本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種植物生物產(chǎn)量相關(guān)蛋白sod3及其編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人口的增加，糧食需求日益增長(zhǎng)，而耕地面積的減少對(duì)糧食生產(chǎn)的約束日益突出，糧食安全面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。植物的器官大小是重要的農(nóng)藝性狀，直接關(guān)系作物的產(chǎn)量。因此，研究植物體如何實(shí)現(xiàn)自身對(duì)器官大小的控制已經(jīng)成為提高作物產(chǎn)量的重要策略之一。

作為一類重要的泛素連接酶，由f-box蛋白參與組成的scf復(fù)合體高效降解生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵蛋白，廣泛參與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、光周期及器官發(fā)育等生物學(xué)過(guò)程，對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明一個(gè)目的是提供植物生物產(chǎn)量相關(guān)蛋白sod3及其編碼基因。

本發(fā)明提供的蛋白，命名為sod3，是如下1)或2)：

1)序列表中序列1所示的蛋白質(zhì)；

2)將序列表中序列1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列1衍生的蛋白質(zhì)。

上述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

編碼上述蛋白質(zhì)的dna分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述dna分子是如下1)-3)中任一種的dna分子：

1)編碼區(qū)為序列表中序列2所示的dna分子；

2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子；

3)與1)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子。

上述嚴(yán)格條件可為在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

含有上述dna分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

擴(kuò)增上述dna分子全長(zhǎng)或其任意片段的引物對(duì)也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物生物產(chǎn)量和/或器官大小中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述應(yīng)用中，

所述器官大小體現(xiàn)在葉片面積、花瓣面積、角果寬度和/或種子面積；

所述生物產(chǎn)量體現(xiàn)在百粒種子重量；

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述雙子葉植物具體為十字花科植物；所述十字花科植物具體為擬南芥。

上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育植物生物產(chǎn)量和/或器官大小中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

所述器官大小體現(xiàn)在葉片面積、花瓣面積、角果寬度和/或種子面積；

所述生物產(chǎn)量體現(xiàn)在百粒種子重量；

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述雙子葉植物具體為十字花科植物；所述十字花科植物具體為擬南芥。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種培育高生物產(chǎn)量和/或器官增大轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明提供的方法，為將編碼上述蛋白的dna分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的生物產(chǎn)量和/或器官大小均高于所述目的植物。

上述方法中，

所述器官大小體現(xiàn)在葉片面積、花瓣面積、角果寬度和/或種子面積；

所述生物產(chǎn)量體現(xiàn)在百粒種子重量；

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述雙子葉植物具體為十字花科植物；所述十字花科植物具體為擬南芥。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)一種新蛋白sod3及其編碼基因，將其導(dǎo)入野生型擬南芥中，得到轉(zhuǎn)基因植株，該轉(zhuǎn)基因植物的器官如葉片面積、花瓣面積、角果寬度、種子面積及其生物量(百粒種子重量)均高于野生型擬南芥，表明該蛋白sod3及其編碼基因可以增加植物器官大小并提高生物量，為作物遺傳改良奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，對(duì)于作物產(chǎn)量的提高具有重要意義。

附圖說(shuō)明

圖1為pcr鑒定轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的電泳圖；

其中，a，從左至右的泳道依次為野生型擬南芥對(duì)照、15個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和質(zhì)粒35s:sod3陽(yáng)性對(duì)照；b，從左至右的泳道依次為野生型擬南芥對(duì)照、15個(gè)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株和質(zhì)粒35s:sod3陽(yáng)性對(duì)照。

圖2為轉(zhuǎn)sod3擬南芥表達(dá)量的電泳圖；

其中，a為sod3基因的表達(dá)量，從左至右的泳道依次為野生型擬南芥對(duì)照和轉(zhuǎn)基因擬南芥，30個(gè)pcr循環(huán)；b為內(nèi)參actin7基因的表達(dá)量，從左至右的泳道依次為野生型擬南芥對(duì)照和轉(zhuǎn)基因擬南芥，25個(gè)pcr循環(huán)。

圖3為轉(zhuǎn)sod3擬南芥植株的表型及統(tǒng)計(jì)結(jié)果圖；

其中，ⅰ為野生型，ⅱ為轉(zhuǎn)基因株系，**代表p＜0.01水平差異顯著，a為擬南芥植株的葉片，b為主莖上的第5朵花，c為主莖上的第6個(gè)角果，d為主莖上第8個(gè)角果的種子，e為第5片真葉葉片面積統(tǒng)計(jì)的柱形圖，f為花瓣面積統(tǒng)計(jì)的柱形圖，g為角果寬度統(tǒng)計(jì)柱形圖，h為種子面積統(tǒng)計(jì)柱形圖，i為100粒種子重量統(tǒng)計(jì)柱形圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1、sod3蛋白及其編碼基因的獲得

