本發(fā)明涉及受檸檬酸鈉誘導(dǎo)的啟動子。

背景技術(shù)：

在利用基因工程菌株表達(dá)目標(biāo)蛋白時，目標(biāo)都是希望以盡可能高的效率來產(chǎn)出多的目的蛋白，許多因素可以影響蛋白的產(chǎn)量，例如啟動子活性、翻譯效率、蛋白糖基化、目標(biāo)基因的拷貝數(shù)以及菌株自身蛋白酶的降解能力，其中以啟動子轉(zhuǎn)錄水平的高低影響最為關(guān)鍵。

啟動子是與rna聚合酶結(jié)合的一段dna序列，參與特定基因轉(zhuǎn)錄及調(diào)控，包含核心啟動子區(qū)域和調(diào)控區(qū)域，核心啟動子區(qū)域產(chǎn)生基礎(chǔ)水平的轉(zhuǎn)錄，調(diào)控區(qū)域能夠?qū)Σ煌沫h(huán)境條件做出應(yīng)答，對基因的轉(zhuǎn)錄水平做出相應(yīng)的調(diào)節(jié)。

曲霉中已有許多強(qiáng)啟動活性的啟動子被鑒定并分離出來，包括組成型啟動子和誘導(dǎo)型啟動子兩類，組成型啟動子是一類無需在培養(yǎng)基中添加任何誘導(dǎo)物便可自發(fā)調(diào)控結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行表達(dá)的啟動子，曲霉蛋白表達(dá)中最常見的組成型啟動子有構(gòu)巢曲霉甘油醛－3－磷酸脫氫酶gpda啟動子，泡盛曲霉谷氨酸脫氫酶gdha啟動子等〔雷達(dá)，許楊等，曲霉屬蛋白表達(dá)中高效啟動子的應(yīng)用研究[j]，食品工業(yè)科技，2013，34(13)：342－345〕，但組成型啟動子調(diào)控下菌體生長和目的蛋白的表達(dá)同時進(jìn)行，所以往往伴隨著效率不高的問題。誘導(dǎo)型啟動子則是另外一種可以受誘導(dǎo)物調(diào)控表達(dá)的啟動子，黑曲霉的葡糖淀粉酶基因glaa啟動子和米曲霉的淀粉酶taka啟動子是目前曲霉表達(dá)系統(tǒng)中使用率最高的誘導(dǎo)型啟動子，但這些啟動子通常需要大量添加淀粉、糊精或麥芽糖等碳源來誘導(dǎo)表達(dá)，使得培養(yǎng)基粘度大大提高，影響溶氧和后處理工藝。

檸檬酸鈉，又稱枸櫞酸鈉，是一種有機(jī)化合物，外觀為白色到無色晶體。根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)、食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》(gb2760-2011)規(guī)定：可在各類食品中按生產(chǎn)需要適量使用的食品添加劑。

檸檬酸鈉主要由淀粉類物質(zhì)經(jīng)發(fā)酵生成檸檬酸，再跟堿類物質(zhì)中和而產(chǎn)生，具有以下優(yōu)良性能：(1)安全無毒性能。由于制備檸檬酸鈉的原料基本來源于糧食，因而絕對安全可靠，對人類健康不會產(chǎn)生危害。聯(lián)合國糧農(nóng)與世界衛(wèi)生組織對其每日攝入量不作任何限制，可認(rèn)為該品屬于無毒品。(2)具有生物降解性。檸檬酸鈉經(jīng)自然界大量的水稀釋后，部分變成檸檬酸，兩者共存于同一體系中。檸檬酸在水中經(jīng)氧、熱、光、細(xì)菌以及微生物的作用，很容易發(fā)生生物降解。(3)具有金屬離子絡(luò)合能力。檸檬酸鈉對ca²⁺、mg²⁺等金屬離子具有良好的絡(luò)合能力。(4)極好的溶解性能，并且溶解性隨水溫升高而增加。(5)具有良好的ph調(diào)節(jié)及緩沖性能。檸檬酸鈉是一種弱酸強(qiáng)堿鹽，與檸檬酸配伍可組成較強(qiáng)的ph緩沖劑，因此在某些不適宜ph大范圍變化的場合有其重要用處。另外，檸檬酸鈉還具有優(yōu)良的緩凝性能及穩(wěn)定性能。

