本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，具體涉及一種磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒，以及其高通量快速提取瓊脂糖凝膠dna的方法。
背景技術(shù)：
：在分子生物學實驗中，從電泳后瓊脂糖凝膠中回收、純化dna片段是最常用的技術(shù)之一，已經(jīng)有近40年的發(fā)展歷史。早期從瓊脂糖凝膠中回收dna的方法有低熔點瓊脂糖凝膠法、透析帶電洗脫法、deae纖維素膜紙片法等，這些方法都需要用到酚類、氯仿等有機試劑進行抽提，然后用乙醇沉淀，操作過程往往耗時較長，1份樣品花費的時間就需要近2個小時，此類方法當前已很少有人使用。后來，柱式法dna回收試劑盒的發(fā)展大大提高了dna回收工作的便利性。其主要原理為利用包埋有純化填料的純化柱對dna分子的吸附作用，將dna分子分離，再經(jīng)離心、洗滌、洗脫等步驟后實現(xiàn)對dna的回收工作，操作速度得到了大大提升。當前，柱式法回收dna應用廣泛，但也有其自身缺陷，比如柱式法不利于回收大片段dna，大片段dna容易被機械剪切力破壞，柱式法中頻繁的離心操作難以避免對大片段dna的破壞作用；另外，隨著基因測序產(chǎn)業(yè)的蓬勃發(fā)展，柱式法的操作速度又一次受到挑戰(zhàn)，雖然柱式法操作效率較早期的dna提取方法已經(jīng)有了大大提高，但依然需要在ep管中進行操作，柱子需要頻繁轉(zhuǎn)出和轉(zhuǎn)入ep管、以及操作過程中需配合大量的離心工作，導致操作時間隨之增加，針對一個或幾個樣品其操作效率可以接受，但針對大規(guī)模高通量dna提取工作依然不理想。當前，隨著基因測序領(lǐng)域的快速發(fā)展，單個項目需要處理的dna樣品數(shù)量就可以達到幾萬、幾十萬甚至上百萬個，柱式法dna提取方法已經(jīng)逐漸難以滿足日益龐大的樣品量對操作速度的迫切需求。近年來，因操作的便利性，磁珠法應用在瓊脂糖凝膠dna提取中越來越受到關(guān)注。其原理為磁珠表面修飾有特殊化學基團，在不同條件下可以對dna分子形成特異性吸附或者解吸附作用，再加上磁珠本身擁有順磁性，在外加磁場作用下可方便、快捷的實現(xiàn)磁珠與目標操作母液的分離。專利cn200910022810公開了一種金磁微粒用于純化回收瓊脂糖凝膠中dna的方法，方法提到將切膠后膠塊放入ep管中，加入液溶膠后，再依次加入peg8000和300~800ug金磁微粒進行dna吸附，再經(jīng)清洗和洗脫后獲得目標dna。該金磁微粒用于純化回收瓊脂糖凝膠中dna的方法操作簡便，其不足之處在于整個操作需在ep管中進行，當樣品量增多時，則純化耗時增長，實驗人員的工作量明顯增加，實驗過程中人為誤差也隨之增大。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一在于提供了一種磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒。該試劑盒可以從用tae或tbe制成的瓊脂糖凝膠中回收80bp及以上的dna片段，回收效率高達85%以上，并且所得dna產(chǎn)物純度優(yōu)良，可以直接應用于測序、連接、酶切、標記、pcr擴增等下游分子生物學實驗。本發(fā)明的目的之二在于提供了一種磁珠法瓊脂糖凝膠dna高通量快速提取的方法。配合96孔板、96孔板用磁板架、96位磁棒爪、渦旋混合器、真空干燥箱等常規(guī)設(shè)備快速完成。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒，包括：溶膠結(jié)合液、磁珠分散液、清洗液ⅰ、清洗液ⅱ和洗脫液；所述溶膠結(jié)合液由nai或異硫酸氰胍，與醋酸鈉或醋酸鉀組成，ph值為5.1；所述磁珠分散液的磁珠采用內(nèi)核為超順磁性四氧化三鐵，表面包覆有硅羥基，直徑為200~800nm；所述清洗液ⅰ包括tris-hcl、edta和異丙醇；所述清洗液ⅱ為乙醇溶液；所述洗脫液為tris堿或去離子水；所述溶膠結(jié)合液中nai或異硫酸氰胍的濃度為5~7mol/l，醋酸鈉或醋酸鉀的濃度為0.02~0.05mol/l。