu.edu/)。

實(shí)施例1 選育導(dǎo)入抗稻瘟病基因組片段的重組植株

本實(shí)施例中使用的材料為水稻‘HD9802S’及水稻‘R6’。

水稻‘R6’具有良好的稻瘟病抗性，并推測可能是第6號染色體的Pi2、Pi9和Pigm所在的基因簇區(qū)域?qū)υ摬牧系牡疚敛】剐云鸬搅岁P(guān)鍵作用。

在重組植株的選育過程中，利用分子標(biāo)記對重組植株進(jìn)行前景選擇，對所采用的前景選擇分子標(biāo)記進(jìn)行了篩選。參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版，下載第6染色體9,559,000至10,990,000DNA序列。使用SSRLocator軟件對上述序列中的SSR位點(diǎn)進(jìn)行掃描。 利用Primer Premier 3.0軟件對尋找出的SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，共設(shè)計(jì)引物162對。通過PCR的方法，篩選上述引物對在‘R6’及‘HD9802S’中的多態(tài)性，最終挑選出在兩份材料中具有多態(tài)性、擴(kuò)增效率高的前景選擇分子標(biāo)記，分別是正向選擇標(biāo)記Pi31和負(fù)向選擇標(biāo)記W068C06B、Pi2S122。用于PCR擴(kuò)增上述分子標(biāo)記的具體引物信息見表1。

表1 前景選擇分子標(biāo)記引物信息

將水稻‘R6’中前述基因簇所在的基因組片段導(dǎo)入到水稻‘HD9802S’中，具體過程如下：

以‘HD9802S’為輪回親本，‘R6’為供體親本進(jìn)行雜交，將所得到的雜交種與輪回親本‘HD9802S’進(jìn)行回交，獲得BC₁F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記Pi31和負(fù)向選擇標(biāo)記W068C06B、Pi2S122進(jìn)行重組單株選擇，篩選出24個(gè)在目標(biāo)基因組DNA片段一側(cè)同源重組的單株，即Pi31檢出與‘R6’相同帶型，且W068C06B或Pi2S122檢出與‘HD9802S’相同帶型，并利用水稻全基因組育種芯片RICE6K(CN102747138A)對其進(jìn)行背景選擇(Yu等,Plant Biotechnology Journal.2014,12:28-37)。

在篩選出的24個(gè)單側(cè)同源重組單株中比較芯片結(jié)果，選擇背景回復(fù)最好的重組單株(此世代背景回復(fù)值超過75％)，使其與輪回親本‘HD9802S’再次進(jìn)行回交，獲得BC₂F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記Pi31對其進(jìn)行檢測，選擇含有目標(biāo)基因組DNA片段的重組單株，即Pi31檢出與‘R6’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE6K對其進(jìn)行背景選擇。

選擇背景回復(fù)較好的單株(此世代背景回復(fù)值超過87.5％)，使其與 輪回親本‘HD9802S’又一次進(jìn)行回交，獲得BC₃F₁種子，育苗后利用正向選擇標(biāo)記Pi31和負(fù)向標(biāo)記W068C06B、Pi2S122對收獲的種子進(jìn)行目標(biāo)基因組DNA片段另一側(cè)同源重組片段的篩選，獲得24個(gè)在目標(biāo)片段兩側(cè)重組的單株，即Pi31檢出與‘R6’相同帶型，且W068C06B和Pi2S122檢出與‘HD9802S’相同帶型。

利用水稻全基因組育種芯片RICE60K(WO/2014/121419)對上述24個(gè)雙側(cè)交換單株進(jìn)行背景和目標(biāo)片段選擇(Chen等，Molecular Plant.2014,7:541-553)，篩選到導(dǎo)入目標(biāo)片段較小，且背景回復(fù)好的目標(biāo)單株一個(gè)(此世代背景回復(fù)值超過93.75％)。

將選中的單株自交一次，獲得BC₃F₂，育苗后利用正向選擇標(biāo)記Pi31對其進(jìn)行檢測，選擇含有目標(biāo)基因組DNA片段的單株，即Pi31檢出與‘R6’相同帶型，利用水稻全基因組育種芯片RICE60K對其進(jìn)行背景選擇。

