本發(fā)明屬于分子生物學領(lǐng)域，涉及一種分子標記，具體地，涉及一種與谷子生育期基因緊密連鎖的分子標記。本發(fā)明還涉及該分子標記的引物、該分子標記在谷子生育期基因定位或谷子遺傳育種中的用途、一種谷子生育期基因定位方法、以及一種谷子育種方法。
背景技術(shù)：
：谷子起源于中國，是傳統(tǒng)的優(yōu)勢作物、主食作物和抗旱耐瘠作物。谷子抗旱耐瘠、水份利用效率高、適應(yīng)性廣，不僅在目前旱作生態(tài)農(nóng)業(yè)中有重要作用，而且針對日益嚴重的水資源短缺，谷子還是重要的戰(zhàn)略儲備作物。谷子去殼后的小米營養(yǎng)豐富且各種成分平衡，是具有營養(yǎng)保健作用的糧食作物，對人體有重要作用的食用粗纖維是大米的5倍，是近年來興起的世界性雜糧熱的主要作物。同時谷子秸稈粗蛋白含量在8％左右，飼草谷子秸稈粗蛋白含量在15％以上，是禾本科中最優(yōu)質(zhì)的飼草，在畜牧業(yè)發(fā)展中有重要作用。因此，加速谷子育種進程尤為重要。由于谷子屬于小粟類作物，在遺傳理論研究方面落后于玉米、小麥、谷子等禾谷類作物。 如何應(yīng)用先進科學的研究手段指導谷子育種是一個嚴峻的問題。隨著分子生物學的發(fā)展，分子標記技術(shù)的出現(xiàn)，為谷子的遺傳研究及育種開辟了新的思路和方法。開發(fā)與重要性狀基因緊密連鎖的分子標記并進行分子標記輔助選擇育種，能顯著提高我國谷子育種水平。谷子生育期與品種及產(chǎn)量密切相關(guān)。但目前還沒有文獻報道谷子生育期相關(guān)基因的定位研究。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明人依據(jù)全基因組序列，經(jīng)過大量的實驗和不懈的努力，提供了一種與谷子(setariaitalical.beauv.)生育期基因緊密連鎖的分子標記svhd3，并由此提供了下述發(fā)明：本發(fā)明的一個方面涉及一種與谷子生育期基因緊密連鎖的分子標記svhd3，其核苷酸序列如seqidno：1所示。109bp：gctaaatcgcgagacgaatctattaagcctaattatttgacaatgtggtgctacagtgaacatatgttaatgatggattaattaggcttaatagattcgtctcgcgatt(seqidno：1)在本發(fā)明中，術(shù)語“與谷子生育期基因緊密連鎖的分子標記”是指這樣的分子標記，在遺傳連鎖圖譜中，該分子標記與谷子抗除草劑基因的遺傳連鎖距離小于2cm或者小于3cm。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標記的引物，其核苷酸序列如seqidno：2和seqidno：3所示：正向引物：cctttgctttcttgctcgct(seqidno：2)反向引物：cagcttggttcggcatcagc(seqidno：3)本發(fā)明的分子標記也可以為含有seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段；該dna片段的長度為適當長度，但并不特別限定，例如，小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標記(含有seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段)為谷子基因組中seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段，即所包含的seqidno：1的5’端和/或3’端以外的核苷酸序列也是谷子基因組中的序列，優(yōu)選地，為谷子基因組中seqidno：1的5’端和/或3’端的上下游序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，只要擴增或者檢測谷子基因組dna中的該分子標記，必然能夠在長生育期谷子中檢測或擴增得到含有seqidno：1所示的序列，或者在短生育期谷子中不能檢測或擴增得到含有seqidno：1所示的序列。seqidno：1的5’端和/或3’端的上下游序列的長度為適當長度，并不特別限定，例如，滿足分子標記的長度小于10,000bp、小于5,000bp、小于2,000bp、小于1,500bp、小于1,200bp、小于1,000bp、或者小于800bp。