檸檬酸鈉具有上述多種優(yōu)良的性能，使得其具有十分廣泛的用途。檸檬酸鈉無毒性、具有ph調(diào)節(jié)性能及良好的穩(wěn)定性，因此可用于食品工業(yè)。檸檬酸鈉用作食品添加劑，需求量最大，主要用作調(diào)味劑、緩沖劑、乳化劑、膨脹劑、穩(wěn)定劑和防腐劑等；另外，檸檬酸鈉同檸檬酸配伍，用作各種果醬、果凍、果汁、飲料、冷飲、奶制品和糕點(diǎn)等的膠凝劑、營養(yǎng)增補(bǔ)劑及風(fēng)味劑〔張英，周長民，檸檬酸鈉的特性與應(yīng)用[j]，遼寧化工，2007.5，36(5):350－352〕。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種核酸分子，含有選自以下的多核苷酸序列：

(1)seqidno:1－4中任一所示的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互補(bǔ)序列。

本發(fā)明還提供一種核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明所述的核酸分子作為該核酸構(gòu)建體的啟動子序列。

在某些實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體還含有多克隆位點(diǎn)或至少一個酶切位點(diǎn)，翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，3’轉(zhuǎn)錄終止子，3’多聚核苷酸化信號，轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列，抗性選擇標(biāo)記，增強(qiáng)子或操作子中的任一個、任意數(shù)個或全部。

在某些實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體是表達(dá)載體。

在某些實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體還含有感興趣的基因，與所述啟動子序列操作性連接。

在某些實(shí)施方案中，所述感興趣的基因選自脂肪酶基因、蛋白酶基因、酯酶基因、淀粉酶基因、果膠酶基因、植酸酶基因、糖化酶基因、漆酶基因、單寧酶基因、半乳糖苷酶基因、葡聚糖酶基因、阿拉伯呋喃糖苷酶基因、氨基肽酶基因、多聚半乳糖醛酸酶基因、過氧化氫酶基因、菊糖酶基因、木聚糖酶基因、凝乳酶基因、葡糖氧化酶基因、普魯蘭酶基因、乳糖酶基因、天門冬酰胺酶基因、脫氨酶基因、磷脂酶基因和纖維素酶基因。

在某些實(shí)施方案中，所述感興趣的基因?yàn)閬碜越z狀真菌，如黑曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、里氏木霉、土曲霉、米黑根毛霉等的脂肪酶基因。

本發(fā)明還提供遺傳工程化的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供一種遺傳工程化的絲狀真菌，該絲狀真菌轉(zhuǎn)化有本發(fā)明的核酸構(gòu)建體表達(dá)載體。

在某些實(shí)施方案中，所述絲狀真菌選自：黑曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、里氏木霉、土曲霉和米黑根毛霉。

本發(fā)明還提供一種減少絲狀真菌發(fā)酵中淀粉、糊精或麥芽糖等碳源的使用量的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的絲狀真菌進(jìn)行發(fā)酵。

本發(fā)明還提供一種絲狀真菌發(fā)酵方法，所述方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加檸檬酸鈉作為誘導(dǎo)劑發(fā)酵本發(fā)明的絲狀真菌。

本發(fā)明還包括本發(fā)明核酸分子和核酸構(gòu)建體在減少絲狀真菌發(fā)酵中碳源，如淀粉、糊精或麥芽糖的使用量中的用途。

本發(fā)明也包括檸檬酸鈉在誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)中的用途，尤其是在權(quán)利要求1所述的核酸分子調(diào)控的目的蛋白的表達(dá)中作為誘導(dǎo)物的用途

附圖說明

圖1顯示啟動子驗(yàn)證表達(dá)載體示意圖。

圖2顯示脂肪酶活力測定方法流程示意圖。

圖3顯示啟動子活力檢測柱形圖。

圖4顯示啟動子誘導(dǎo)效果柱形圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明從黑曲霉(aspergillusniger)中分離得到可作為啟動子使用的核酸序列。使用檸檬酸鈉可誘導(dǎo)本發(fā)明的啟動子表達(dá)。