最終獲得目標(biāo)片段純合，且背景回復(fù)(背景回復(fù)值超過99％)的株系一個(gè)，命名為CR012600。芯片檢測結(jié)果見圖1。

因‘HD9802S’為兩系不育系，在上述過程中的BC₁F₁、BC₂F₁、BC₃F₁及BC₃F₂世代入選單株均為不育單株，采取了以下辦法實(shí)現(xiàn)不育單株的育性轉(zhuǎn)化以回交或自交：當(dāng)不育單株進(jìn)入生殖期4期時(shí)，在低溫處理區(qū)(21-23℃)處理10天左右，可利用植物人工氣候箱、植物生長室、冷水浸灌池等；使用碘-碘化鉀染色法對抽出穗的花粉進(jìn)行育性鑒定，判定70％以上花粉可育的穗為育性成功轉(zhuǎn)化穗，隨即開展回交或自交。

實(shí)施例2 導(dǎo)入稻瘟病抗性基因組片段后同源重組片段的確定

為了確定導(dǎo)入的稻瘟病抗性基因組片段大小，對‘HD9802S’導(dǎo)入片段的純合單株進(jìn)行了目標(biāo)基因組片段兩側(cè)同源重組片段的測序。將CR012600所含的抗稻瘟病基因組重組核酸片段命名為RecCR012600。

通過水稻全基因組育種芯片RICE60K檢測結(jié)果初步確定，RecCR012600位于兩個(gè)SNP標(biāo)記R0610084130TG和R0610454932GA 之間。

同時(shí)，使用Miseq測序技術(shù)對‘HD9802S’、‘R6’和CR012600三個(gè)樣本進(jìn)行全基因組測序。使用TruSeq Nano DNA LT Kit(illumina)試劑盒進(jìn)行文庫建立，使用Library Quantification Kit–Universal(KAPA Biosystems)試劑盒進(jìn)行定量，使用MiSeq V2 Reagent Kit(illumina)試劑盒進(jìn)行測序反應(yīng)。使用Miseq臺式測序儀(illumina)進(jìn)行檢測。具體步驟及方法參見各試劑盒及測序儀使用說明書。

根據(jù)前述SNP芯片及Miseq測序結(jié)果，將RecCR012600上游同源重組片段定位在第6染色體的10087890bp到10090109bp區(qū)間，下游同源重組片段定位于10446963bp到10448996bp區(qū)間。

在此基礎(chǔ)上，參照水稻日本晴基因組MSU/TIGR注釋第6.1版，下載對應(yīng)區(qū)段DNA序列。使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增及測序引物，設(shè)計(jì)要求為引物長22nt左右、GC含量40-60％且沒有錯配。

以受體親本‘HD9802S’和供體親本‘R6’為對照，對RecCR012600上游和下游同源重組片段分別設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，使用高保真酶KOD FX Neo(TOYOBO)進(jìn)行擴(kuò)增，使用兩步法或三步法尋找最佳擴(kuò)增條件，確保擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳檢測中顯示為單一明亮條帶。其中確定的上游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃180sec，37個(gè)循環(huán)；20℃1min。下游同源重組片段擴(kuò)增引物反應(yīng)條件為：94℃2min；98℃10sec，61℃30sec，68℃180sec，37個(gè)循環(huán)；20℃1min。由此，最終各篩選出一對擴(kuò)增引物用于上游和下游同源重組片段的擴(kuò)增。

另外，以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用Sanger測序法進(jìn)行測序，根據(jù)實(shí)際測序效果，最終各篩選出2條測序引物分別用于上游和下游同源重組片段的測序。具體的擴(kuò)增引物及測序引物序列見表2，測序結(jié)果見圖2和圖3。

RecCR012600上游同源重組片段測序長度為649bp(SEQ ID NO:1)。1-401bp為受體‘HD9802S’的基因組區(qū)段，與供體‘R6’比較，存在15個(gè)SNP，1個(gè)Indel。402-483bp這一82bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。484-649bp為供體‘R6’基因組片段，與‘HD9802S’比較， 存在6個(gè)SNP。