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述分子標記(含有seqidno：1所示核苷酸序列的dna片段)所包含的seqidno：1的5’端 和/或3’端可操作地連接有人工序列和/或控制序列，例如啟動子、增強子、終止子、酶切位點、引物序列等等。其中，術(shù)語“可操作地”在本發(fā)明中定義為一種如下構(gòu)象，在該構(gòu)象中，控制序列例如啟動子被適當?shù)刂糜趕eqidno：1的一個位置上，以致該控制序列指導seqidno：1編碼的多肽的產(chǎn)生。本發(fā)明的另一方面涉及一種重組載體，其含有本發(fā)明的分子標記。所述重組載體可以是插入有本發(fā)明的分子標記的表達載體或者克隆載體。本發(fā)明的還一方面涉及一種重組細胞，其含有該重組載體。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標記的制備方法，包括下述步驟：使用長生育期谷子的基因組dna作為模板，以上述引物進行pcr擴增，得到的擴增產(chǎn)物即含有所述分子標記；優(yōu)選地，還包括將pcr擴增產(chǎn)物進行純化的步驟。在本發(fā)明的一個實施方案中，所述長生育期谷子為wd-2(晚熟，長生育期，116天)。對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，可以理解，也可以dna化學合成的方法得到本發(fā)明的分子標記。本發(fā)明的還一方面涉及所述分子標記的檢測方法，包括下述步驟：(1)根據(jù)本發(fā)明的分子標記的核苷酸序列設(shè)計引物；(2)以被檢測谷子的基因組dna作為模板進行擴增；(3)判斷擴增產(chǎn)物中是否存在該分子標記。例如，可以以被檢測谷子的基因組dna為模板，以上述引物(seqidno：2和seqidno：3)進行pcr擴增，得到擴增產(chǎn)物?？梢詫⒌玫降臄U增產(chǎn)物進行測序或者凝膠電泳。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標記在谷子生育期基因定位或檢測中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及一種谷子生育期基因定位的方法，包括使用本發(fā)明的分子標記的步驟。本發(fā)明的還一方面涉及本發(fā)明的分子標記在谷子輔助育種中的用途。本發(fā)明的還一方面涉及一種谷子輔助育種方法，包括檢測本發(fā)明的分子標記的步驟。本發(fā)明的分子標記可用于今后的分子標記輔助育種中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，比如通過檢測是否存在本發(fā)明的分子標記來篩選長生育期或短生育期的谷子。所述檢測可以是pcr檢測的方法，具體地，可以使用上述的本發(fā)明的分子標記引物。所述檢測還可以通過測序方法進行。該谷子輔助育種方法具有簡便、快速、高通量的優(yōu)點。發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了與谷子生育期基因緊密連鎖的分子標記，并將谷子基因組dna與谷子生育期基因聯(lián)系起來，更有利于谷子分子標記輔助育種體系的建立；所述分子標記與生育期基因的遺傳緊 密連鎖距離為1cm。本發(fā)明的分子標記可以簡便、快速、高通量地應(yīng)用于谷子輔助育種。附圖說明圖1：分子標記引物(seqidno：2和seqidno：3)對215個重組自交系ril株系(f6代)單株擴增的部分結(jié)果。其中：泳道1－5為ril株系中長生育期單株的pcr擴增產(chǎn)物；泳道7－11為ril株系中短生育期單株的pcr擴增產(chǎn)物。泳道6為marker，其分子量包括：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、以及100bp。結(jié)果顯示：ril株系中長生育期單株擴增產(chǎn)物條帶為515bp，ril株系中短生育期單株擴增產(chǎn)物條帶為406bp。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器、材料未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實施例1：谷子ril群體的構(gòu)建父本：寧夏早谷，早熟(短生育期，104天)。