如本文所用，“啟動子”指一種核酸序列，其通常存在于目的基因編碼序列的上游(5’端)，能夠引導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄為mrna。一般地，啟動子區(qū)提供rna聚合酶和正確起始轉(zhuǎn)錄所必需的其它因子的識別位點(diǎn)。如本文所用，“分離的”是指物質(zhì)從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質(zhì)，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細(xì)胞內(nèi)的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質(zhì)中分開，則為分離純化的。

本發(fā)明的核酸分子的多核苷酸序列如seqidno:1－4中任一條所示。此外，本發(fā)明還包括上述核酸分子的一些具有相同功能的變異體。包括：

在嚴(yán)格條件下能與seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4所示的多核苷酸序列雜交，優(yōu)選在嚴(yán)格條件下雜交，且能指導(dǎo)目的基因表達(dá)的核酸分子；

與seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4所示的多核苷酸序列有80％以上，優(yōu)選至少85％以上，優(yōu)選至少90％以上，優(yōu)選至少95％以上，優(yōu)選至少96％以上，優(yōu)選至少97％以上，優(yōu)選至少98％以上，或優(yōu)選至少99％以上的同一性，且能指導(dǎo)目的基因功能的核酸分子；和

與seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4所示的多核苷酸序列互補(bǔ)(優(yōu)選完全互補(bǔ))的核酸分子。

在本發(fā)明中，“嚴(yán)格條件”是指：(1)在較低離子強(qiáng)度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×ssc，0.1％sds，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的同一性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的核酸也具有指導(dǎo)目的基因高水平表達(dá)的功能。

可采用常規(guī)的技術(shù)確定序列之間的序列同一性，例如通過ncbi網(wǎng)站上提供的序列比對軟件(nucleotideblast)等確定序列之間的同一性。

優(yōu)選的是，所述變異體的突變發(fā)生在啟動子的調(diào)控區(qū)域，例如可通過插入或刪除調(diào)控區(qū)域，或?qū)φ{(diào)控區(qū)域進(jìn)行隨機(jī)或定點(diǎn)突變等來獲得。換言之，本發(fā)明也包括在seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4所示的多核苷酸序列的基礎(chǔ)上進(jìn)行一個、數(shù)個或數(shù)十個(例如100個以內(nèi)，或者80個以內(nèi)，或60個以內(nèi)，或50個以內(nèi)，或40個以內(nèi)，或30個以內(nèi)，或20個以內(nèi)，或15個以內(nèi)，或10個以內(nèi)，或5個以內(nèi))的堿基刪除或突變而獲得的保留了啟動子指導(dǎo)目的基因表達(dá)的功能的seqidno:1、seqidno:2、seqidno:3或seqidno:4的變異體。

本發(fā)明也包括seqidno：1-4的長例如15～50個堿基的片段，更優(yōu)選長15～30個堿基的片段。

本發(fā)明的啟動子可以被操作性連接到目的基因上。如本文所用，“操作性連接”指兩個或多個核酸區(qū)域或核酸序列的功能性的空間排列。例如：啟動子被置于相對于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的轉(zhuǎn)錄受到該啟動子區(qū)域的引導(dǎo)，從而，啟動子被“操作性連接”到該核酸序列上。

該目的基因相對于啟動子而言可以是外源(異源)的。適用于本發(fā)明的目的基因通?？梢允侨魏魏怂嵝蛄?如一種結(jié)構(gòu)性核酸序列)，優(yōu)選是編碼具有特定功能的蛋白，例如某些具有重要特性或功能的蛋白。

本發(fā)明感興趣的目的基因包括但不限于本領(lǐng)域周知的各種功能蛋白的編碼基因，尤其是本領(lǐng)域常在微生物(例如絲狀真菌)中表達(dá)、生產(chǎn)的蛋白的編碼基因，包括各種酶的編碼基因。因此，感興趣的目的基因包括但不限于脂肪酶基因、蛋白酶基因、酯酶基因、淀粉酶基因、果膠酶基因、植酸酶基因、糖化酶基因、漆酶基因、單寧酶基因、半乳糖苷酶基因、葡聚糖酶基因、阿拉伯呋喃糖苷酶基因、氨基肽酶基因、多聚半乳糖醛酸酶基因、過氧化氫酶基因、菊糖酶基因、木聚糖酶基因、凝乳酶基因、葡糖氧化酶基因、普魯蘭酶基因、乳糖酶基因、天門冬酰胺酶基因、脫氨酶基因、磷脂酶基因和纖維素酶基因等。