優(yōu)選的由6mol/l的nai或者異硫酸氰胍、0.03mol/l的醋酸鈉組成；所述磁珠分散液濃度為20~40μg/ul，溶劑為蒸餾水。優(yōu)選的濃度為20μg/ul，直徑為500~550nm；所述清洗液ⅰ中tris-hcl的濃度為30~100mmol/l的，edta的濃度為6~20mmol/l，異丙醇為45%~65%。優(yōu)選的由40mmol/l的tris-hcl、10mmol/l的edta和50%(v/v)的異丙醇組成；所述清洗液ⅱ，乙醇溶液的濃度為70%~80%(v/v)。優(yōu)選濃度為80%的乙醇溶液(v/v)；所述洗脫液，tris堿的濃度為0.9~1.1mm。優(yōu)選1.0mm的tris堿溶液，ph值為8.0。上述試劑盒高通量快速提取dna的方法，包括以下步驟：步驟一：在紫外燈下，將電泳后的瓊脂糖凝膠中的dna條帶切下，膠塊質(zhì)量小于400mg，將膠塊放入96孔板樣品孔中；步驟二：用多通道自動加液器向96孔板樣品孔中分別加入結(jié)合液，后將96孔板置于65℃水浴中溫熱至膠塊完全溶化；步驟三：取出96孔板，用多通道自動加液器，向96孔板中分別加入磁珠分散液，之后將96孔板置于渦旋混合儀上900rpm振蕩5分鐘后，將96孔板放置到96孔板用磁板架上靜置20秒，保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣棄去上清液，然后呈倒扣狀置于吸水紙上，徹底去除上清液；步驟四：將96孔板從磁板底座上取下，用多通道自動加液器向樣品孔中分別加入清洗液ⅰ，之后將96孔板置于渦旋混合儀上900rpm振蕩25秒，將96孔板重新放置于磁板架上靜置20秒，保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣棄去上清液，然后呈倒扣狀置于吸水紙上，徹底棄去上清液；用清洗液ⅱ重復以上清洗操作兩次；步驟五：將清洗完畢的96孔板連同磁板架一起置于45℃真空烘箱中真空干燥8分鐘，取出96孔板，用多通道自動加液器向樣品孔中分別加入洗脫液，將96孔板置于渦旋混合儀上900rpm振蕩1分鐘；步驟六：將96孔板從渦旋混合儀上取下，向96孔板中準確插入已經(jīng)裝入磁爪套的96位磁棒爪，靜置20秒，從96孔板中移出磁棒爪，棄磁珠，獲得目標dna產(chǎn)物于澄清洗脫液中。96孔板為市售2.2ml的標準96孔圓孔板或圓底方孔板；96孔板用磁板架、96位磁棒爪為配套96孔板使用的磁性分離裝置，對超順磁性納米材料通過外加磁場快速吸附聚集；渦旋混合器為市售96孔pcr板用高速渦旋混合器，渦旋速率大于1500轉(zhuǎn)/分。96孔板用磁板架，上面安裝有按照4x6排列的24根3mmx3mm的磁棒，磁棒高度為6~8mm，從背面插入到96孔板后，可在20秒內(nèi)將對樣品孔中磁珠實現(xiàn)磁場吸附聚集，所述96位磁棒爪，配合磁棒套插入到96孔板后，可在20秒內(nèi)對樣品孔中磁珠進行吸附，并將磁珠快速轉(zhuǎn)移出洗脫液。本申請創(chuàng)新性的配合96孔板、96孔板用磁板架、96位磁棒爪、渦旋混合器共同完成，使得從瓊脂糖凝膠中提取dna的工作可以直接在96孔板中進行，實驗過程中各緩沖試液的加液可以使用多通道自動加液器進行快速操作，一塊96孔板可進行96份樣品的dna提取工作，使用該試劑盒以及高通量方法，單個實驗人員同時操作6塊96孔板的情況下，僅需要約70~80min，即可完成576個樣品的dna提取工作。本發(fā)明的有益效果：（1）dna提取回收率高，可達85%以上。該方法基于磁珠法開發(fā)，磁珠表面修飾有可以對dna進行特異性吸附的化學基團，在高鹽、低ph值下可以實現(xiàn)快速吸附，在低鹽、高ph值下又可以快速解離，dna提取回收率高，可達85%以上。（2）操作簡潔。在配合96孔板用磁板架和96位磁棒爪的使用，使得從瓊脂糖凝膠提取dna的工作可以直接在96孔板中進行，不需要樣品的轉(zhuǎn)移，96孔板每個樣品孔可以進行一份dna樣品的提取實驗，一塊板可以同時進行96個dna樣品的提取操作，方便了電動移液槍的自動加液。