1、sod3編碼基因的獲得

稱取200mg新鮮的野生型擬南芥(arabidopsisthaliana)(col-0，theeuropeanarabidopsisstockcentre，n1092)幼苗(萌發(fā)后10天)，在液氮中研磨成粉末，用植物總rna提取試劑盒(tiangen)提取總rna。提取完成后，用分光光度計(jì)檢測(cè)總rna的濃度。取5μg總rna，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(invitrogen)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到cdna。

以cdna為模板，用如下引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

sod3-f：atgtctacctcctcctcttctt

sod3-r：ctacagtgcaccgaaatcccatag

pcr反應(yīng)體系(50μl)：5μl10×kod-plusbuffer，5μl2mmdntp，2μl25mmmgso4，1.5μl10μm引物sod3-f和1.5μl10μm引物sod3-r，1μlkod-plus(toyobo)。

pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性30秒，56℃退火30秒，68℃延伸1.5分鐘，循環(huán)32次；68℃10分鐘。反應(yīng)完成后加入0.5μltaqdna聚合酶(takara)，72℃反應(yīng)30分鐘添加堿基a。

在1％的瓊脂糖凝膠中電泳上述pcr產(chǎn)物，pcr產(chǎn)物大小約1.4kb。

用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(tiangen)回收上述pcr產(chǎn)物，連入pcr8/gw/topota載體(invitrogen)中，得到sod3-topo載體。對(duì)該載體上連接的dna片段進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

測(cè)序結(jié)果表明，sod3-topo載體中的pcr產(chǎn)物具有序列表中序列2所示的核苷酸核苷酸序列，pcr產(chǎn)物所示的基因命名為sod3基因，開(kāi)放閱讀框?yàn)樾蛄?第1-1341 位核苷酸，該基因編碼序列表中序列1所示的蛋白，將該蛋白命名為sod3，序列1由446個(gè)氨基酸殘基組成。

實(shí)施例2、sod3蛋白及其編碼基因的應(yīng)用

一、重組載體35s:sod3的構(gòu)建

將實(shí)施例1制備的sod3-topo載體與目的載體pmdc43(invitrogen)進(jìn)行l(wèi)r反應(yīng)(invitrogen)，得到35s:sod3重組載體。

將重組載體35s:sod3進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，重組載體35s:sod3為將序列2所示的sod3基因與目的載體pmdc43發(fā)生lr重組反應(yīng)得到的載體。

二、轉(zhuǎn)sod3擬南芥的獲得

1、重組農(nóng)桿菌的獲得

用電擊儀micropulser(bio-rad)將重組載體35s:sod3轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌gv3101中，將菌液涂布于含有50μg/ml卡那霉素、40μg/ml慶大霉素和10μg/ml利福平y(tǒng)ep固體培養(yǎng)基平板上，獲得的陽(yáng)性克隆即為含有35s:sod3載體的根癌農(nóng)桿菌，命名為gv3101/35s:sod3。

yep固體培養(yǎng)基：酵母提取物(oxoid)10g/l，胰蛋白胨(oxoid)10g/l，nacl5g/l，其余為水，調(diào)ph值至7.0，添加15g/l瓊脂，制成yep固體培養(yǎng)基。

2、侵染液制備

挑取上述步驟1獲得的陽(yáng)性克隆gv3101/35s:sod3，用含有50μg/ml卡那霉素、40μg/ml慶大霉素和10μg/ml利福平的yep液體培養(yǎng)基28℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)，至od600為1.5-2.5。然后，14℃、4000轉(zhuǎn)離心10分鐘收集菌體，用轉(zhuǎn)化緩沖液重懸，得到侵染液。

轉(zhuǎn)化緩沖液：2.2g/lms(phytotechnology)，5％蔗糖，0.5g/lmes(amresco)，調(diào)ph至5.7，然后加入0.03％的silwetl-77(lehleseeds)。

3、花序侵染

選取生長(zhǎng)健壯的野生型擬南芥col-0植株，用滴管將侵染液滴到花序上，直至花序被完全浸潤(rùn)。豎直避光放置1天，之后置于光下正常培養(yǎng)，約1個(gè)月后收種，即為轉(zhuǎn)基因種子。

4、轉(zhuǎn)sod3擬南芥的獲得

將上述3得到的轉(zhuǎn)基因種子播種在潮霉素抗性篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天。將獲得的抗性轉(zhuǎn)基因植株移栽到培養(yǎng)介質(zhì)(按2：1體積混勻的蛭石和營(yíng)養(yǎng)土)中，16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，光照強(qiáng)度4000lux，溫度22℃，濕度60-80％進(jìn)行培養(yǎng)。共篩選到32個(gè)轉(zhuǎn)基因植株，標(biāo)記為t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥。