這些感興趣的基因可以來自不同的物種來源，包括真核生物和原核生物。在某些實(shí)施方案中，所述感興趣的基因優(yōu)選為脂肪酶基因和磷脂酶基因。例如，所述感興趣的基因是來自絲狀真菌，如黑曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、里氏木霉、土曲霉、米黑根毛霉等的脂肪酶基因，如來自米黑根毛霉的脂肪酶基因。

因此，本發(fā)明也提供一種核酸構(gòu)建體，該核酸構(gòu)建體含有本發(fā)明的啟動子。優(yōu)選的是，該核酸構(gòu)建體還含有：在所述啟動子的下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個酶切位點(diǎn)，翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，3’轉(zhuǎn)錄終止子，3’多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列，抗性選擇標(biāo)記，增強(qiáng)子或操作子中的任一個、任意數(shù)個或全部。

當(dāng)需要表達(dá)目的基因時，將目的基因連接入適合的多克隆位點(diǎn)或酶切位點(diǎn)內(nèi)，從而將目的基因與啟動子可操作地連接。因此，在一個具體實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸構(gòu)建體還包括感興趣的目的基因，本發(fā)明的啟動子能指導(dǎo)所述感興趣的目的基因在宿主細(xì)胞中表達(dá)。

合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列是由宿主細(xì)胞識別以終止轉(zhuǎn)錄的序列。終止子序列與感興趣的目的基因的3′末端操作性連接。在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。

例如，用于細(xì)菌宿主的優(yōu)選終止子可以是來自t7噬菌體的終止子。

用于絲狀真菌宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲得自米曲霉taka淀粉酶、黑曲霉葡萄糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

用于酵母宿主細(xì)胞的優(yōu)選終止子獲得自釀酒酵母烯醇酶、釀酒酵母細(xì)胞色素c、釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶、巴斯德畢赤酵母醇氧化酶基因等。

核酸構(gòu)建體還可包括合適的前導(dǎo)序列，前導(dǎo)序列與感興趣的目的基因的5′末端操作性連接。在選擇的宿主細(xì)胞中有功能的任何終止子都可用于本發(fā)明。

核酸構(gòu)建體還可包括信號肽編碼區(qū)，該編碼區(qū)編碼的氨基酸序列與感興趣的目的基因編碼的多肽的氨基酸末端連接并指導(dǎo)該編碼的多肽進(jìn)入細(xì)胞分泌途徑。感興趣的目的基因的5′端可固有地包含信號肽編碼區(qū)，或者也可使用外源的信號肽編碼區(qū)。外來的信號肽編碼區(qū)可簡單地替換天然的信號肽編碼區(qū)以增強(qiáng)多肽的分泌。指導(dǎo)表達(dá)的多肽進(jìn)入選擇的宿主細(xì)胞的分泌途徑的任何信號肽編碼區(qū)，即分泌進(jìn)入培養(yǎng)基，都可用于本發(fā)明。

本發(fā)明的核酸構(gòu)建體優(yōu)選為表達(dá)載體。術(shù)語“表達(dá)載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、病毒或其他載體。質(zhì)?？梢允蔷€性或閉合的環(huán)形質(zhì)粒?？傊?，只要其能夠在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都是可以被采用的。載體的選擇一般取決于載體與其中被導(dǎo)入該載體的宿主細(xì)胞的相容性。

表達(dá)載體一般包括(從5’到3’方向)：引導(dǎo)目的基因轉(zhuǎn)錄的啟動子和目的基因。如果需要，所述的重組載體還可以包括：在所述啟動子的下游包含多克隆位點(diǎn)或至少一個酶切位點(diǎn)，翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)，3’轉(zhuǎn)錄終止子，3’多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列，抗性選擇標(biāo)記，增強(qiáng)子或操作子。目的基因連接入所述適合的多克隆位點(diǎn)或酶切位點(diǎn)內(nèi)，從而將目的基因與啟動子可操作地連接。