（3）可以高通量、大規(guī)模提取，工作效率大幅提高。該試劑盒配合高通量操作方法，操作簡潔高效，單個實驗人員同時操作6塊96孔板的情況下，僅需要約70~80min，即可完成576個樣品的dna提取工作，且出錯率極地。（4）該方法所需實驗器材簡單，成本低，有明顯經(jīng)濟效果。對比使用當前應用最廣泛的柱式法進行576個dna樣品的提取實驗，或者配合甩板離心機等昂貴設(shè)備，依然需要大于4.5小時方可完成；或者使用柱式法，操作人員進行如此數(shù)量樣品量操作，需花費大量時間用于柱子轉(zhuǎn)入和轉(zhuǎn)出ep管的操作，工作將非常繁忙，容易產(chǎn)生誤差。因此，該發(fā)明提供的磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒及高通量快速提取方法，工作效率得到了大幅度提升，非常適合進行高通量實驗。附圖說明圖1是實施例1中從瓊脂糖凝膠中提取600bpdna產(chǎn)物的電泳膠圖（a1-a2：axygen柱式法對照；y1-y4：4份平行測試樣本）。圖2是實施例2中從瓊脂糖凝膠中高通量提取96份600bpdna產(chǎn)物的電泳膠圖。具體實施方式基于上述試劑盒中各溶液優(yōu)選的參數(shù)，結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：實施例1：磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒：磁珠法瓊脂糖凝膠dna提取試劑盒包括：溶膠結(jié)合液：ph值為5.2、6m的nai、和0.03m的醋酸鈉的混合溶液。具體配制方法：稱取90g碘化鈉和0.25g醋酸鈉，加入足夠蒸餾水進行充分溶解，繼續(xù)加入蒸餾水定容到100ml，用冰醋酸調(diào)節(jié)ph值至5.2。磁珠分散液：濃度為20μg/ul的磁珠混懸液，磁珠內(nèi)核為四氧化三鐵(fe3o4)，表面包覆了sio2層。具體配制方法：稱取2g磁珠，加入到100ml蒸餾水中，超聲分散均勻。清洗液?。?0mm的tris-hcl、10mm的edta和50%(v/v)的異丙醇水溶液。具體配制方法：稱取0.63gtris-hcl和0.29gedta，加入足夠50%(v/v)的異丙醇水溶液進行充分溶解，繼續(xù)加入50%(v/v)的異丙醇水溶液定容到100ml。清洗液ⅱ：80%(v/v)的乙醇溶液。洗脫液：1mm的tris堿水溶液，ph值為8.0。具體配制方法：稱取12mgtris堿，加入足夠蒸餾水進行充分溶解，繼續(xù)加入蒸餾水定容到100ml，用濃鹽酸調(diào)節(jié)ph值至8.0。600bpdna片段的瓊脂糖凝膠dna提取，并與axygen柱式法對比。步驟一：樣品準備取6ul濃度為50ng/ul的600bpdna片段，用1%的瓊脂糖凝膠在tae緩沖液中進行電泳，電泳完成后，在紫外燈下小心將目的dna條帶從瓊脂糖凝膠中切下，保持膠塊重量小于400mg，將膠塊分別放入干凈的96孔圓孔板中，平行4份樣品。步驟二：溶膠用移液器向4份樣品孔中分別加入500ul結(jié)合液，將96孔板置于65℃水浴中8分鐘至溶膠完全。步驟三：磁珠與dna結(jié)合將96孔板從水浴中取出，向4份樣品孔中分別加入50ul磁珠分散液。加畢將96孔板置于渦旋混合儀上，900rpm下振蕩5分鐘。取下96孔板，放到96孔板用磁板架上，靜置20秒。保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣96孔板棄去上清液，然后呈倒扣狀放置于吸水紙上片刻，徹底棄去上清液。步驟三：清洗將96孔板從磁板架上取下，向4份樣品孔中分別加入550ul清洗液ⅰ，900rpm下渦旋振蕩25秒，取下96孔板并裝入磁板底座靜置20秒。保持96孔板固定于磁板底座上直接倒扣96孔板棄上清液，然后呈倒扣狀置于吸水紙上，徹底棄去上清液。用清洗液ⅱ重復以上清洗操作兩次。