采用相同的方法將空載體pmdc43轉(zhuǎn)入野生型擬南芥中，得到12個(gè)t1代轉(zhuǎn)空載體 擬南芥。

上述潮霉素抗性篩選培養(yǎng)基組成：在1/2ms固體培養(yǎng)基(2.2g/lms，10％葡萄糖，0.5g/lmes，0.8％瓊脂，ph5.7)中加入30μg/ml的潮霉素。

5、轉(zhuǎn)sod3擬南芥的鑒定

以sod3id-f和sod3id-r為引物，分別以野生型擬南芥col-0、t1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥和t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥的葉片的基因組dna為模板，進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

sod3id-f：ctcccacaacgtatacatcatg

sod3id-r：tatcaggctcgtccacatca

pcr反應(yīng)體系(20μl)：2μldna，2μl10×pcrbuffer、2μl2.5mmdntp、1μl10mm引物sod3id-f和1μl10mm引物sod3id-r，0.3μl的taqdna聚合酶(takara)。

pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2分鐘；94℃變性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸45秒，循環(huán)40次；72℃10分鐘。

結(jié)果如圖1所示，30個(gè)t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥均可得到750bp左右的條帶，而野生型擬南芥無(wú)此條帶，說(shuō)明30個(gè)t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥植株全部為陽(yáng)性。t1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥與野生型擬南芥的結(jié)果一致。

6、轉(zhuǎn)sod3擬南芥的表達(dá)量分析

分別稱取萌發(fā)后10天的野生型col-0和t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥幼苗，按實(shí)施例1中的方法提取總rna并反轉(zhuǎn)錄得到cdna。

以cdna為模板，用如下引物分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

sod3rt-f：atgtctacctcctcctcttctt

sod3rt-r：tagatggtcggagcgagaga

actin7-f：atccttcctgatatcgac

actin7-r：gagaagatgactcagatc

在1％的瓊脂糖凝膠中電泳上述pcr產(chǎn)物。

結(jié)果如圖2所示，與野生型擬南芥相比，t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥中sod3基因的表達(dá)量顯著升高。

三、轉(zhuǎn)sod3擬南芥的表型分析

在相同且正常的條件下，種植野生型擬南芥(ⅰ)種子、t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥(ⅱ)種子和t1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥種子，分別統(tǒng)計(jì)12個(gè)單株的葉片、花瓣、角果和種子等指標(biāo)。

統(tǒng)計(jì)方法及結(jié)果如下：

1、葉片面積

播種40天后，測(cè)量第5片真葉的葉片面積，方法如下：從植株上取下第5片真葉，展平后拍照，用imagej軟件測(cè)量葉片的面積，并用excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

拍照結(jié)果如圖3a所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3e所示，可以看出，與野生型擬南芥相比，t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥的第5片真葉的葉片面積顯著增加。

野生型擬南芥和t1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。

2、花瓣面積

播種40天后，測(cè)量花瓣面積，方法如下：取主莖上開(kāi)放的第4至第6朵花，剝下花瓣，放在體式鏡(leicas8apo)下觀察并拍照(leicadfc420)，用imagej軟件測(cè)量花瓣的面積，并用excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

拍照結(jié)果如圖3b所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3f所示，可以看出，與野生型擬南芥相比，t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥花瓣面積顯著增加。

野生型擬南芥和t1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。

3、角果寬度

播種50天后，測(cè)量角果寬度，方法如下：取主莖上第4至第6個(gè)角果，放在體式鏡下觀察并拍照，用imagej軟件測(cè)量角果的寬度，并用excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

拍照結(jié)果如圖3c所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3g所示，可以看出，與野生型擬南芥相比，t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥的角果寬度顯著增加。

野生型擬南芥和t1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。

4、種子面積

播種70天后，測(cè)量種子的面積，方法如下：收獲主莖上第4至第10個(gè)角果的種子，室溫放置1個(gè)月后在體式鏡下拍照，用imagej軟件測(cè)量種子的面積，并用excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

拍照結(jié)果如圖3d所示，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3h所示，可以看出，與野生型擬南芥相比，t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥的的種子面積顯著增加。

野生型擬南芥和t1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。

5、種子重量

播種70天后，測(cè)量種子重量，方法如下：精確數(shù)出t1代植株100粒種子，在天平(mettlertoledoal104)上測(cè)量種子重量，共4次重復(fù)。

統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖3i所示，可以看出，與野生型擬南芥相比，t1代轉(zhuǎn)sod3擬南芥的百粒種子重量顯著增加。

野生型擬南芥和t1代轉(zhuǎn)空載體擬南芥結(jié)果無(wú)顯著差異。