本領(lǐng)域常用的各種翻譯起始用的核糖體結(jié)合位點(diǎn)、3’多聚核苷酸化信號，其它非翻譯核酸序列，轉(zhuǎn)運(yùn)和靶向核酸序列，抗性選擇標(biāo)記，增強(qiáng)子或操作子都可用于本發(fā)明。

載體可以是自主復(fù)制的載體，即作為染色體外實(shí)體存在，其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的載體，例如質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體或人工染色體。載體可包含用于保證自我復(fù)制的任何方式。備選地，載體可以是當(dāng)被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時，整合到基因組中并且與其已經(jīng)被整合進(jìn)入的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可使用一起包含將被導(dǎo)入宿主細(xì)胞基因組的總dna的單個載體或質(zhì)?；騼蓚€或多個載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。

本發(fā)明的載體優(yōu)選包含一個或多個容許容易選擇轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等細(xì)胞的可選擇標(biāo)記。可選擇的標(biāo)記是基因，其產(chǎn)物提供對抗生素或病毒的抗性、對重金屬的抗性、原養(yǎng)型至營養(yǎng)缺陷型等。

本發(fā)明的載體優(yōu)選包含容許該載體整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組或該載體在細(xì)胞中獨(dú)立于基因組自主個復(fù)制的元件。

表達(dá)載體可含有一個以上拷貝的感興趣的目的基因，以增加該基因產(chǎn)物的產(chǎn)量。目的基因拷貝數(shù)的增加可通過將至少一個附加拷貝的序列整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組或通過包括可擴(kuò)增的選擇標(biāo)記基因和該目的基因來獲得，其中包含擴(kuò)增拷貝的選擇標(biāo)記基因并且由此包含附加拷貝目的基因的細(xì)胞可通過在存在適當(dāng)?shù)倪x擇劑時培養(yǎng)該細(xì)胞來篩選。

用于制備重組表達(dá)載體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括體外重組dna技術(shù)、dna合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等。

作為表達(dá)載體的一個例子，本發(fā)明使用ncbi序列號為fj868795.1的表達(dá)載體構(gòu)建了含有本發(fā)明啟動子序列的表達(dá)載體。因此，應(yīng)理解的是，除fj868795.1所含的米黑根毛霉脂肪酶(rml)基因外，本發(fā)明可使用其它感興趣的基因替換該基因，從而以該表達(dá)載體為骨架，骨架含有本發(fā)明啟動子序列和不同感興趣基因的表達(dá)載體。

本發(fā)明也涉及經(jīng)本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組宿主細(xì)胞?？刹捎帽绢I(lǐng)域周知的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如接種市售的轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)化。

宿主細(xì)胞可以是單細(xì)胞微生物或非單細(xì)胞微生物。單細(xì)胞微生物例如革蘭氏陽性細(xì)菌，包括但不限于芽孢桿菌細(xì)胞，例如，嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和蘇云金芽孢桿菌等；或鏈霉菌細(xì)胞，例如錢青紫鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌，例如大腸桿菌和假單胞菌屬。在優(yōu)選的方面，細(xì)菌宿主是枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、地衣芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和大腸桿菌細(xì)胞。

宿主細(xì)胞也可以是真核生物的細(xì)胞，例如來自哺乳動物、昆蟲、植物、酵母或真菌的細(xì)胞。

在優(yōu)選的方面，本發(fā)明提供遺傳工程化的絲狀真菌，如黑曲霉、米曲霉、構(gòu)巢曲霉、里氏木霉、土曲霉、米黑根毛霉等。所述絲狀真菌經(jīng)轉(zhuǎn)化含有本發(fā)明的表達(dá)載體。轉(zhuǎn)化的方法為本領(lǐng)域常規(guī)的轉(zhuǎn)化方法。作為一個示范性的例子，本申請的實(shí)施例5提供了將本發(fā)明表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到絲狀真菌，具體是黑曲霉中的具體方法。但應(yīng)理解，本發(fā)明并不僅限于該方法。

本發(fā)明還提供一種減少絲狀真菌發(fā)酵中碳源，如淀粉、糊精或麥芽糖等碳源的使用量的方法，所述方法包括使用本發(fā)明的絲狀真菌進(jìn)行發(fā)酵，并添加檸檬酸鈉作為誘導(dǎo)劑。