母本：烏當2號(wd-2)，晚熟(長生育期，116天)。父本和母本雜交得到f1，f1代通過單粒傳法得到215個重組自交系ril株系(f6代)。寧 夏早谷和wd-2可以從深圳華大農(nóng)業(yè)與循環(huán)經(jīng)濟科技有限公司購得。實施例2：基因組dna的提取針對實施例1中獲得的谷子ril群體，用ctab法分別提取父母本及ril群體單株的基因組dna，具體方法如下：(1)稱取1.0g新鮮葉片，剪碎放入研缽，用液氮研磨后加入3ml1.5×ctab，研磨成勻漿轉(zhuǎn)入15ml的離心管中，然后往研缽中加入1ml1.5×ctab沖洗再轉(zhuǎn)入離心管中?；靹蚝笥?5℃水浴30min，期間不時緩慢搖勻。其中1.5×ctab配方如下(1l)：ctab15g1mol/l的tris.cl(ph為8.0)75ml0.5mol/l的edta30mlnacl61.4g加去離子水定容至1l，使用前加入終濃度為0.2％(2ml)的巰基乙醇。(2)待冷卻至室溫，加入等體積氯仿/異戊醇(24：1)，輕輕混勻，至下層液變?yōu)樯罹G色。(3)4200rpm離心10min，將上層水相移到新的15ml離心管，加2倍體積預冷的無水乙醇，混合靜止5min。于-20℃放置30min沉淀dna。(4)4200rpm離心10min，棄掉上清，加入1ml75％乙醇洗 滌沉淀1次，倒置離心管干燥dna，加入200μlte溶解dna。(5)用0.8％的瓊脂糖凝膠檢測基因組dna。(6)將得到的父母本及ril群體單株的基因組dna存于-20℃?zhèn)溆?。實施?：基因定位和分子標記開發(fā)(1)遺傳圖譜構(gòu)建針對實施例2中獲得的ril個體的基因組dna，基于rad-seq的基因分型技術(shù)(http://www.bioon.com.cn/server/show_product.asp？id＝12291)對ril群體的個體進行基因分型，獲得ril群體的基因型數(shù)據(jù)。用mapmaker3.0軟件(constructinggeneticmapswithmapmaker/exp3.0，slincoln,mdaly,elander-cambridge,ma:whiteheadinstitute,1992，通過參照將其全文并入本文)進行遺傳連鎖圖譜繪制，得到遺傳連鎖圖。(2)基因定位針對實施例1中獲得的ril群體，將ril群體的個體表型，與父本型性狀相似的記為a，與母本型性狀相似的記為b，性狀居于父本和母本之間的記為h。得到全部個體的表型數(shù)據(jù)，將個體的表型數(shù)據(jù)與之前得到的基因型數(shù)據(jù)進行比較，從而將谷子生育期基因定位在遺傳連鎖圖譜上。結(jié)果顯示，谷子生育期基因定位在2號染色體39053453bp至39098769bp區(qū)間內(nèi)，長度約為45316bp。(3)分子標記開發(fā)將父本和母本分別進行全基因組重測序(10x)，然后根據(jù)rad-seq的測序結(jié)果，利用soap軟件比對測序reads，然后用soapsv尋找父母本基因組片段差異較大的分子標記，便于用凝膠電泳區(qū)分鑒別。結(jié)果，選擇靠近谷子生育期基因所在區(qū)段的標記svhd3(seqidno：1所示的核酸序列)作為候選。svhd3的核苷酸序列如下(109bp)：gctaaatcgcgagacgaatctattaagcctaattatttgacaatgtggtgctacagtgaacatatgttaatgatggattaattaggcttaatagattcgtctcgcgatt(seqidno：1)。實施例4：分子標記的生育期相關(guān)性驗證對實施例3中確定的谷子生育期相關(guān)分子標記svhd3(seqidno：1所示的核酸序列)進行驗證，具體如下：針對上述分子標記設(shè)計引物，引物序列如下所示：正向引物：5’-cctttgctttcttgctcgct-3’(seqidno：2)；反向引物：5’-cagcttggttcggcatcagc-3’(seqidno：3)。利用上述引物，通過pcr擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測來驗證該標記的多態(tài)性和擴增穩(wěn)定性。