RecCR012600下游同源重組片段測序長度為852bp(SEQ ID NO:2)。1-194bp為供體‘R6’的基因組區(qū)段，與‘HD9802S’比較，存在2個(gè)SNP，1個(gè)Indel。195-419bp這一225bp區(qū)段為同源重組區(qū)段。420-852bp為受體‘HD9802S’的基因組區(qū)段，與供體‘R6’比較，存在6個(gè)SNP。

圖4為RecCR012600兩側(cè)同源重組片段的結(jié)構(gòu)圖。其中，(A)為上游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖；(B)為下游同源重組片段結(jié)構(gòu)圖。上方堿基為供體‘R6’的SNP或InDel標(biāo)記，下方堿基為受體‘HD9802S’的SNP或InDel標(biāo)記。灰色區(qū)段為來源于‘HD9802S’基因組區(qū)段，黑色區(qū)段為來源于‘R6’基因組區(qū)段，白色區(qū)段為同源重組區(qū)段。橫坐標(biāo)為片段長度，以堿基對數(shù)目(bp)為單位。

表2 抗稻瘟病基因組重組核酸片段擴(kuò)增及測序引物信息

實(shí)施例3 ‘HD9802S’導(dǎo)入抗稻瘟病基因組片段后的抗性鑒定

為了鑒定抗性效果，對本申請選育的新品系CR012600、輪回親本‘HD9802S’、稻瘟病抗病品種谷梅4號(作為陽性對照)，以及稻瘟病感病品種麗江新團(tuán)黑谷(作為陰性對照)進(jìn)行室內(nèi)種植，將其培養(yǎng)至3-4葉期后采用如下方法進(jìn)行鑒定：

選取2015年從湖北宜昌病圃稻瘟病病樣上分離的M15Bb-1-1、M15Bb-1-2、M15Bb-2-1、M15Bb-3-1、M15Bb-4-1、M15Bb-5-1和M15Bb-6-1，共7株稻瘟病菌株作為接種菌株。菌株采用高粱粒法-20℃ 保存，使用前將保存的高粱粒取出至馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)平板活化(PDA：去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉15g，蒸餾水定容至1L)，28℃光照培養(yǎng)5天后取直徑5mm的新鮮菌絲塊轉(zhuǎn)接至高粱粒培養(yǎng)基中(高粱粒500g加入1.5L蒸餾水，煮至沸騰后濾去液體，將高粱粒撈出裝入250ml三角瓶，100ml/瓶，濕熱滅菌20分鐘)，10塊/瓶，接菌2天后每天將高粱粒搖散，28℃黑暗培養(yǎng)至菌絲長滿高粱粒。然后將高粱粒攤在無菌紗布上，蓋上無菌的潮濕紗布，在25℃，RH≥95％，12h光照條件下培養(yǎng)4-5天至大量孢子產(chǎn)生，用無菌水(含0.02％吐溫20)洗下孢子，等孢子量混合接種菌株，調(diào)整濃度至5×10⁵個(gè)/ml。

用混合分生孢子懸浮液噴霧接種CR012600、‘HD9802S’、谷梅4號及麗江新團(tuán)黑谷，接種三個(gè)重復(fù)。接種后罩上透明罩子，28℃黑暗培養(yǎng)24h，然后16h光照培養(yǎng)5天后調(diào)查。

調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)為0級(高抗，HR)：沒有癥狀；1級(抗，R)：很小的褐色病斑；2級(中抗，MR)：直徑約為1mm的褐色病斑；3級(MS，中感)：直接約為2-3mm的帶圓形病斑，中央灰白色，邊緣褐色；4級(感，S)：長約1-3cm的橢圓形病斑，中央灰白色，邊緣褐色；5級(高感，HS)：長且寬的大橢圓形病斑，病斑融合成片，至葉片枯死。其中0-2級為抗病，3-5級為感病。接種結(jié)果見表3和圖5。

表3 接種稻瘟菌后的抗性表現(xiàn)

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對本申請作了詳盡的描述，但在本申請基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本申請精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本申請要求保護(hù)的范圍。