本發(fā)明還提供一種絲狀真菌發(fā)酵方法，所述方法包括在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加檸檬酸鈉作為誘導(dǎo)劑發(fā)酵本發(fā)明的絲狀真菌。

檸檬酸鈉的添加量可根據(jù)實(shí)際的發(fā)酵情況(例如用于發(fā)酵的真菌、發(fā)酵的培養(yǎng)基等)確定，通常占所用培養(yǎng)基重量的1～10％，如1～5％。

本發(fā)明因此也包括檸檬酸鈉在誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)中的用途，包括作為誘導(dǎo)型啟動子的誘導(dǎo)物中的用途。所述誘導(dǎo)型啟動子包括但不限于本文所述的核酸分子，更優(yōu)選為seqidno：1-4任一所示的核酸分子。因此，本發(fā)明尤其包括檸檬酸鈉在本發(fā)明核酸分子(如seqidno：1-4中任一所示的序列)調(diào)控的目的蛋白的表達(dá)中的用途。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如j.薩姆布魯克等編著，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第三版，科學(xué)出版社，2002中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。

1、實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒

菌株名稱：黑曲霉as3.975(cgmcc:3.795)；

質(zhì)粒：p3sr2，含乙酰胺酶(amds)基因(bccm/lmbp:accessionnumber：2363)，psp72。

2、培養(yǎng)基和溶液

菌絲培養(yǎng)基(1l)：胰蛋白胨20g，酵母抽提物10g，20％葡萄糖100ml，115℃，高壓滅菌15min。

再生培養(yǎng)基：0.1％磷酸氫二鉀、0.05％氯化鉀、0.05％硫酸鎂、0.001％硫酸亞鐵、1m蔗糖、1.5％瓊脂粉，115℃，高壓滅菌15min。待冷卻后加入終濃度15mm的乙酰胺和20mm的cscl。

pda-rhodamineb篩選培養(yǎng)基：

pda培養(yǎng)基：馬鈴薯(去皮)200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000ml，ph值自然。

橄欖油乳化液：以1:3體積比加入橄欖油與4％的聚乙烯醇(pva)溶液并混合，用高速勻漿機(jī)8000rpm勻漿15min，間歇5min后再攪拌3min。

pda培養(yǎng)基和橄欖油乳化液分別115℃，高壓滅菌15min；待冷卻至60℃左右，按9:1加入pda培養(yǎng)基和橄欖油乳化液，再加入1/100體積的過濾滅菌的0.1％rhodamineb溶液，混勻后立即倒平板。

黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基：2％葡萄糖，2％麥芽糖，1.5％硫酸銨，4％胰蛋白酶消化的大豆培養(yǎng)液，0.1％磷酸二氫鈉，0.1％硫酸鎂，0.07％tween80，微量元素，115℃，高壓滅菌15min(三角瓶為擋板三角瓶，裝液量50ml/250ml)。

孢子洗液：可用生理鹽水，0.9％nacl，0.05％吐溫80。

滲透壓穩(wěn)定劑：0.6mmgso4，10mmnah2po4，ph＝5.8。

酶解液：用滲透壓穩(wěn)定劑配制1％裂解酶，1％纖維素酶，0.1％蝸牛酶的酶解液，用0.22μm的微孔濾膜過濾除菌。

山梨醇溶液：1.0m山梨醇，100mmtris-hcl，ph＝7.0。

stc：1.0m山梨醇，50mmcacl2，50mmtris-hcl，ph＝7.5。

ptc：40％peg4000，50mmcacl2，50mmtris-hcl，ph＝7.5。

實(shí)施例1：檸檬酸鈉的誘導(dǎo)表達(dá)

在黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基中添加2％的檸檬酸鈉作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基，而未添加檸檬酸鈉的為未誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

用孢子洗液洗脫新鮮的黑曲霉3.795的孢子，通過mircloth過濾制備成孢子懸液，并調(diào)整至1×10⁷個/ml。

分別接種1ml黑曲霉孢子懸液至誘導(dǎo)和未誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，28℃，200rpm，發(fā)酵3天，收集菌絲，得到誘導(dǎo)組樣品和未誘導(dǎo)組樣品。