步驟四：洗脫將棄去清洗液ⅱ后的96孔板連同磁板架一起置于45℃真空烘箱中干燥8分鐘，取出96孔板，用移液器向4份樣品孔中分別加入35ul洗脫液，900rpm渦旋震蕩1分鐘。步驟五：轉(zhuǎn)移獲得dna產(chǎn)物將96孔板重新裝回磁板底座上，靜置約20s，待磁珠完全吸附于96孔板側(cè)壁后，用移液器小心將洗脫液轉(zhuǎn)移至另一潔凈96孔板中得目的dna回收產(chǎn)物，棄去磁珠。實驗同時使用了axygen柱式法瓊脂糖膠dna回收試劑盒，對相同dna樣品進行了對照實驗。瓊脂糖凝膠電泳檢測：對所得4份dna回收產(chǎn)物，分別取2ul上樣，進行瓊脂糖凝膠電泳，膠圖（見圖1）顯示所獲得dna產(chǎn)物條帶清晰完整，平行性好，每份提取的dna條帶亮度與axygen柱式法結(jié)果相當。od值檢測：使用超微量紫外-可見光分光光度計對4份dna回收樣品進行了od值檢測（見表1）。檢測結(jié)果顯示使用本方法對瓊脂糖凝膠電泳后dna進行提取得到的dna產(chǎn)物含量高且純度良好。表1：實施例1中從瓊脂糖凝膠中提取600bpdna產(chǎn)物的od值檢測結(jié)果（a1、a2：axygen柱式法對照；y1-y4：4份平行測試樣本）樣品a260/230a260/280濃度(ng/ul)a10.241.827.59y10.361.777.42y20.421.887.67y30.451.837.78y40.271.777.69a20.201.877.75實施例2：對96份600bpdna片段電泳后的瓊脂糖凝膠高通量dna提取。使用實施例1所述試劑盒進行提取。步驟一：樣品準備分別取96份50ng/ulx6ul的600bpdna片段上樣，用1%的瓊脂糖凝膠在tae緩沖液中進行電泳，電泳完成后，在紫外燈下小心將目的dna條帶從瓊脂糖凝膠中切下，保持膠塊重量小于400mg，將膠塊分別放入干凈的96孔圓孔板中，共平行96份樣品。步驟二：溶膠用多通道自動加液器向96份樣品孔中分別加入500ul結(jié)合液。將96孔板置于65℃水浴中10分鐘。步驟三：磁珠與dna結(jié)合將96孔板從水浴中取出，用8道自動加液器向96份樣品孔中分別加入50ul磁珠分散液。加畢將96孔板置于渦旋混合儀上，900rpm下振蕩5分鐘。取下96孔板，放置到96孔板用磁板架上，靜置20秒。保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣96孔板棄去上清液，然后呈倒扣狀放置于吸水紙上片刻，徹底棄去上清液。步驟四：清洗將96孔板從磁板底座上取下，用8通道自動加液器分別向96份樣品孔中加入550ul清洗液ⅰ，900rpm下渦旋振蕩25秒，取下96孔板并放到磁板架上靜置20秒。保持96孔板固定于磁板架上，直接倒扣96孔板棄去上清液，然后呈倒扣狀放置于吸水紙上片刻，徹底棄去上清液。用清洗液ⅱ重復以上清洗操作兩次。步驟五：洗脫將棄去清洗液ⅱ后的96孔板連同磁板底座一起置于45℃真空烘箱中干燥9分鐘，取出96孔板，用8道電動加液器向96份樣品孔中分別加入35ul洗脫液，900rpm渦旋震蕩1分鐘。步驟六：轉(zhuǎn)移獲得dna產(chǎn)物將96孔板從渦旋混合儀上取下，向96孔板中準確插入已經(jīng)裝入磁爪套的96位磁棒爪，靜置20秒后，從96孔板中移出磁棒爪，棄磁珠，獲得目標dna產(chǎn)物于澄清洗脫液中。瓊脂糖凝膠電泳檢測：對所得96份dna回收產(chǎn)物及回收前樣品作為對照，分別取2ul上樣，進行瓊脂糖凝膠電泳，膠圖（見圖2）顯示所獲得dna產(chǎn)物條帶清晰完整，平行性好，回收率在90%左右。雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但實施例并不是用來限定本發(fā)明，任何熟悉此技藝者，在不脫離本發(fā)明之精神和范圍內(nèi)，自當可作各種變化或潤飾，但同樣在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此本發(fā)明的保護范圍應當以本申請的權(quán)利要求保護范圍所界定的為準。當前第1頁12