具體地，以實施例2中提取的父本、母本、ril群體單株的基因組dna為模板，利用上述擴增引物進行pcr擴增，其中，pcr反應(yīng)體系如下：無菌水20.2μl10*buffer(含mg2+)2.5μldntps(25mm)0.15μltaq酶(5u/μl)0.15μl正向引物(10μm)0.5μl反向引物(10μm)0.5μl模板1.0μl總體積25μlpcr反應(yīng)程序如下：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸40秒，運行35個循環(huán)；最后72℃延伸3分鐘。pcr擴增產(chǎn)物經(jīng)純化后于4℃下保存。接著，將各pcr擴增產(chǎn)物取部分進行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果見圖1。如圖1所示，長生育期的單株均擴增出515bp的條帶，短生育期的單株均擴增出406bp的條帶。由此，證明該分子標記svhd3(seqidno：1所示的核酸序列)在父母本之間具有多態(tài)性，該分子標記與谷子生育期性狀緊密連鎖。然后，利用3730測序儀對各擴增產(chǎn)物進行測序，結(jié)果顯示，母本及ril群體中長生育期單株擴增產(chǎn)物為515bp，其序列如seqidno：4所示：cctttgctttcttgctcgctgtttgcaaacagccatgcgaggcagatgtgacag gcttggattggagaggaggctgctggtccagtccagtgtggtgtatgtaaaaagatctcacgagacaagatgagggctaaactttagtcctgtcttcggatactaattaggaggactaaatataagctaattacaaaactaattgtagaatccctaggctaaatcgcgagacgaatctattaagcctaattatttgacaatgtggtgctacagtgaacatatgttaatgatggattaattaggcttaatagattcgtctcgcgatttagcctaggggttgtgcaattagttttgtaattagactatgtttaatactcctaattagtgtccaaacattcgatgtgacgggggctaaaatttagccccctcctcccaaacaccctggaagaaacaaacgagtgtcgagtgtaggtgtgtgattgaaggaccaccctccagtctgctgatgccgaaccaagctg(seqidno：4)；上述下劃線序列即為本發(fā)明的分子標記seqidno：1。父本及ril群體中短生育期單株擴增產(chǎn)物為406bp，其序列如seqidno：5所示：cctttgctttcttgctcgctgtttgcaaacagccatgcgaggcagatgtgacaggcttggattggagaggaggctgctggtccagtccagtgtggtgtatgtaaaaagatctcacgagacaagatgagggctaaactttagtcctgtcttcggatactaattaggaggactaaatataagctaattacaaaactaattgtagaatccctagtagcctaggggttgtgcaattagttttgtaattagactatgtttaatactcctaattagtgtccaaacattcgatgtgacgggggctaaaatttagccccctcctcccaaacaccctggaagaaacaaacgagtgtcgagtgtaggtgtgtgattgaaggaccaccctccagtctgctgatgccgaaccaagctg(seqidno：5)母本及ril群體中長生育期單株與父本及ril群體中短生育期單株擴增條帶相比增加了一些序列，該序列即為分子標記svhd3 (seqidno：1所示的核酸序列)。此外，利用上述擴增引物(seqidno：2和seqidno：3)擴增含有該生育期位點的其它谷子群體或品種，長生育期的單株均擴增出515bp的條帶，短生育期的單株均擴增出406bp的條帶。由此證明該分子標記使用于含有該生育期位點的其它谷子群體或品種。盡管本發(fā)明的具體實施方式已經(jīng)得到詳細的描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解。根據(jù)已經(jīng)公開的所有教導，可以對那些細節(jié)進行各種修改和替換，這些改變均在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。本發(fā)明的全部范圍由所附權(quán)利要求及其任何等同物給出。當前第1頁12