實(shí)施例2：rna的提取

按照rneasyminikitforpurificationoftotalanimalcells，animaltissues，bacteria，andyeast，andforrnacleanup(qiagen公司)產(chǎn)品說明書實(shí)驗(yàn)步驟提取誘導(dǎo)組樣品與未誘導(dǎo)組樣品的rna。

實(shí)施例3：轉(zhuǎn)錄組測序及分析

轉(zhuǎn)錄組測序采用美國illumina公司的第二代測序技術(shù)hiseq2000平臺，操作流程參考illumina官方指導(dǎo)手冊。提取的rna通過安捷倫2100質(zhì)檢合格后，使用隨機(jī)引物pd(n)6(含有6個堿基的隨機(jī)序列)對轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行擴(kuò)增，按照truseqrnakit使用說明構(gòu)建測序300-500bp的測序文庫(http://www.illumina.com/products/truseq_rna_sample_prep_kit_v2.html)。使用黑曲霉參考菌株(cbs513.88)作為參考基因組序列(ncbi索取號：am270980–am270998)，并利用比對和表達(dá)差異分析軟件(tophat2和cufflinks)對于目的菌株的表達(dá)差異進(jìn)行分析。根據(jù)差異表達(dá)分析結(jié)果，選擇表達(dá)差異倍數(shù)(foldchange)大于2倍，pvalue<0.05的基因作為候選基因進(jìn)行啟動子分析。下表1顯示通過分析獲得的4個候選基因。

表1

實(shí)施例4：啟動子表達(dá)載體的構(gòu)建

通過pcr技術(shù)分別擴(kuò)增獲得4個候選基因的啟動子序列，擴(kuò)增模板為黑曲霉as3.975基因組dna。

引物如下：

p881-f:5'ccgctcgagatcagcaatgccactcgatca3'(seqidno:5)

p881-r:5'cccaagcttgctgaaatgattgaatggctg3'(seqidno:6)

p2870-f:5'ccgctcgagatgcgcccatcaaccgtatgt3'(seqidno:7)

p2870-r:5'cccaagctttagagatagcagggaagcggt3'(seqidno:8)

p4032-f:5'ccgctcgaggatcatcctcctccgtctcga3'(seqidno:9)

p4032-r:5'cccaagcttgatggcagtttctcggctctc3'(seqidno:10)

p4772-f:5'ccgctcgagtactttgatggcggtgcagtc3'(seqidno:11)

p4772-r:5'cccaagcttattgacagagagtgcaggggc3'(seqidno:12)

pcr擴(kuò)增結(jié)果獲得的啟動子序列長度都約1.6kb大小，其序列分別如seqidno:1－4所示。擴(kuò)增時添加xhoi和hindiii酶切位點(diǎn)以便后續(xù)構(gòu)建使用。

用xhoi和hindiii酶切pcr擴(kuò)增獲得的啟動子序列并連接到同樣用xhoi和hindiii酶切的含有米黑根毛霉(rhizormucormiehei)脂肪酶(rml)基因和米曲霉糖化酶終止子的表達(dá)載體(ncbi序列號：fj868795.1)上。啟動子表達(dá)載體的構(gòu)建如圖1所示。

另外，以相同的構(gòu)建將淀粉酶啟動子(ptaka)和糖化酶啟動子(pglaa)插入表達(dá)框作為對照。

實(shí)施例5：黑曲霉的轉(zhuǎn)化

用孢子洗液洗脫新鮮的黑曲霉as3.795孢子，通過mircloth過濾制備成孢子懸液，并調(diào)整至1×10⁷個/ml。接種1ml孢子懸液至菌絲培養(yǎng)基中，28℃，180rpm，培養(yǎng)20-24小時，用滅菌mircloth過濾收集長出的菌絲。

收集的菌絲體用滅菌的滲透壓穩(wěn)定劑沖洗三次，壓干。菌絲轉(zhuǎn)移至100ml三角瓶中，每0.8g菌絲體重懸在20ml的酶解液中，30℃，60rpm，60-90min。酶解好的原生質(zhì)體混合液用mircloth過濾，收集濾液，4℃，1000g離心10min，用5ml預(yù)冷1.0mol/l山梨醇溶液重懸原生質(zhì)體沉淀，800g，4℃離心10min，棄上清。再用預(yù)冷的stc溶液將原生質(zhì)體調(diào)整至適宜濃度(1×10⁷個/ml)，冰浴待用。

向200μl原生質(zhì)體懸液中，加入20μldna，啟動子表達(dá)載體和篩選質(zhì)粒p3sr2各10μl(1μg/μl)，再添加50μlptc(peg，tris-hcl，cacl2溶液)溶液，混勻后冰浴30min。加入0.2mlptc溶液，混勻后再加入0.8mlptc溶液，混勻，室溫保持30min。

上述混合液中加入200μl再生培養(yǎng)基(上層，0.6％瓊脂糖)中，鋪于再生培養(yǎng)基(1.5％瓊脂糖)上，28℃，培養(yǎng)10天，待菌落長出，統(tǒng)計轉(zhuǎn)化子。

將在平板上長出的菌落，轉(zhuǎn)接至pda-rhodamineb篩選培養(yǎng)基上，28℃，培養(yǎng)3天最終選取在紫外下具有熒光的轉(zhuǎn)化子菌落。

將轉(zhuǎn)化子在pda-rhodamineb篩選培養(yǎng)基上再進(jìn)行單孢分離純化后，選取熒光最強(qiáng)的單菌落進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵試驗(yàn)。

實(shí)施例6：啟動子活性發(fā)酵檢測

用孢子洗液洗脫各啟動子的轉(zhuǎn)化子和對照轉(zhuǎn)化子的新鮮孢子，通過mircloth過濾制備成孢子懸液，并調(diào)整至1×10⁷個/ml。接種1ml孢子懸液到50ml濃度為2％的黑曲霉檸檬酸鈉發(fā)酵培養(yǎng)基中，對照用淀粉酶啟動子和糖化酶啟動子培養(yǎng)基中添加2％的淀粉(每個濃度做三個平行樣)，28℃，200rpm發(fā)酵培養(yǎng)96h后取樣。

各取1ml黑曲霉搖瓶發(fā)酵液到離心管中，12000rpm離心1min；取上清，根據(jù)酶活取0.5-5u脂肪酶水解活力的發(fā)酵液到總體積1ml的無菌水，作為酸堿滴定法檢測酶活的樣品。

脂肪酶水解活力酸堿滴定法測定：方法參考qb/t1803-1993工業(yè)酶制劑通用試驗(yàn)方法，稍作修改，將緩沖液換成0.2mmol/l的tris-hcl，ph8.0。

橄欖油底物溶液：量取4％pva溶液150ml，加橄欖油50ml，用高速勻漿機(jī)8000rpm勻漿15min，制備底物溶液(此溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用)。

具體步驟如圖2所示。

脂肪酶酶活力單位定義為：每分鐘催化底物釋放出1μmol脂肪酸的酶量為1個脂肪酶活力單位(u)。酶活計算公式：

樣品的酶活(u/ml)＝〔(v－v0)/t×n〕×m

式中：v：滴定樣液所消耗的naoh溶液體積(ml)；v0：滴定空白樣所消耗的naoh溶液體積(ml)；t：反應(yīng)時間(min)；n：酶液體積(ml)；m：滴定用的naoh溶液的濃度(mmol/l)。

在此不同的啟動子的活力表現(xiàn)是通過脂肪酶的酶活來體現(xiàn)的，具體酶活見圖3。

由圖可以得出p2870的啟動子活力比較理想，與曲霉中常用的淀粉酶啟動子和糖化酶啟動子相比，啟動子活力能提高大約1倍。

實(shí)施例7：啟動子誘導(dǎo)效果檢測

與實(shí)施例6中操作相同，將各啟動子的轉(zhuǎn)化子接種到有誘導(dǎo)物和沒有誘導(dǎo)物的發(fā)酵培養(yǎng)基中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。p881、p2870、p4032、p4772的誘導(dǎo)物為2％的檸檬酸鈉，ptaka和pglaa的誘導(dǎo)物為2％的淀粉。

發(fā)酵后進(jìn)行脂肪酶活力檢測，具體方法參考實(shí)施例6，啟動子誘導(dǎo)效果的結(jié)果見圖4。

由圖可以得出，p881、p2870、p4032、p4772均明顯能夠受檸檬酸鈉的誘導(dǎo)，且p881和p2870與對照相比，誘導(dǎo)效果更加嚴(yán)謹(jǐn)。